Enriquecimento de Culturas de Neurônios de Gânglios da Raiz Dorsal de Camundongos Adultos por Immunopanning

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo de immunopanning para gânglios da raiz dorsal de camundongos adultos. Ao aderir anticorpos às placas de cultura, podemos selecionar e remover negativamente as células não neuronais. Mostramos que as culturas são enriquecidas para neurônios usando este protocolo, permitindo um estudo aprofundado das respostas neuronais à manipulação.

Resumo

Gânglios da raiz dorsal (DRGs) são estruturas periféricas adjacentes ao corno dorsal da medula espinhal, que abrigam os corpos celulares dos neurônios sensoriais, bem como vários outros tipos celulares. Os protocolos de cultura publicados frequentemente se referem a culturas de DRG dissociadas inteiras como sendo neuronais, apesar da presença de fibroblastos, células de Schwann, macrófagos e linfócitos. Embora essas culturas DRG inteiras sejam suficientes para aplicações de imagem onde os neurônios podem ser discernidos com base na morfologia ou coloração, homogeneizados de proteína ou RNA coletados dessas culturas não são primariamente de origem neuronal. Aqui, descrevemos uma sequência de immunopanning para DRGs de camundongos cultivados. O objetivo deste método é enriquecer culturas DRG para neurônios, removendo outros tipos celulares. Immunopanning refere-se a um método de remoção de tipos celulares por adesão de anticorpos a placas de cultura celular. Usando esses pratos, podemos selecionar negativamente e reduzir o número de fibroblastos, células imunes e células de Schwann em cultura. Este método nos permite aumentar a porcentagem de neurônios em culturas.

Introdução

Os gânglios da raiz dorsal (DRGs) abrigam os corpos celulares dos neurônios sensoriais que inervam os tecidos periféricos. O estudo desses neurônios nos permite entender os fundamentos mecanicistas da dor e das condições sensoriais. No entanto, os DRGs não são compostos apenas por neurônios, mas também contêm fibroblastos, células de Schwann, macrófagos e outras células imunes¹. Apesar da presença desses vários tipos celulares, culturas completas de DRG são frequentemente referidas na literatura como^neuronais2,3. Essas culturas ainda são úteis para investigação neuronal por imagem ou citometria de fluxo, o que permitiria a identificação neuronal por coloração, tamanho celular e/ou morfologia. Entretanto, para ensaios como a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou western blotting, em que as culturas são homogeneizadas para coleta de RNA ou proteína, a presença de tipos celulares não neuronais pode interferir nos resultados. Assim, há necessidade de aumentar a proporção de células neuronais em culturas DRG.

O immunopanning é uma técnica usada para purificar uma variedade de tipos celulares, incluindo neurônios corticais, astrócitos, células precursoras de oligodendrócitos e micróglia. Em palavras simples, trata-se da adesão de um anticorpo contra um marcador de superfície celular a uma placa de Petri, destinado a ligar determinadas células (Figura 1), e pode ser usado para selecionar a favor ou contra tipos celulares de interesse^4,5,6. DRGs embrionários de ratos imunopanning para selecionar contra células não neuronais foi descrito anteriormente por Zuchero⁷. No entanto, não conseguimos encontrar um protocolo de immunopanning específico para DRGs de camundongos. Neste protocolo, nos baseamos nos inquilinos básicos do protocolo Zuchero, mas adaptamos a sequência de immunopanning para enriquecer culturas DRG de camundongos adultos (Figura 2). Esta é uma ferramenta poderosa para estudar neurônios sensoriais estabelecidos em cultura. É vantajoso, pois permite o uso de camundongos adultos a partir de modelos genéticos, de doenças e lesões, para que seus neurônios sensoriais possam ser estudados com maior especificidade.

Este protocolo é vantajoso para leitores que procuram aumentar a proporção de neurônios em culturas DRG de camundongos adultos. No entanto, as etapas de immunopanning também podem ser omitidas, e esse protocolo também pode ser usado para culturas de DRG inteiras.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados com aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Ciências da Saúde da Universidade de Alberta (protocolo 0000274).

