מעקב סף חשמלי בלולאה סגורה בקוד פתוח בזמן אמת לחקר כאב תרגומי

Summary

APTrack הוא תוסף תוכנה שפותח עבור פלטפורמת Open Ephys המאפשר הדמיית נתונים בזמן אמת ומעקב סף חשמלי בלולאה סגורה אחר פוטנציאלי פעולה עצביים. השתמשנו בזה בהצלחה במיקרונוירוגרפיה עבור nociceptors סיבי C אנושיים ועכבר C-fiber ו Aδ-fiber nociceptors.

Abstract

Nociceptors הם קבוצה של נוירונים afferent ראשוני המאותתים על גירויים מזיקים פוטנציאליים. עלייה ברגישות nociceptor מתרחשת במצבי כאב חריפים וכרוניים. זה מייצר פעילות מתמשכת חריגה או ספי הפעלה מופחתים לגירויים מזיקים. זיהוי הגורם לרגישות מוגברת זו נדרש לפיתוח ותיקוף של טיפולים מבוססי מנגנון. מעקב סף חשמלי של נוירון יחיד יכול לכמת את ההתרגשות של nociceptor. לכן, פיתחנו אפליקציה המאפשרת מדידות כאלה ומדגימה את השימוש בה בבני אדם ובמכרסמים. APTrack מספק תצוגה חזותית של נתונים בזמן אמת וזיהוי פוטנציאל פעולה באמצעות התוויית רסטר זמנית. אלגוריתמים מזהים פוטנציאלי פעולה על ידי חציית סף ומנטרים את זמן ההשהיה שלהם לאחר גירוי חשמלי. לאחר מכן התוסף מווסת את משרעת הגירוי החשמלי באמצעות שיטה מעלה-מטה כדי להעריך את הסף החשמלי של הנוציצפטורים. התוכנה נבנתה על מערכת Open Ephys (V0.54) וקודדה בשפת C++ באמצעות מסגרת JUCE. הוא פועל על מערכות ההפעלה Windows, Linux ו- Mac. הקוד הפתוח זמין (https://github.com/ Microneurography/APTrack). הרישומים האלקטרופיזיולוגיים נלקחו מנוציצפטורים הן בתכשיר עור-עצב של עכבר בשיטת הסיבים המתגרים בעצב הספנוס והן במתנדבים אנושיים בריאים המשתמשים במיקרונוירוגרפיה בעצב הפרוניאלי השטחי. Nociceptors סווגו על ידי התגובה שלהם לגירויים תרמיים ומכניים, כמו גם על ידי ניטור האטה תלוית פעילות של מהירות ההולכה. התוכנה הקלה על הניסוי על ידי פישוט זיהוי פוטנציאל הפעולה באמצעות עלילת הרסטר הזמני. אנו מדגימים מעקב סף חשמלי בלולאה סגורה בזמן אמת אחר פוטנציאלי פעולה של נוירון יחיד במהלך מיקרו-נוירוגרפיה אנושית in vivo, בפעם הראשונה, ובמהלך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של עכברי ex vivo של סיבי C וסיבי Aδ. אנו מבססים הוכחה עקרונית על ידי כך שאנו מראים כי הסף החשמלי של נציצפטור סיבי C הרגיש לחום אנושי מופחת על ידי חימום שדה הקלט. תוסף זה מאפשר מעקב סף חשמלי של פוטנציאלי פעולה של נוירון יחיד ומאפשר לכמת שינויים בעוררות nociceptor.

Introduction

Nociceptors הם נוירונים afferent ראשוני במערכת העצבים ההיקפית המופעלים על ידי אירועים גלויים או פוטנציאליים מזיקים לרקמות וממלאים תפקיד מגן קריטי בכאב חריף¹. רישומים אלקטרופיזיולוגיים של Nociceptors סיבי C ו- Aδ-fiber במודלים של בעלי חיים, מתנדבים אנושיים בריאים וחולים חשפו רגישות ופעילות ספונטנית חריגה במגוון רחב של מצבי כאב 2,3,4,5,6,7. הבנת המנגנונים העומדים בבסיס שינויים אלה ברגישות nociceptor בחולים יכולה לאפשר התערבויות טיפוליות ממוקדות⁸. עם זאת, ישנם מעט כלים להעריך את רגישות nociceptor ישירות, במיוחד בחולים⁹, אבל הפוטנציאל עבור התועלת של כלים כאלה מוכר היטב^10,11.

