Обогащение культур нейронов ганглиев дорсальных корешков взрослых мышей методом иммунопаннирования

Резюме

В данной статье описывается протокол иммунопанирования для ганглиев дорсальных корешков взрослых мышей. Прикрепляя антитела к культуральным пластинам, мы можем отрицательно отбирать и удалять ненейрональные клетки. Мы показываем, что культуры обогащены для нейронов с использованием этого протокола, что позволяет углубленно изучить нейронные реакции на манипуляции.

Аннотация

Ганглии дорсальных корешков (DRG) представляют собой периферические структуры, прилегающие к дорсальному рогу спинного мозга, в которых находятся клеточные тела сенсорных нейронов, а также различных других типов клеток. Опубликованные протоколы культивирования часто ссылаются на целые диссоциированные культуры DRG как на нейроны, несмотря на наличие фибробластов, шванновских клеток, макрофагов и лимфоцитов. В то время как эти целые культуры DRG достаточны для приложений визуализации, где нейроны могут быть различимы на основе морфологии или окрашивания, гомогенаты белка или РНК, собранные из этих культур, не являются в первую очередь нейрональными по происхождению. Здесь мы описываем последовательность иммунопанирования для культивируемых DRG мышей. Целью этого метода является обогащение культур DRG для нейронов путем удаления других типов клеток. Иммунопаннирование относится к методу удаления типов клеток путем прилипания антител к чашкам для клеточных культур. Используя эти чашки, мы можем отрицательно отбирать и уменьшать количество фибробластов, иммунных клеток и шванновских клеток в культуре. Этот метод позволяет увеличить процент нейронов в культурах.

Введение

Ганглии дорсальных корешков (DRG) содержат клеточные тела сенсорных нейронов, которые иннервируют периферические ткани. Изучение этих нейронов позволяет нам понять механистические основы боли и сенсорных состояний. Однако DRG состоят не только из нейронов, но также содержат фибробласты, шванновские клетки, макрофаги и другие иммунные клетки¹. Несмотря на наличие этих различных типов клеток, целые культуры DRG часто упоминаются в литературе как нейрональные ^2,3. Эти культуры по-прежнему полезны для исследования нейронов с помощью визуализации или проточной цитометрии, что позволило бы идентифицировать нейроны путем окрашивания, размера клеток и / или морфологии. Однако для таких анализов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или вестерн-блоттинг, где культуры гомогенизируются для сбора РНК или белка, присутствие ненейрональных типов клеток может повлиять на результаты. Следовательно, необходимо увеличить долю нейрональных клеток в культурах DRG.

Иммунопаннирование — это метод, используемый для очистки различных типов клеток, включая корковые нейроны, астроциты, клетки-предшественники олигодендроцитов и микроглию. Проще говоря, он включает в себя прилипание антитела против маркера клеточной поверхности к чашке Петри, предназначенного для связывания определенных клеток (рис. 1), и его можно использовать для выбора либо за, либо против интересующих типов клеток 4,5,6. Иммунопанирование эмбриональных DRG крыс для отбора против ненейрональных клеток было описано ранее Zuchero⁷. Тем не менее, нам не удалось найти протокол иммунопанирования, специфичный для DRG мышей. В этом протоколе мы опираемся на основные арендаторы протокола Zuchero, но вместо этого адаптировали последовательность иммунопаннирования для обогащения культур DRG взрослых мышей (рис. 2). Это мощный инструмент для изучения установленных сенсорных нейронов в культуре. Это выгодно, поскольку позволяет использовать взрослых мышей из генетических моделей, моделей болезней и травм, так что их сенсорные нейроны могут быть изучены с большей специфичностью.

Этот протокол полезен для читателей, желающих увеличить долю нейронов в культурах DRG взрослых мышей. Тем не менее, этапы иммунопанирования также могут быть опущены, и этот протокол также может быть использован для целых культур DRG.

протокол

Все эксперименты на животных проводились с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию Университета Альберты (протокол 0000274).