1. Preparação dos reagentes

1. Para o dia 1, preparar os seguintes reagentes: água grau de cultura celular; poli-D-lisina-preparar um estoque reconstituindo todo o frasco em 50 mL de água de grau de cultura para uma concentração de estoque de 100 μg/mL, armazenar a 4 °C e diluir o estoque 1:10 em água de grau de cultura até uma concentração final de 10 μg/mL; tris-HCl-preparar um estoque dissolvendo cloridrato de tris em pó em água de grau de cultura até uma concentração estoque de 500 mM (3,94 g em 50 mL), pH 9,5, esterilizar o filtro (0,22 μm), armazenar a 4 °C e diluir o estoque 1:10 em água de grau de cultura até uma concentração final de 50 mM; anticorpos secundários (cabra anti-rato, -coelho e -rato).
2. Para o dia 2, prepare os seguintes reagentes.
   1. Preparar cultura celular grau Ca 2+, Mg²⁺ livre de solução salina balanceada de Hank (HBSS; HBSS-/-), e solução salina tamponada com fosfato (PBS) grau de cultura celular com Ca 2+ e Mg²⁺. Preparar uma alíquota de estoque de laminina e armazenar a -80 °C imediatamente após o recebimento; diluir o estoque em HBSS-/- estéril até uma concentração final de 10 μg/mL para o estoque de trabalho.
   2. Preparar estoque de albumina de soro bovino (BSA) a 4% dissolvendo 400 mg de BSA em 7,5 mL de D-PBS (pH 7,4), trazer o volume para 10 mL, esterilizar com filtro (0,22 μm), alíquota e armazenar a -20 °C. Preparar BSA a 0,2% diluindo 750 μL de BSA a 4% em 14,25 mL de D-PBS.
   3. Preparar 0,4% de DNAse adicionando 1 mL de solução salina balanceada de Earle (EBSS) por 12.500 unidades de DNAse, esterilizar o filtro (0,22 μm), alíquota e armazenar a -20 °C. Preparar tampão panorâmico (BSA 0,02%) adicionando 3 mL de BSA a 0,2% e 100 μL de DNAse a 0,4% em 27 mL de D-PBS. Preparar anticorpos primários (CD45, PDGRFβ, O4).
      NOTA: Este protocolo utiliza um hibridoma de O4^8,9, no entanto^, 10 μg de um anticorpo de O4 comercialmente disponível também seria apropriado.
   4. Preparar o caldo de colagenase combinada dissolvendo um frasco de colagenase combinada (50 mg) em 5 mL de HBSS-/-, alíquota e armazenar a -20 °C. Preparar um caldo de trabalho por dois camundongos adicionando 500 μL de colagenase combinada aquecida e 50 μL de DNase 0,4% aquecida a 4,5 mL de HBSS-/-.
   5. Prepare ovomucoide baixo adicionando 3 g de BSA a 150 mL de D-PBS, em seguida, adicione 3 g de inibidor de tripsina e misture para dissolver. Ajustar o pH para 7,4 e elevar o volume até 200 mL com D-PBS. Filtrar esterilizar, preparar alíquotas de 1 mL e armazenar a -20 °C. No dia da dissecção, combinar 1 mL de ovomucoide baixo em 9 mL de D-PBS para a solução de trabalho.
   6. Preparar BSA a 15% dissolvendo 7,5 g de BSA em 50 ml de HBSS-/- (colocar num agitador para dissolver totalmente), esterilizar o filtro e conservar a 4 °C.
   7. Preparar 50 ml de meio neuronal adicionando 23,2 ml de DMEM, 23,2 ml de meio neurobasal, 500 μL de glutamax, 500 μL de piruvato de sódio, 500 μL de penicilina/estreptomicina (alíquota imediatamente à chegada e armazenar a -20 °C), 500 μL de insulina (5 μg/ml final), 500 μL de SATO, 50 μL de N-acetil-L-cisteína (NAC; 5 μg/ml final), e 1.000 μL de B27+ (alíquota imediata e armazenamento a -20 °C ao receber).
      1. Preparar o estoque de insulina dissolvendo em água grau de cultura até uma concentração de 0,5 mg/mL (50 mg em 100 mL), ajustar o pH para 7,4, esterilizar o filtro (0,22 μm), preparar alíquotas de 500 μL e armazenar a -20 °C.
      2. Preparar o estoque de SATO combinando 20 μL de progesterona (2,5 mg em 100 μL de etanol), 800 μL de selenito de sódio (4 mg em 10 mL de meio neurobasal + 10 μL de NaOH 1 N), 800 mg de BSA, 800 mg de transferrina, 128 mg de dicloridrato de putrescina e 80 mL de neurobasal. Filtrar esterilizar (0,22 μm), preparar alíquotas de 500 μL e armazenar a -20 °C. É essencial fazer soluções frescas de progesterona e selenito de sódio.
      3. Preparar 50 μL de N-acetil-L-cisteína (NAC) dissolvendo em meio neurobasal para uma concentração de estoque de 5 mg/mL (50 mg em 10 mL), esterilizar com filtro (0,22 μm), alíquota e armazenar a -20 °C.
3. Para os dias 4 e 5, prepare os seguintes reagentes.
   1. Preparar tampão fosfato 0,2 M (PB) dissolvendo 21,8 g de fosfato de sódio dibásico (Na 2 HPO4) e 8,34 g de fosfato de sódio monobásico di-hidratado (NaH₂PO₄) em 1.000 mL de água. Ajustar o pH para 7,4 e conservar à temperatura ambiente.
   2. Preparar paraformaldeído (PFA) a 8% da seguinte forma: num exaustor, aquecer 50 ml de água a 55 °C, desligar o lume e adicionar 8 g de prills de PFA, mexendo sempre. Adicionar 1 N de NaOH gota a gota até que a solução comece a clarear, em seguida, adicione 40 mL de 0,2 M PB e continue mexendo até ficar claro. Resfriar a solução à temperatura ambiente, ajustar o pH para 7,4 e elevar o volume até 100 mL com 0,2 M PB. Filtrar e conservar a 4 °C até 2 semanas.
   3. Preparar D-PBS + Triton X-100 (PBS_TX) adicionando 0,2% Triton X-100 em cultura grau D-PBS (1 mL de Triton + 500 mL de D-PBS). Conservar a 4 °C. Prepare a solução de bloqueio, que é 1% de soro de burro normal (NDS) em PBS_TX. _{Antecipadamente, 1 mL de NDS + 9 mL de PBSTX} podem ser preparados e armazenados a -20 °C em alíquotas de 10 mL.
   4. Preparar solução de anticorpos que é 0,2% NDS/0,2% BSA em PBS TX : 200 μL de NDS + 200 mg BSA + 9,6 mL de PBS_TX; pode ser preparado com antecedência e armazenado a -20 °C em alíquotas de 10 mL.