ניתן להשתמש במעקב אחר סף חשמלי של עצב שלם כדי לבחון עוררות אקסונלית בבני אדם¹². עם זאת, מכיוון שנוירונים היקפיים גדולים, מיאליניים, תורמים באופן לא פרופורציונלי למשרעת פוטנציאל הפעולה של התרכובת התחושית, מעקב אחר סף חשמלי של עצב שלם אינו מאפשר הערכה של תפקוד סיבי C^11,13. ואכן, במחקר קודם, מעקב אחר סף חשמלי של עצב שלם בקבוצות כאב נוירופתיות כרוניות עם נוירופתיה סוכרתית ופולינוירופתיה הנגרמת על ידי כימותרפיה לא הראה הבדלים בעוררות אקסונלית¹¹.

במחקר קודם, מעקב סף חשמלי ברמת נוירון יחיד שימש לבחינת ההתרגשות של nociceptors סיבי C במהלך רישומי סיבים מתגרים בהכנה עצבית עור של חולדה ex vivo ¹⁴. המחברים הראו כי ריכוז אשלגן מוגבר, תנאים חומציים וברדיקינין הגבירו את ההתרגשות של nociceptor סיבי C, כפי שמשתקף על ידי סף חשמלי מופחת ליצירת פוטנציאל פעולה. יתר על כן, חימום שדה הקלט של הנוציצפטורים הרגישים לחום הפחית את הסף החשמלי שלהם, בעוד שנוציצפטורים רגישים לחום הציגו עלייה בסף החשמלי שלהם¹⁴. זה מספק הוכחה חשובה לכך שמעקב אחר סף חשמלי של נוירון יחיד אפשרי ויכול להיות שימושי, אך אין כיום פתרונות תוכנה ו / או חומרה זמינים המאפשרים חקירות כאלה, במיוחד עבור מחקרים בבני אדם.

בבני אדם, מיקרונוירוגרפיה היא השיטה היחידה הזמינה להעריך ישירות את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של סיבי C¹⁵. גישה זו שימשה כדי להדגים תפקוד לקוי של nociceptor בחולים עם כאב כרוני 2,3,4,5,6,7. מיקרונוירוגרפיה יכולה לזהות פוטנציאלי פעולה של נוירון יחיד; עם זאת, בשל יחסי האות לרעש הנמוכים, החוקרים משתמשים בטכניקת הסימון כדי לאפיין את פעילות סיבי C¹⁶. בטכניקת הסימון, גירוי חשמלי suprathreshold מוחל על שדות קלט סיבי C בעור. גירוי חשמלי זה יוצר פוטנציאל פעולה המתרחש בהשהיה קבועה, הנקבעת על ידי מהירות ההולכה של סיב C. סיבי C מפגינים האטה תלוית פעילות, שבה מהירות ההולכה שלהם פוחתת, ולכן חביון ההולכה שלהם עולה בתקופות של פריקה פוטנציאלית¹⁷. בתנאים בסיסיים, סיבי C אינם מייצרים בדרך כלל פוטנציאלי פעולה בהיעדר גירויים מזיקים, ולכן חביון ההולכה שלהם בתגובה לגירוי חשמלי בתדר נמוך הוא קבוע. גירויים מכניים, תרמיים או פרמקולוגיים, המעוררים ירי, גורמים להאטה תלוית פעילות, אשר מגדילה את ההשהיה של פוטנציאלי הפעולה המתעוררים על ידי גירוי חשמלי בתדר נמוך במקביל. זה מאפשר זיהוי אובייקטיבי של תגובות לגירויים הלא חשמליים המופעלים בהקשר של יחס אות לרעש נמוך. לכן, ניתן להשתמש בהאטה תלוית פעילות כדי לאפיין תפקודית סיבי C¹⁶. ואכן, סוגים פונקציונליים שונים של סיבי C מציגים דפוסים ייחודיים של האטה תלוית פעילות בפרדיגמות גירוי חשמלי הכוללות שינוי בתדירות הגירוי^18,19. שונות זו בהשהיה של פוטנציאלי הפעולה של סיבי C מציבה אתגר לאלגוריתמים המתוכננים לנטר אותם.