1. Приготовление реагентов

1. На 1-й день приготовьте следующие реагенты: воду для клеточных культур; поли-D-лизин - приготовить бульон, восстановив всю бутылку в 50 мл культуральной воды до исходной концентрации 100 мкг/мл, хранить при 4 °C и разбавляя бульон 1:10 в культуральной воде до конечной концентрации 10 мкг/мл; трис-HCl - приготовить бульон, растворив порошкообразный трис гидрохлорид в воде культурального качества до исходной концентрации 500 мМ (3,94 г в 50 мл), рН 9,5, стерилизовать фильтром (0,22 мкм), хранить при 4 °C и разбавить бульон 1:10 в воде культурального качества до конечной концентрации 50 мМ; вторичные антитела (козья антикрыса, -кролик и -мышь).
2. На 2 день приготовьте следующие реактивы.
   1. Приготовьте сбалансированный раствор соли Хэнка без клеточных культур Ca 2+, Mg²⁺ (HBSS; HBSS-/-) и буферный физиологический раствор D-фосфата (PBS) для клеточных культур с Ca 2+ и Mg²⁺. Приготовьте аликвоту из ламинина и храните при температуре -80 °C сразу после получения; разбавить сырье в стерильном HBSS-/- до конечной концентрации 10 мкг/мл для рабочего сырья.
   2. Приготовьте 4% бычий сывороточный альбумин (BSA), растворив 400 мг BSA в 7,5 мл D-PBS (pH 7,4), доведите объем до 10 мл, стерилизуйте фильтром (0,22 мкм), аликвоту и храните при -20 °C. Приготовьте 0,2% BSA, разбавив 750 мкл 4% BSA в 14,25 мл D-PBS.
   3. Приготовьте 0,4% запас ДНК, добавив 1 мл сбалансированного солевого раствора Эрла (EBSS) на 12 500 единиц ДНК, стерилизуйте фильтром (0,22 мкм), аликвоту и храните при -20 ° C. Приготовьте буфер для панирования (0,02% BSA), добавив 3 мл 0,2% BSA и 100 мкл 0,4% ДНК в 27 мл D-PBS. Подготовьте первичные антитела (CD45, PDGRFβ, O4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется гибридома O4^8,9, однако 10 мкг коммерчески доступного антитела O4 также были бы уместны.
   4. Приготовьте бульон комбинированной коллагеназы, растворив флакон с комбинированной коллагеназой (50 мг) в 5 мл HBSS-/-, аликвоты, и храните при -20 ° C. Приготовьте рабочий запас на двух мышей, добавив 500 мкл подогретой комбинированной коллагеназы и 50 мкл подогретой 0,4% ДНКазы к 4,5 мл HBSS-/-.
   5. Приготовьте низкий овомукоид, добавив 3 г BSA к 150 мл D-PBS, затем добавьте 3 г ингибитора трипсина и перемешайте до растворения. Отрегулируйте рН до 7,4 и доведите объем до 200 мл с помощью D-PBS. Фильтруют, стерилизуют, готовят аликвоты объемом 1 мл и хранят при температуре -20 °C. В день вскрытия смешайте 1 мл низкого овомукоида с 9 мл D-PBS для рабочего раствора.
   6. Приготовьте 15% BSA, растворив 7,5 г BSA в 50 мл HBSS-/- (поместите на шейкер для полного растворения), фильтруйте, стерилизуйте и храните при температуре 4 ° C.
   7. Приготовьте 50 мл нейронной среды, добавив 23,2 мл DMEM, 23,2 мл нейробазальной среды, 500 мкл глутамакса, 500 мкл пирувата натрия, 500 мкл пенициллина/стрептомицина (аликвота сразу по прибытии и храните при -20 °C), 500 мкл инсулина (5 мкг/мл в конечном итоге), 500 мкл SATO, 50 мкл N-ацетил-L-цистеина (NAC; 5 мкг/мл в конечном итоге), и 1,000 мкл B27+ (немедленно аликвотировать и хранить при -20 ° C после получения).
      1. Приготовьте запас инсулина, растворив в воде культурального качества до концентрации 0,5 мг / мл (50 мг в 100 мл), отрегулируйте pH до 7,4, стерилизуйте фильтром (0,22 мкм), приготовьте аликвоты 500 мкл и храните при -20 ° C.
      2. Приготовьте запас SATO, объединив 20 мкл прогестерона (2,5 мг в 100 мкл этанола), 800 мкл селенита натрия (4 мг в 10 мл нейробазальной среды + 10 мкл 1 N NaOH), 800 мг BSA, 800 мг трансферрина, 128 мг дигидрохлорида путресцина и 80 мл нейробазала. Фильтр стерилизуют (0,22 мкм), готовят аликвоты 500 мкл и хранят при температуре -20 °C. Очень важно делать свежие растворы прогестерона и селенита натрия.
      3. Приготовьте 50 мкл сырья N-ацетил-L-цистеина (NAC), растворив в нейробазальной среде до исходной концентрации 5 мг/мл (50 мг в 10 мл), стерилизуют фильтром (0,22 мкм), аликвотой и хранят при -20 °C.
3. На 4 и 5 день приготовьте следующие реактивы.
   1. Приготовьте 0,2 М фосфатный буфер (PB), растворив 21,8 г двухосновного фосфата натрия (_Na2HPO 4) и 8,34 г одноосновного дигидрата фосфата натрия (₂PO₄) в 1,000 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,4 и храните при комнатной температуре.
   2. Приготовьте 8% параформальдегид (ПФА) следующим образом: в вытяжном шкафу нагрейте 50 мл воды до 55 °C, выключите огонь и добавьте 8 г гранул PFA, постоянно помешивая. Добавляйте 1 N NaOH по каплям, пока раствор не начнет очищаться, затем добавьте 40 мл 0,2 М PB и продолжайте помешивать до тех пор, пока он не станет прозрачным. Охладите раствор до комнатной температуры, отрегулируйте рН до 7,4 и доведите объем до 100 мл с 0,2 М ПБ. Отфильтровать и хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
   3. Приготовьте D-PBS + Triton X-100 (PBS_TX), добавив 0,2% Triton X-100 в культуральный сорт D-PBS (1 мл Triton + 500 мл D-PBS). Хранить при температуре 4 °C. Приготовьте блокирующий раствор, который представляет собой 1% нормальную ослиную сыворотку (NDS) в PBS_TX. _{Заранее 1 мл NDS + 9 мл PBSTX} можно приготовить и хранить при -20 ° C в 10 мл аликвот.
   4. Приготовьте раствор антител, который составляет 0,2% NDS / 0,2% BSA в PBS TX: 200 мкл NDS + 200 мг BSA + 9,6 мл PBS_TX; может быть приготовлен заранее и храниться при -20 ° C в аликвотах по 10 мл.