2. Configuração do equipamento

1. Montar os seguintes equipamentos: gabinete de biossegurança para cultura de células estéreis, conjunto de micropipetas, pipetas sorológicas e pistola de pipeta, placas de Petri de 10 cm, placas de cultura celular desejadas para plaqueamento (aqui, placas de fundo de vidro preto de 24 poços foram usadas para a obtenção de imagens), tubos cônicos de 15 mL e 50 mL, ferramentas de dissecção (a saber: tesoura fina de mola para laminectomia e corte de nervos, pinça fina, e lâmina de barbear), banho-maria regulado a 37 °C, filtro celular de 70 μm, centrífuga (10 min a 300 x g) com adaptadores para tubos cônicos de 15 mL, azul de tripano e hemocitômetro, exaustor e placa quente de agitação magnética.

3. Método experimental

1. Dia 1: preparo dos pratos
   1. Em um gabinete de biossegurança, revestir a superfície de cultura desejada com poli-D-lisina suficiente para cobrir o fundo do poço. Conservar durante a noite a 4 °C. Aqui, placas com fundo de vidro de 24 poços foram usadas para aquisição de imagens e, assim, 300 μL de poli-D-lisina foram usados.
   2. Em um armário de biossegurança, prepare os pratos panificados: para a placa CD45, adicione 10 mL de solução de tris-HCl de trabalho e 30 μL de IgG anti-rato de cabra a uma placa de Petri de 10 cm; para a placa PDGFRβ, adicionar 10 mL de solução de tris-HCl de trabalho e 30 μL de IgG de cabra anti-coelho a uma placa de Petri de 10 cm; para a placa de hibridoma de O4, adicionar 10 mL de solução de tris-HCl de trabalho e 30 μL de IgG anti-camundongo de cabra a uma placa de Petri de 10 cm. Certifique-se de que a solução cubra toda a área do prato e deixe a 4 °C durante a noite.
2. Dia 2: dissecção, trituração e immunopanning
   1. Aspirar a poli-D-lisina, lavar as placas três vezes com água de cultura de tecidos, abrir a tampa e deixar a superfície secar completamente em um armário de biossegurança. Aplicar laminina suficiente nas placas para revestir o fundo de cada poço e colocar numa incubadora a 37 °C. Para as placas de 24 poços, 200 μL são suficientes.
   2. Termine de preparar os pratos de panela. Lave cada prato com D-PBS e incube com 10 μg de anticorpo primário. Deixe descansar em temperatura ambiente por pelo menos 2 h.
   3. Para a placa CD45, adicionar 5 mL de BSA 0,2% e 20 μL de CD45 primário; para a placa PDGFRβ, adicionar 5 mL de BSA a 0,2% e 15,4 μL de PDGFRβ; para a placa de O4, adicionar 3 mL de BSA a 0,2%, 2 mL de hibridoma de O4 e mais 100 μL de BSA a 4% (para garantir que a concentração final de BSA permaneça em 0,2%).
   4. Eutanásia de um a quatro camundongos usando 0,1 mL/kg de pentobarbitol sódico (por placa imunopanorâmica de 10 cm). Foram utilizados camundongos C57BL/6 com 8-10 semanas de idade. Ambos os sexos foram usados e cultivados separadamente um do outro. Perfundir o animal com 30 mL de solução salina 0,9% gelada.
   5. Fixe as patas dianteiras e traseiras em um estágio de isopor e use uma lâmina de barbear limpa para expor a coluna vertebral pelas costas. Realizar uma laminectomia fazendo cortes na metade do caminho profundo em cada lado da coluna dorsal, removendo a metade dorsal da coluna, para expor a medula espinhal. Ou suavemente cortar os nervos e remover a medula espinhal, ou empurrar suavemente a medula para o lado, mantendo a integridade do nervo.