פעילות מתמשכת בנוציצפטור מובילה לשונות מוגברת בהשהיה שלו במהלך גירוי חשמלי בתדר נמוך, וזאת שוב בשל האטה תלוית פעילות. שונות מוגברת זו, או ריצוד, היא מדד פרוקסי הניתן לכימות של רגישות². גורמים נוספים לשונות בחביון פוטנציאל הפעולה כוללים כפכף-כפכף, שבו מעוררים ענפים טרמינליים חלופיים של נוירון יחיד, מה שגורם לפוטנציאל הפעולה המעורר להיות בעל שני השהיות בסיסיות (או יותר) שהן בלעדיות הדדית²⁰. לבסוף, שינויים בטמפרטורה של ההסתעפויות הסופיות של תא עצב היקפי גורמים גם הם לשינויי חביון פוטנציאליים לפעולה באופן תרמודינמי, כאשר התחממות מגדילה את מהירות ההולכה וקירור מאט את מהירות ההולכה¹⁹. לפיכך, כל תוכנה המבקשת לבצע מעקב סף חשמלי בלולאה סגורה של סיבי C נוסיספטיביים חייבת לאפשר שינויים בהשהיה בפוטנציאלי פעולה מעוררים חשמלית.

כדי להשיג את מטרתנו של מעקב סף חשמלי חוצה מינים של נוציצפטורים מסיבי C, פיתחנו את APTrack, תוסף תוכנה בקוד פתוח עבור פלטפורמת Open Ephys²¹, כדי לאפשר מעקב סף חשמלי ומעקב אחר השהיה בזמן אמת. אנו מספקים נתוני הוכחת היתכנות המוכיחים כי מעקב אחר סף חשמלי של Nociceptor מסיבי C במהלך מיקרונוירוגרפיה אנושית אפשרי. יתר על כן, אנו מראים כי כלי זה יכול לשמש באלקטרופיזיולוגיה של סיבים מכרסמים ex vivo , ובכך לאפשר מחקרים תרגומיים בין בני אדם למכרסמים. כאן, נתאר בפירוט כיצד חוקרים יכולים ליישם ולהשתמש בכלי זה כדי לסייע במחקרם על תפקוד nociceptor ורגישות.

Protocol

ניסויי המיקרונוירוגרפיה האנושית אושרו על ידי ועדת האתיקה של המחקר בפקולטה למדעי החיים באוניברסיטת בריסטול (מספר סימוכין: 51882). כל משתתפי המחקר נתנו הסכמה מדעת בכתב. הניסויים בבעלי חיים בוצעו באוניברסיטת בריסטול בהתאם לחוק הבריטי לבעלי חיים (הליכים מדעיים) 1986 לאחר אישור על ידי המועצה לרווחת בעלי חיים ואתיקה של אוניברסיטת בריסטול וכוסו על ידי רישיון פרויקט.

1. התקנת ממשק המשתמש הגרפי וה-APTrack Open Ephys

1. עיין בתיעוד התוכנה כדי למצוא את הגירסה העדכנית ביותר של ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של Open Ephys הנתמך (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) ולאחר מכן הורד והתקן את ממשק המשתמש הגרפי.
2. התקן גירסה תואמת של ממשק המשתמש הגרפי מכתובת ה- URL הבאה: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
3. הורד את הגרסה האחרונה של GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. עבור מחשב Windows, העתק את קובץ .dll לתיקייה plugins, אשר נמצאת בדרך כלל ב- C:\Program Files\Open Ephys\plugins. עבור מחשב MacOS, העתק את קובץ ה- .bundle לתיקיה Contents/PlugIns של החבילה.