2. Настройка оборудования

1. Установить следующее оборудование: шкаф биобезопасности стерильных клеточных культур, набор микропипеток, серологические пипетки и пипетки, чашки Петри 10 см, чашки для клеточных культур для покрытия (здесь для визуализации использовались 24-луночные пластины с черным стеклянным дном), конические трубки объемом 15 мл и 50 мл, инструменты для вскрытия (а именно: тонкие пружинные ножницы для ламинэктомии и обрезки нервов, тонкие щипцы, и лезвие бритвы), водяная баня с температурой 37 °C, ситечко для ячеек 70 мкм, центрифуга (10 мин при 300 x g) с адаптерами для конических пробирок объемом 15 мл, трипановый синий и гемоцитометр, вытяжной шкаф и конфорка с магнитным перемешиванием.

3. Экспериментальный метод

1. День 1: приготовление блюд
   1. В шкафу биобезопасности покройте желаемую поверхность культуры достаточным количеством поли-D-лизина, чтобы покрыть дно скважины. Хранить в течение ночи при температуре 4 °C. Здесь для визуализации использовались 24-луночные пластины со стеклянным дном, и, таким образом, использовалось 300 мкл поли-D-лизина.
   2. В шкафу биобезопасности подготовьте посуду для промывки: для чашки CD45 добавьте 10 мл рабочего раствора трис-HCl и 30 мкл козьего антикрысиного IgG в 10-сантиметровую чашку Петри; для чашки PDGFRβ добавьте 10 мл рабочего раствора трис-HCl и 30 мкл козьего антикроличьего IgG в 10-сантиметровую чашку Петри; для чашки гибридомы O4 добавьте 10 мл рабочего раствора трис-HCl и 30 мкл козьего антимышиного IgG в 10-сантиметровую чашку Петри. Убедитесь, что раствор покрывает всю площадь посуды, и оставьте на ночь при температуре 4 °C.
2. День 2: вскрытие, растирание и иммунопанирование
   1. Аспирируйте поли-D-лизин, трижды промойте пластины водой для культивирования тканей, откройте крышку и дайте поверхности полностью высохнуть в шкафу биобезопасности. Нанесите достаточное количество ламинина на пластины, чтобы покрыть дно каждой лунки, и поместите в инкубатор при температуре 37 ° C. Для 24-луночных планшетов достаточно 200 мкл.
   2. Завершите приготовление посуды для сковороды. Вымойте каждую посуду D-PBS и инкубируйте с 10 мкг первичного антитела. Оставьте при комнатной температуре не менее 2 часов.
   3. Для чашки CD45 добавьте 5 мл 0,2% BSA и 20 мкл первичного CD45; для чашки PDGFRβ добавьте 5 мл 0,2% BSA и 15,4 мкл PDGFRβ; для чашки O4 добавьте 3 мл 0,2% BSA, 2 мл гибридомы O4 и дополнительные 100 мкл 4% BSA (чтобы конечная концентрация BSA оставалась на уровне 0,2%).
   4. Усыпьте от одной до четырех мышей, используя 0,1 мл / кг пентобарбитола натрия (на 10-сантиметровую иммунопанорамную чашку). Мы использовали мышей C57BL / 6 в возрасте 8-10 недель. Оба пола использовались и культивировались отдельно друг от друга. Перфузируют животное 30 мл холодного 0,9% физиологического раствора.
   5. Прижмите переднюю и заднюю лапы к стадии пенополистирола и используйте чистое лезвие бритвы, чтобы обнажить позвоночник сзади. Выполните ламинэктомию, сделав разрезы примерно на полпути по обе стороны от дорсального позвоночника, удалив дорсальную половину столба, чтобы обнажить спинной мозг. Либо аккуратно перережьте нервы и удалите спинной мозг, либо аккуратно отодвиньте спинной мозг в сторону, сохраняя целостность нерва.