   6. Use as raízes nervosas espinhais (cortadas ou ligadas à medula espinhal) para encontrar e remover todos os DRGs de ambos os lados da coluna vertebral. Corte os restos nervosos de cada DRG à medida que é removido (mais debris nervosos na cultura podem levar a uma baixa sobrevivência da cultura). Coletar os DRGs em 15 mL de HBSS-/- em um tubo cônico de 15 mL sobre gelo.
      NOTA: Observe que o tecido é dissecado ao ar livre, mas uma vez que os DRGs são adicionados ao tubo eles devem ser tratados como estéreis e manipulados apenas em um gabinete de biossegurança.
   7. Coloque estoques congelados de temxyme 1 e 0,4% DNAse em banho-maria, aproximadamente 30 min antes do final das dissecções (aproximadamente ao iniciar o último mouse). Deixe-os assentar no fundo do tubo cônico e, em seguida, continue o protocolo em um gabinete de biossegurança.
   8. Aspirar a maior parte do HBSS-/- dos DRGs. Use uma pipeta em vez de sucção para obter <1 mL de líquido e deixe ~100 μL de líquido para não correr o risco de perder tecido.
   9. Lavar três vezes com 1 mL de HBSS-/-. Adicionar 5 ml de solução de temxima de trabalho ao tecido. Cubra a tampa com uma película transparente e flutue o tubo de lado em banho-maria regulado a 37 °C durante 1 h.
   10. Após a incubação na enzima, adicionar 1 mL de solução inibidora de ovo baixo ao tubo. Triture as células suavemente com uma pipeta p1000 10-15 vezes. Deixe os pedaços de tecido se acomodarem.
   11. Transfira os 2-3 mL superiores da solução (contendo células dissociadas) para a solução ovomucoide baixa e fresca. Repita até que o tecido esteja totalmente dissociado e não restem pedaços visíveis.
   12. Centrifugar durante 10 min a 300 x g à temperatura ambiente. Sifão do sobrenadante novamente, usando uma pipeta em vez de sucção para o último 1 mL, deixando ~100 μL, e ressuspenda o pellet de célula em 1 mL de tampão panorâmico.
   13. Pipetar suavemente para misturar. Pré-molhar um filtro celular de 70 μm com 1 mL de tampão panning sobre um tubo cônico de 50 mL. Filtre a solução celular através do filtro celular.
   14. Lave o tubo com 1 mL de tampão panning e, em seguida, passe pelo filtro (3 mL de filtrado). Colocar suavemente a suspensão celular em camadas (1 ml de cada vez) sobre 2 ml de uma almofada BSA a 15% para remover os detritos de mielina. Uma almofada de 2 mL é eficaz para dois camundongos, e 3 mL é eficaz para quatro camundongos.
       1. Para a colocação de camadas, coloque os 2 mL de BSA no tubo, feche e cubra suavemente as laterais do tubo com BSA. Em seguida, coloque suavemente a suspensão da célula de cima, pipetando contra o lado do tubo.
   15. Centrifugar à temperatura ambiente a 300 x g durante 10 min (aceleração e desaceleração lentas). Use uma pipeta P1000 para remover o líquido claro por cima, a fase de mielina entre elas, e a ASC, 1 mL de cada vez (trocando as pontas entre cada mL). Deixe ~100 μL de BSA para não perturbar o pellet.
   16. Adicionar 5 mL de tampão panorâmico e incubar o tubo em uma incubadora de 37 °C e 10% de CO₂ por 30-45 min. Isso permite a recuperação de antígenos. Certifique-se de soltar a tampa para permitir a troca gasosa.
   17. Lave a placa CD45 três vezes com D-PBS. Despeje o enxágue final. Decantar a suspensão celular para o prato CD45.
   18. Incubar as células na placa CD45 por um total de 20 min à temperatura ambiente, girando suavemente no ponto de 10 min para permitir que as células tenham acesso igual ao anticorpo.