2. הרכבת מכשיר ההקלטה והגירוי

1. חבר את לוח הרכישה למחשב באמצעות הכבל שסופק על-ידי היצרן והפעל אותו.
   הערה: עבור מיקרונוירוגרפיה אנושית, נעשה שימוש באיזולטור USB 3.0 כדי לבודד חשמלית את המשתתף מהמחשב, ולוח הרכישה הופעל על ידי סוללה ניידת בניגוד לספק הכוח במתח החשמל ששימש לחקר מכרסמים. כל חיבורי ה- USB, למעט לוח הבקרה של מנוע הצעד, הועברו דרך מבודד ה- USB במהלך המחקרים בבני אדם.
2. חבר את לוח הקלט/פלט ליציאה האנלוגית בלוח הרכישה. חבר ראש הקלטה של Intan RHD ללוח הרכישה באמצעות כבל ממשק היקפי טורי (SPI).
   הערה: כאן נעשה שימוש בבמת הראש הדו-קוטבית Intan בעלת 16 ערוצים, אך ניתן להשתמש בבמות ראש אחרות מסדרת RHD2000 מונופולרית.
3. חבר את PulsePal למחשב²². להרכבה עם ממריץ אנלוגי מבוקר מתח (למשל, DS4) באמצעות PulsePal, כמו עם הקלטות סיבים מוקנטים של עכבר, בצע את השלבים 2.5.1-2.5.3; להרכבה עם ממריץ מבוסס מקודד סיבובי (לדוגמה, DS7) באמצעות מנוע צעד, כמו בהקלטות מיקרו-נוירוגרפיה אנושית, בצע את השלבים 2.6.1-2.6.8 (איור 1).
4. בנה את שרשרת האותות בממשק המשתמש הגרפי כמתואר להלן.
   1. הכנס את תוסף Rhythm FPGA לשרשרת האות על ידי לחיצה שמאלית וגרירתו לשרשרת האותות; זה מחבר את ממשק המשתמש הגרפי ללוח הרכש. ודא שנלחץ על לחצן ADC כדי להתחיל את ההקלטה של ערוצי ADC מלוח הקלט/פלט. לחצן ADC יידלק בכתום כאשר הוא מופעל.
      הערה: אם ברצונך להשמיע נתונים ניסיוניים שהוקלטו בעבר, ניתן להשתמש בתוסף קורא הקבצים בהתחלה במקום ב- Rhythm FPGA. שימוש בזה בשילוב עם APTrack יאפשר הדמיה ומעקב השהיה של פוטנציאלי הפעולה בניסויים קודמים.
   2. הכנס מסנן פסים לשרשרת האותות; הגדרות ברירת המחדל של 300-6,000 הרץ מתאימות הן להקלטות אנושיות והן להקלטות עכבר. בנוסף, הכנס מפצל אחריו.
   3. הכנס את תוסף APTrack לשרשרת האותות בצד אחד של המפצל ואת מציג LFP בצד השני. LFP Viewer מספק תצוגת מעקב מתח מסורתית דמוית אוסצילוסקופ, השימושית במהלך ניסויים.
   4. הוסף צומת רשומה לאחר התוסף. בתפריט הנפתח, שנה את תבנית שמירת הנתונים מבינארי ל- Open Ephys. זה משלים שרשרת אותות פשוטה שעובדת היטב (איור 2); עם זאת, ניתן להוסיף רכיבים נוספים כפי שנקבע על ידי דרישות הניסוי.
      הערה: אם צומת הרשומה ממוקם לפני התוסף בשרשרת האותות, פרטי המעקב אחר פוטנציאל הפעולה לא יישמרו.
   5. בפינה השמאלית העליונה של ממשק המשתמש הגרפי, לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל להעביר נתונים מלוח הרכישה ולדמיין אותם. כדי להתחיל להקליט, לחץ על כפתור ההקלטה המעגלי לצד כפתור ההפעלה.