   6. Используйте корешки спинномозговых нервов (либо разорванные, либо прикрепленные к спинному мозгу), чтобы найти и удалить все DRG с обеих сторон позвоночника. Обрежьте нервный мусор с каждого DRG по мере его удаления (большее количество нервного мусора в культуре может привести к плохой выживаемости культуры). Соберите DRG в 15 мл HBSS-/- в коническую пробирку объемом 15 мл на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что ткань препарируется на открытом воздухе, но после добавления DRG в пробирку их следует рассматривать как стерильные и манипулировать ими только в шкафу биобезопасности.
   7. Поместите замороженные запасы stemxyme 1 и 0,4% ДНКазы на водяную баню примерно за 30 минут до окончания вскрытия (примерно при запуске последней мыши). Дайте им осесть на дно конической трубки, затем продолжите протокол в шкафу биобезопасности.
   8. Аспирируйте большую часть HBSS-/- из DRG. Используйте пипетку, а не всасывание, чтобы получить <1 мл жидкости, и оставьте ~ 100 мкл жидкости, чтобы не рисковать потерей ткани.
   9. Промыть три раза 1 мл HBSS-/-. Добавьте в ткань 5 мл рабочего раствора stemxyme. Накройте крышку прозрачной пленкой и положите трубку на бок на водяной бане, установленной на 37 °C, в течение 1 часа.
   10. После инкубации в ферменте добавьте в пробирку 1 мл раствора ингибитора с низким содержанием ово. Аккуратно тритуируйте клетки пипеткой p1000 10-15 раз. Дайте кусочкам ткани осесть.
   11. Переведите верхние 2-3 мл раствора (содержащего диссоциированные клетки) в свежий низкоовомукоидный раствор. Повторяйте до тех пор, пока ткань полностью не диссоциирует и не останется видимых кусков.
   12. Центрифуга в течение 10 мин при 300 x g при комнатной температуре. Снова откачайте надосадочную жидкость, используя пипетку, а не всасывание в течение последнего 1 мл, оставляя ~ 100 мкл, и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл буфера для промывки.
   13. Аккуратно перемешайте пипеткой. Предварительно смочите сетчатое фильтр для клеток размером 70 мкм с 1 мл буфера для панорамирования над конической трубкой объемом 50 мл. Отфильтруйте клеточный раствор через клеточный фильтр.
   14. Промойте пробирку 1 мл буфера для промывки, затем пропустите через сетчатый фильтр (3 мл фильтрата). Аккуратно нанесите клеточную суспензию (по 1 мл за раз) поверх 2 мл 15% подушки BSA, чтобы удалить остатки миелина. Подушка объемом 2 мл эффективна для двух мышей, а 3 мл эффективна для четырех мышей.
       1. Для наслоения поместите 2 мл BSA в пробирку, закройте и аккуратно покройте стенки пробирки BSA. Затем аккуратно наложите суспензию на ячейку сверху, пипеткой прижавшись к стенке трубки.
   15. Центрифуга при комнатной температуре при 300 x g в течение 10 мин (медленное ускорение и замедление). Используйте пипетку P1000, чтобы удалить прозрачную жидкость сверху, миелиновую фазу между ними и BSA, по 1 мл за раз (меняя кончики между каждым мл). Оставьте ~100 мкл BSA, чтобы не потревожить гранулы.
   16. Добавьте 5 мл буфера для промывки и инкубируйте пробирку в инкубаторе 37 °C, 10% CO₂ в течение 30-45 минут. Это позволяет извлекать антигены. Обязательно ослабьте крышку, чтобы обеспечить газообмен.
   17. Трижды вымойте посуду CD45 с помощью D-PBS. Слейте последнее полоскание. Сцедите клеточную суспензию в чашку CD45.
   18. Инкубируйте клетки на чашке CD45 в течение 20 минут при комнатной температуре, осторожно поворачивая в течение 10 минут, чтобы обеспечить клеткам равный доступ к антителам.