   19. Enxágue a placa PDGFRβ três vezes com D-PBS e despeje o enxágue final. Transfira as células não ligadas da placa CD45 para a placa PDGFRβ.
   20. Agite suavemente o prato CD45 e apoie-o em um ângulo. Pipetar suavemente 1 mL da suspensão celular sobre a placa para coletar células não ligadas. Decantar na placa PDGFRβ e pipeta para transferir a suspensão celular restante para a placa PDGFRβ.
   21. Incubar a placa PDGFRβ por um total de 20 min à temperatura ambiente, girando suavemente no ponto de 10 min para permitir que as células tenham acesso igual ao anticorpo.
   22. Enxágue a placa de O4 três vezes com D-PBS e despeje o enxágue final. Transferir as células não ligadas da placa PDGFRβ para a placa de O4 utilizando o mesmo método da etapa 3.2.19. Incubar a placa de O4 por um total de 20 min à temperatura ambiente, girando suavemente no ponto de 10 min para permitir que as células tenham acesso igual ao anticorpo.
   23. Transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar por 10 min a 300 x g. Ressuspender as células no volume desejado e diluir 1:1 com azul de tripano para viabilidade celular. Conte células médias a grandes com um hemocitômetro (isso permitirá a melhor representação do número de neurônios na cultura).
   24. Retire a laminina e plaqueie as células na densidade desejada. Não deixe a placa secar entre a remoção da laminina e o plaqueamento, e adicione as células imediatamente.
   25. Cultivar as células quantificadas para enriquecimento neuronal (Figura 3) com 500 neurônios em 25 μL de meio de cultura (descrito em 1.2.7) por poço em placas de 24 poços e incubar a 37 °C por 30 min. Inundar os poços até um volume final de 500 μL.
3. Dia 4: fixação imunocitoquímica (ICC), bloqueio e primário
   1. Após 48 h de crescimento, adicionar 500 μL/poço (ou volume equivalente ao meio no poço) de PFA 8% por 15 min à temperatura ambiente para fixar as células. Se a análise de mídia é desejada, pode-se corrigir com 4% de PFA diretamente. No entanto, não testamos isso.
   2. Lave as células com D-PBS três vezes. Note-se que mantivemos essas células em cultura sem troca de mídia por no máximo 72 h, mas hipotetizamos que elas poderiam sobreviver por mais tempo, particularmente se o meio for trocado pela metade.
   3. Retire a lavagem final e adicione solução de bloqueio suficiente por poço para cobrir completamente as células. Bloqueie por 30 min à temperatura ambiente. Remover a solução de bloqueio e adicionar anticorpo primário na solução de anticorpos: β3-tubulina em uma diluição de 1:1.000. Selar a placa com filme transparente e incubar durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Pode-se considerar a coloração com PDGFRβ para a ausência de fibroblastos, CD45 para a ausência de células imunes, P0 ou PMP22 para a ausência de mielina, ou fabp7 para glia satélite.
4. Dia 5: ICC secundário
   1. Lave as células com D-PBS três vezes. Remover a lavagem final e adicionar anticorpos secundários em solução de anticorpos: anticoelho 488 em uma diluição de 1:500 e DAPI em uma diluição de 1:2.000. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente, protegido da luz.
   2. Lave com D-PBS três vezes. Adicione D-PBS suficiente para cobrir o fundo do poço e a imagem. A placa pode ser selada com filme transparente, protegida da luz e armazenada a 4 °C por até 2 semanas.