      הערה: קל לשכוח ללחוץ על הקלטה; אנו רושמים נתונים מהרגע שאנו מתחילים לרכוש כדי למנוע זאת.
5. להרכבה עם ממריץ אנלוגי מבוקר מתח, בצע את השלבים כמתואר להלן.
   1. הפעל על מגרה זרם קבוע שיש לו משרעת גירוי נשלטת על ידי כניסת מתח אנלוגי. במקרה זה נעשה שימוש ב-DS4 (איור 1).
   2. ערוץ הפלט PulsePal 1 מיועד לפקודת המתח האנלוגי. פצל אות זה באמצעות מפצל T BNC ולאחר מכן חבר אותו לכניסת מגרה הזרם הקבוע וללוח הקלט/פלט כך שמתח הפקודה יירשם.
   3. ערוץ הפלט PulsePal 2 מיועד לסמן אירוע TTL לגירוי חשמלי. חבר זאת ללוח הקלט/פלט כך שסמני האירועים TTL של הגירוי יירשמו עבור התוסף לשימוש ולניתוח פוסט הוק.
6. להרכבה עם ממריץ אנלוגי מבוקר מתח, בצע את השלבים כמתואר להלן.
   1. הפעל על מגרה זרם קבוע שמשרעת הגירוי שלו נשלטת על ידי חוגת קידוד סיבובית. במקרה הזה נעשה שימוש ב-DS7 (איור 1).
   2. חבר את לוח הבקרה של מנוע הצעד למנוע הצעד באמצעות הכבל והתושבת המגנטית שסופקו על-ידי היצרן.
   3. חבר את לוח הבקרה למחשב ישירות באמצעות כל כבל USB A ל-USB micro-B סטנדרטי. אל תחבר את לוח הבקרה בצד המשתתף של מבודד ה- USB מכיוון שהוא מחובר גם לספק כוח מתח של 12 וולט.
   4. אם זו הפעם הראשונה שמשתמשים בלוח הבקרה, העלה את סקריפט מנוע הצעד מ- GitHub ללוח הבקרה; יש לעשות זאת פעם אחת בלבד, או אם עדכוני תוכנה כלשהם עבור סקריפט מנוע הצעד משוחררים.
   5. הגדר את חוגת משרעת הגירוי על ממריץ הזרם הקבוע ל- 0 mA. השתמש בתושבת הרכבה מותאמת אישית כדי לממשק את מנוע הצעד ואת חוגת משרעת הגירוי. אלה יכולים להיות מודפסים בתלת-ממד, מה שמאפשר פתרונות הרכבה זולים, מהירים וניתנים להתאמה אישית. התייעץ עם GitHub כדי לראות אם תושבת כבר תוכננה עבור הממריץ הנבחר.
   6. השתמש במתאם חבית מותאם אישית כדי לחבר את קנה מנוע הצעד לחוגת הבקרה של משרעת הגירוי. מתאמים אלה צריכים להיות בנויים ממתכת מטעמי חוזק ועמידות; עם זאת, חלקים מודפסים בתלת-ממד יהיו גם מתאימים, אם כי ייתכן שיהיה צורך להחליף אותם באופן קבוע. התייעץ עם GitHub כדי לראות אם מתאם חבית כבר תוכנן עבור הממריץ הנבחר.
   7. חבר באופן רופף את לוח הבקרה/מנגנון מנוע הצעד לחוגת הבקרה של המגרה באמצעות מתאם הרכבה וחבית מותאם אישית.
      הערה: מתאם התושבת והחבית יתהדק מאוחר יותר לאחר השקת התוכנה והגדרת מנוע הצעד, באופן אוטומטי, למצב אפס.
   8. חבר את PulsePal כמתואר בשלבי פרוטוקול 2.5.2-2.5.3 (פחות חיבור ערוץ פלט 1 למגרה), מכיוון שעדיין נדרשת יצירת סמני אירוע TTL לניתוח ולתפקוד התוסף. בנוסף, חבר את ערוץ הפלט 2 למגרה DS7 כדי להפעיל אותו.
7. הכן את תכשיר עור-עצב העכבר כמתואר להלן.