   19. Трижды промойте посуду PDGFRβ с помощью D-PBS и слейте последнее полоскание. Перенесите несвязанные клетки из чашки CD45 в чашку PDGFRβ.
   20. Осторожно встряхните тарелку CD45 и подперите ее под углом. Аккуратно нанесите 1 мл клеточной суспензии на чашку, чтобы собрать несвязанные клетки. Сцедите его в чашку PDGFRβ и пипетку, чтобы перенести оставшуюся клеточную суспензию на пластину PDGFRβ.
   21. Инкубируйте планшет PDGFRβ в течение 20 минут при комнатной температуре, осторожно поворачивая в точке 10 минут, чтобы обеспечить клеткам равный доступ к антителу.
   22. Трижды промойте посуду O4 с помощью D-PBS и слейте последнее полоскание. Перенесите несвязанные ячейки из чашки PDGFRβ в чашку O4, используя тот же метод, что и на шаге 3.2.19. Инкубируйте пластину O4 в течение 20 минут при комнатной температуре, осторожно взбалтывая в течение 10 минут, чтобы обеспечить клеткам равный доступ к антителу.
   23. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугу в течение 10 мин при 300 x g. Ресуспендируйте клетки в желаемом объеме и разбавьте 1:1 трипановым синим для жизнеспособности клеток. Подсчитайте средние и крупные клетки с помощью гемоцитометра (это позволит наилучшим образом представить количество нейронов в культуре).
   24. Удалите ламинин и наклейте клетки на нужную плотность. Не допускайте высыхания пластины между удалением ламинина и нанесением покрытия и немедленно добавляйте ячейки.
   25. Культивируют количественные клетки для обогащения нейронов (рис. 3) с 500 нейронами в 25 мкл питательной среды (описано в 1.2.7) на лунку в 24-луночных планшетах и инкубируют при 37 ° C в течение 30 мин. Затопите скважины до конечного объема 500 мкл.
3. День 4: иммуноцитохимия (ИКК) фиксация, блокирование и первичная
   1. После 48 ч роста добавьте 500 мкл / лунку (или объем, эквивалентный среде в лунке) 8% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы зафиксировать клетки. Если требуется анализ СМИ, можно напрямую использовать 4% PFA. Однако мы этого не проверяли.
   2. Промойте клетки D-PBS три раза. Обратите внимание, что мы хранили эти клетки в культуре без смены среды в течение максимум 72 часов, но предполагаем, что они могут выживать дольше, особенно если среда наполовину изменена.
   3. Удалите окончательную промывку и добавьте достаточное количество блокирующего раствора на лунку, чтобы полностью покрыть ячейки. Блокировать на 30 мин при комнатной температуре. Удалите блокирующий раствор и добавьте первичное антитело в раствор антитела: β3-тубулин в разведении 1:1,000. Запечатайте пластину прозрачной пленкой и выдержите в течение ночи при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно рассмотреть возможность окрашивания PDGFRβ при отсутствии фибробластов, CD45 при отсутствии иммунных клеток, P0 или PMP22 при отсутствии миелина или fabp7 при сателлитной глии.
4. День 5: Вторичная школа ICC
   1. Промойте клетки D-PBS три раза. Удалите окончательную промывку и добавьте вторичные антитела в раствор антител: анти-кролик 488 в разведении 1:500 и DAPI в разведении 1:2,000. Выдерживать 30 мин при комнатной температуре, в защищенном от света месте.
   2. Стирайте с помощью D-PBS три раза. Добавьте достаточное количество D-PBS, чтобы покрыть дно колодца, и изображение. Пластину можно запечатать прозрачной пленкой, защитить от света и хранить при температуре 4 °C до 2 недель.