Resultados

As células fixas coradas com DAPI e β3-tubulina foram então imageadas com um sistema confocal de triagem de alto conteúdo. As imagens foram analisadas com software comercial adequado para determinar a porcentagem de células DAPI-positivas que co-marcaram com β3-tubulina (Figura 3). Culturas DRG inteiras foram determinadas como tendo coloração de 42,36% ± 6,4% de β3-tubulina, e culturas de DRG imunopanned foram determinadas como tendo coloração de 71,44% ±7,43% de β3-tubulina. I...

Discussão

Este protocolo de immunopanning aumenta a proporção de células neuronais em culturas primárias DRG. Para obter os melhores resultados, as dissecções devem ser feitas em tempo hábil, e os DRGs devem ser cortados do excesso de nervos. A etapa de dissociação deve ser cuidadosamente monitorada, e não deve exceder 1 h, para evitar que as células sofram estresse desnecessário. No que diz respeito especificamente ao immunopanning, cada placa deve ser girada suavemente no ponto médio para permitir que as células te...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 um Syringe filters	Fisher	723-2520
100 mm petri dishes	ThermoFisher	FB0875712
24 well black glass-bottom plates	Cellvis	P24-1.5H-N
70 um cell strainer	Cedarlane	15-1070-1(BI)
B27+ supplement	Gibco	A3582801
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906	for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%)
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A4161	for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%)
CD45 antibody	BD Pharmigen	550539
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM	Gibco	11960069
DNAse	Worthington	LS002007	for stemxyme solution and panning buffer
D-PBS	Sigma Aldrich	D8662
EBSS	Sigma Aldrich	E6267	for DNAse solution
Filter paper P8 grade	ThermoFisher	09-795K	for 8% PFA
Glutamax	ThermoFisher	35050061
goat-anti-mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-020	for O4 dish
goat-anti-rabbit 488	Invitrogen	A11008
goat-anti-rabbit IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-003	for PDGFRB dish
goat-anti-rat IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-044	for CD45 dish
HBSS -/-	Sigma Aldrich	14175145
Insulin	Sigma Aldrich	I2643
laminin	Invitrogen	23017-015
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A8199
Neurobasal	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
O4 antibody	n/a	n/a	Hybridoma
Ovomucoid trypsin inhibitor	Cedarlane	LS003086	for low ovo
paraformaldehyde prills	Sigma Aldrich	441244	for 8% PFA
PDGFRB antibody	Abcam	AB32570
penicillin/ streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich	P6407
Progesterone	Sigma Aldrich	P8783	for SATO
Putrescine dihydrochrloride	Sigma Aldrich	P5780	for SATO
Sodium phosphate dibasic	Fisher	S374-1	for 0.2 M PB
Sodium Phosphate monobasic dihydrate	Sigma Aldrich	04269	for 0.2 M PB
Sodium Pyruvate	ThermoFisher	11360070
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	for SATO
Stemxyme I	Cedarlane	LS004107	for tissue dissociation; combination collagenase
Transferrin	Sigma Aldrich	T1147	for SATO
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941
trypan blue	Gibco	15250-061
β3-Tubulin	Sigma-Aldrich	T2200