   1. לספק עכברי C57BL/6J (מעבדות צ'ארלס ריבר, בריטניה, במחקר זה) בני 2-4 חודשים ומשני המינים מזון ומים אד ליביטום.
   2. לאחר כריתה על ידי מנת יתר בהרדמה באמצעות הזרקה intraperitoneal של נתרן pentobarbital (≥200 מ"ג / ק"ג) ואישור הפסקת זרימת הדם, לנתח את העור מן ההיבט הגבי של הכף האחורית העכבר ואת העצב saphenous, אשר innervates אזור זה, באמצעות השיטות המתוארות על ידי צימרמן ^{ואחרים.23}.
   3. שמור על הכנת העור-עצב בנוזל אינטרסטיציאלי סינתטי קרבוגני (טבלה 1) בטמפרטורה של 30-32 מעלות צלזיוס במחצית אמבט אקרילי דו-תאי בהתאמה אישית (קצב זילוח של 15 מ"ל/דקה, נפח של 30 מ"ל). השחילו את העצב דרך חור קטן לתוך התא המלא בשמן מינרלי, ואטמו עם ג'לי נפט. השמן מספק סביבת הקלטה מבודדת.
   4. הרחיקו שני חוטים עדינים מגזע העצב באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד ותלו אחד מכל צד של אלקטרודת רישום דו-קוטבית של כסף/כסף כלוריד.
   5. דיגיטציה והגברה של האות העצבי באמצעות שלב ראש דו-קוטבי RHD2216 בן 16 ערוצים, ועבד אותו באמצעות לוח הרכישה. דגמו את האות במהירות של 30 קילו-הרץ, עם מסנן פסים של 300-6,000 הרץ, ודמיינו אותו באמצעות ממשק המשתמש הגרפי.
   6. באמצעות מוט זכוכית קהה, ללטף את העור של התכשיר. השתמש בפעילות המסה באמפליטודה נמוכה כדי לאשר שההכנה חיה.
8. בצע מיקרונוירוגרפיה אנושית של סיבי C כמתואר להלן.
   1. לבצע מיקרונוירוגרפיה עם משתתפים שנתנו הסכמה מדעת בכתב, כפי שתואר קודם לכן²⁴.
   2. כאשר המשתתף יושב כשהוא נשען בנוחות על מיטה ונתמך בכריות, מזהים את העצב הפרוניאלי השטחי באמצעות סורק אולטרסאונד, ומסמנים אזור מטרה כ-5-10 ס"מ פרוקסימלי למליאולוס הצידי, סביב אמצע השוק.
   3. יש לעקר את העור סביב אזור המטרה באמצעות 2% כלורהקסידין במגבון 70% אלכוהול ולהחדיר אלקטרודת ייחוס סטרילית תת עורית בסמוך לאתר ההקלטה המיועד בגובה אמצע השוק.
   4. הכנס אלקטרודת הקלטה סטרילית לעצב הפרוניאלי השטחי תחת הנחיית אולטרסאונד באזור המטרה.
   5. דיגיטציה והגברה של האות העצבי באמצעות שלב ראש דו-קוטבי RHD2216 בן 16 ערוצים, ועבד אותו באמצעות לוח הרכישה. דגמו את האות במהירות של 30 קילו-הרץ, עם מסנן פסים של 300-6,000 הרץ, ודמיינו אותו באמצעות ממשק המשתמש הגרפי.
      הערה: ציוד הרכישה בודד חשמלית מהמחשב הנייד על ידי מבודד USB 3.0 עם בידוד RMS של 5 קילו-וולט והופעל באמצעות ספק כוח סוללה מותאם אישית של 12 וולט.
   6. אשר מיקום תוך עצבי מוצלח על ידי ליטוף עדין של העור כדי לחשוף פעילות מסה מעוררת מכנית. בנוסף, המשתתפים בדרך כלל מדווחים על נימול באספקט הדורסולטרלי של כף הרגל לאחר מיקום תוך עצבי מוצלח.

