Yetişkin Fare Dorsal Kök Ganglia Nöron Kültürlerinin İmmünupanjör ile Zenginleştirilmesi

Özet

Bu yazıda yetişkin fare dorsal kök gangliyonları için bir immünopanning protokolü açıklanmaktadır. Antikorları kültür plakalarına yapıştırarak, nöronal olmayan hücreleri negatif olarak seçebilir ve çıkarabiliriz. Kültürlerin bu protokolü kullanarak nöronlar için zenginleştirildiğini ve manipülasyona karşı nöronal tepkilerin derinlemesine incelenmesine izin verdiğini gösteriyoruz.

Özet

Dorsal kök gangliyonları (DRG'ler), omuriliğin dorsal boynuzuna bitişik periferik yapılardır ve duyusal nöronların hücre gövdelerini ve diğer çeşitli hücre tiplerini barındırır. Yayınlanmış kültür protokolleri genellikle fibroblastların, Schwann hücrelerinin, makrofajların ve lenfositlerin varlığına rağmen, tüm ayrışmış DRG kültürlerini nöronal olarak adlandırır. Tüm bu DRG kültürleri, nöronların morfolojiye veya boyamaya dayalı olarak ayırt edilebildiği görüntüleme uygulamaları için yeterli olsa da, bu kültürlerden toplanan protein veya RNA homojenatları öncelikle nöronal kökenli değildir. Burada, kültürlü fare DRG'leri için bir immünopanning dizisi tarif ediyoruz. Bu yöntemin amacı, diğer hücre tiplerini çıkararak nöronlar için DRG kültürlerini zenginleştirmektir. İmmünupanjin, hücre kültürü kaplarına antikorlar yapıştırarak hücre tiplerini uzaklaştırma yöntemini ifade eder. Bu yemekleri kullanarak, kültürdeki fibroblastların, bağışıklık hücrelerinin ve Schwann hücrelerinin sayısını olumsuz olarak seçebilir ve azaltabiliriz. Bu yöntem, kültürlerdeki nöronların yüzdesini arttırmamızı sağlar.

Giriş

Dorsal kök gangliyonları (DRG'ler), periferik dokuları innerve eden duyusal nöronların hücre gövdelerini barındırır. Bu nöronları incelemek, ağrı ve duyusal koşulların mekanik temellerini anlamamızı sağlar. Bununla birlikte, DRG'ler tek başına nöronlardan oluşmaz, aynı zamanda fibroblastlar, Schwann hücreleri, makrofajlar ve diğer bağışıklık hücrelerini de içerir¹. Bu çeşitli hücre tiplerinin varlığına rağmen, tüm DRG kültürleri literatürde sıklıkla nöronal ^2,3 olarak adlandırılır. Bu kültürler, boyama, hücre boyutu ve / veya morfoloji ile nöronal tanımlamaya izin verecek görüntüleme ve....

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Alberta Üniversitesi Sağlık Bilimleri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (protokol 0000274) onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. Reaktif hazırlama

1. 1. gün için, aşağıdaki reaktifleri hazırlayın: hücre kültürü sınıfı su; poli-D-lizin-tüm şişeyi 50 mL kültür sınıfı suda 100 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden yapılandırarak bir stok hazırlayın, 4 ° C'de saklayın ve stok 1:10'u kültür sınıfı suda 10 μg / mL'lik son bir konsantrasyona seyreltin; tris-HCl-toz haline getirilmiş tris hidroklorürü kültür sınıfı suda 500 mM (50 mL'de 3.94 g), pH 9.5 stok konsantrasyonuna eriterek, filtre s....

Sonuçlar

DAPI ve β3-tübülin ile boyanan sabit hücreler daha sonra konfokal yüksek içerikli bir tarama sistemi ile görüntülendi. Görüntüler, β3-tübülin ile birlikte etiketlenen DAPI-pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için uygun ticari yazılım kullanılarak analiz edildi (Şekil 3). Tüm DRG kültürlerinde %42.36 ± %6.4 β3-tübülin boyama, immünopanlanmış DRG kültürlerinde ise %71.44 ±%7.43 β3-tübülin boyama olduğu belirlendi. Bu, immünopanning ile nöronal zengi.......

Tartışmalar

Bu immünopanning protokolü, DRG primer kültürlerinde nöronal hücrelerin oranını arttırır. En iyi sonuç için, diseksiyonlar zamanında yapılmalı ve DRG'ler fazla sinirlerden kesilmelidir. Ayrışma adımı, hücrelerin gereksiz stresten korunmasını önlemek için dikkatlice izlenmeli ve 1 saati geçmemelidir. Özellikle immünopanning ile ilgili olarak, hücrelerin kaplanmış antikorlara erişmesine izin vermek için her plaka yarı yolda yavaşça döndürülmelidir. Plakalar, nöronal olmayan hücreleri.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 um Syringe filters	Fisher	723-2520
100 mm petri dishes	ThermoFisher	FB0875712
24 well black glass-bottom plates	Cellvis	P24-1.5H-N
70 um cell strainer	Cedarlane	15-1070-1(BI)
B27+ supplement	Gibco	A3582801
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A7906	for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%)
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A4161	for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%)
CD45 antibody	BD Pharmigen	550539
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM	Gibco	11960069
DNAse	Worthington	LS002007	for stemxyme solution and panning buffer
D-PBS	Sigma Aldrich	D8662
EBSS	Sigma Aldrich	E6267	for DNAse solution
Filter paper P8 grade	ThermoFisher	09-795K	for 8% PFA
Glutamax	ThermoFisher	35050061
goat-anti-mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-020	for O4 dish
goat-anti-rabbit 488	Invitrogen	A11008
goat-anti-rabbit IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-003	for PDGFRB dish
goat-anti-rat IgG	Jackson Immunoresearch	115-005-044	for CD45 dish
HBSS -/-	Sigma Aldrich	14175145
Insulin	Sigma Aldrich	I2643
laminin	Invitrogen	23017-015
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A8199
Neurobasal	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
O4 antibody	n/a	n/a	Hybridoma
Ovomucoid trypsin inhibitor	Cedarlane	LS003086	for low ovo
paraformaldehyde prills	Sigma Aldrich	441244	for 8% PFA
PDGFRB antibody	Abcam	AB32570
penicillin/ streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich	P6407
Progesterone	Sigma Aldrich	P8783	for SATO
Putrescine dihydrochrloride	Sigma Aldrich	P5780	for SATO
Sodium phosphate dibasic	Fisher	S374-1	for 0.2 M PB
Sodium Phosphate monobasic dihydrate	Sigma Aldrich	04269	for 0.2 M PB
Sodium Pyruvate	ThermoFisher	11360070
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	for SATO
Stemxyme I	Cedarlane	LS004107	for tissue dissociation; combination collagenase
Transferrin	Sigma Aldrich	T1147	for SATO
Tris-HCl	Millipore Sigma	T5941
trypan blue	Gibco	15250-061
β3-Tubulin	Sigma-Aldrich	T2200