Результаты

Фиксированные клетки, окрашенные DAPI и β3-тубулином, затем визуализировали с помощью конфокальной скрининговой системы с высоким содержанием. Изображения были проанализированы с использованием подходящего коммерческого программного обеспечения для определения процента DAPI-положител...

Обсуждение

Этот протокол иммунопанирования увеличивает долю нейрональных клеток в первичных культурах DRG. Для достижения наилучшего результата следует своевременно проводить вскрытия, а ДРГ очищать от лишних нервов. Стадия диссоциации должна тщательно контролироваться и не должна превышать 1 ч...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 um Syringe filters	Fisher	723-2520
100 mm petri dishes	ThermoFisher	FB0875712
24 well black glass-bottom plates	Cellvis	P24-1.5H-N
70 um cell strainer	Cedarlane	15-1070-1(BI)
B27+ supplement	Gibco	A3582801
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906	for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%)
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A4161	for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%)
CD45 antibody	BD Pharmigen	550539
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM	Gibco	11960069
DNAse	Worthington	LS002007	for stemxyme solution and panning buffer
D-PBS	Sigma Aldrich	D8662
EBSS	Sigma Aldrich	E6267	for DNAse solution
Filter paper P8 grade	ThermoFisher	09-795K	for 8% PFA
Glutamax	ThermoFisher	35050061
goat-anti-mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-020	for O4 dish
goat-anti-rabbit 488	Invitrogen	A11008
goat-anti-rabbit IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-003	for PDGFRB dish
goat-anti-rat IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-044	for CD45 dish
HBSS -/-	Sigma Aldrich	14175145
Insulin	Sigma Aldrich	I2643
laminin	Invitrogen	23017-015
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A8199
Neurobasal	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
O4 antibody	n/a	n/a	Hybridoma
Ovomucoid trypsin inhibitor	Cedarlane	LS003086	for low ovo
paraformaldehyde prills	Sigma Aldrich	441244	for 8% PFA
PDGFRB antibody	Abcam	AB32570
penicillin/ streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich	P6407
Progesterone	Sigma Aldrich	P8783	for SATO
Putrescine dihydrochrloride	Sigma Aldrich	P5780	for SATO
Sodium phosphate dibasic	Fisher	S374-1	for 0.2 M PB
Sodium Phosphate monobasic dihydrate	Sigma Aldrich	04269	for 0.2 M PB
Sodium Pyruvate	ThermoFisher	11360070
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	for SATO
Stemxyme I	Cedarlane	LS004107	for tissue dissociation; combination collagenase
Transferrin	Sigma Aldrich	T1147	for SATO
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941
trypan blue	Gibco	15250-061
β3-Tubulin	Sigma-Aldrich	T2200