3. הגדרת תוכנה וזיהוי ופנוטיפ של נוירונים היקפיים

1. הגדר את התוכנה כמתואר להלן.
   1. פתח את ממשק המשתמש הגרפי (איור 3). אם לוח הבקרה של מנוע הצעד מחובר למחשב שלך, הוא יזוהה ויגדיר את עצמו למצב אפס. הדקו את מתאם ההרכבה והחבית המותאמים אישית המתוארים בשלבים 2.6.5-2.6.7, מכיוון שחוג משרעת הגירוי ומנוע הצעד של המגרה מוגדרים שניהם לאפס.
      הערה: אם מנוע הצעד וחוגת משרעת הגירוי אינם "מאופסים", הדבר עלול לגרום למנוע הצעד לנסות להוציא את חוגת הבקרה מהטווח שלה, דבר שעלול לגרום נזק.
   2. בתפריט האפשרויות, בחרו בערוץ הגורם המפעיל. בחר את ערוץ ADC המכיל את סמן TTL לגירוי חשמלי מערוץ הפלט PulsePal 2.
   3. בתפריט האפשרויות, בחרו בערוץ הנתונים ובחרו בערוץ הכולל את הנתונים האלקטרופיזיולוגיים.
   4. בלוח הבקרה של הגירוי, הגדר את אמפליטודות הגירוי הראשוניות, המינימליות והמרביות באמצעות המחוון. ודא שהגירוי הנוכחי מוגדר מעל 0 כדי שייווצרו סמני TTL.
      הערה: לחלק מהממריצים יש יחס קנה מידה של קלט-פלט שאינו 1:1; שקול זאת בעת בחירת משרעת גירוי מתאימה. לדוגמה, ניתן לבחור יחס פלט של 1:10 במערכות גירוי מסוימות כדי להשיג תפוקה גבוהה יותר מממריץ הזרם הקבוע.
   5. בלוח הבקרה לגירוי, לחץ על F כדי לטעון קובץ המכיל את הוראות הגירוי. פרוטוקולי גירוי חשמלי מאוחסנים כקבצי ערך מופרדים באמצעות פסיקים (CSV) המורכבים מתדרי הגירוי הרצויים וממשך הזמן, מה שמאפשר למשתמשים ליצור פרדיגמות גירוי מורכבות עבור הניסויים שלהם. תבנית לדוגמה זמינה כאן: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
   6. בלוח הבקרה של הגירוי, לחץ על > כדי להתחיל את פרדיגמת הגירוי הטעון. כברירת מחדל, APTrack מבקש מה- PulsePal להפיק פעימות גל ריבועיות חיוביות בעלות משך זמן של 0.5 אלפיות השנייה באמפליטודות משתנות כדי לשלוט באמפליטודת הגירוי של ממריץ הזרם הקבוע.
   7. תרשים הרסטר הזמני יתחיל להתעדכן עם התגובה לגירוי חשמלי, כאשר כל תגובת גירוי חדשה תוצג כעמודה חדשה מימין.
2. דמיינו וזהו פוטנציאלי פעולה של נוירון יחיד.
   1. לזיהוי מוצלח של פוטנציאלי פעולה של נוירון יחיד, חשוב להגדיר ספי תמונה מתאימים. בחלונית 'התוויית רסטר זמנית', התאימו את ערכי הסף של התמונה 'נמוך', 'זיהוי' ו'גבוה'.
      1. בחרו ערכת צבעים מתפריט האפשרויות. במצב WHOT (לבן חם) (ברירת מחדל), מתחים מתחת לסף התמונה הנמוך מקודדים בשחור. המתחים בין סף התמונה הנמוך לסף הזיהוי מקודדים בגווני אפור. מתחים מעל סף הגילוי מקודדים בירוק, ומתחים מעל סף התמונה הגבוה מקודדים באדום.
   2. נוירונים היקפיים מפגינים תגובות חביון קבועות בתדרי גירוי נמוכים (0.25 הרץ <), ותגובות אלה נקבעות על ידי מהירות ההולכה שלהם והמרחק בין אתרי הגירוי וההקלטה. עם הגדרת ספי תמונה מתאימים, אירועי חציית הסף שזוהו על-ידי האלגוריתמים יקודדו בירוק (איור 4).
   3. להזיז באופן שיטתי את האלקטרודה המגרה סביב אזור העור עצבוב על ידי העצב כי הוא נרשם, המאפשר מינימום של שלושה אירועי גירוי בכל אתר. נטר את תרשים הרסטר הזמני עבור אירועי חציית סף (מסומנים בירוק) המתרחשים באותה נקודת זמן לאחר כל אירוע גירוי חשמלי.
      הערה: בעכברים נעשה שימוש בגירוי חיפוש של 5 mA. בבני אדם, המשרעת של גירוי החיפוש החשמלי הטרנסעורי תוארה לדירוג כאב מילולי כך שהוא מעולם לא עלה על 7/10.
   4. בדוק אם קיימים שלושה אירועי חציית סף (פסים ירוקים) המופיעים בשורה באותו זמן השהיה ובאותה תנוחת גירוי; זה מצביע על זיהוי של פוטנציאל פעולה של נוירון היקפי.
   5. מטב את מיקום האלקטרודה המגרה על-ידי זיהוי הנקודה הרגישה ביותר מבחינה חשמלית בשדה הקלט של נוירון המטרה, ולאחר מכן קבע את האלקטרודה במקומה. בשלב זה במיקרונוירוגרפיה האנושית, עבור לשימוש במחטי אלקטרואקופונקטורה תוך עוריות (קוטר 0.2 מ"מ) לגירוי חשמלי דו קוטבי, בעכברים, נעשה שימוש בבדיקה מגרה טרנסעורית מותאמת אישית כך שתנוחת הגירוי קבועה.
3. לבצע סיווג ופנוטיפ חושי של הנוירונים ההיקפיים.
   1. הערך את הסף החשמלי של פוטנציאל פעולת המטרה על-ידי התאמת משרעת הסימולציה באופן ידני או באמצעות APTrack במידת הצורך (מתואר בשלבים 4.1-4.2).
   2. לעורר את שדה הקלט בפי 2 מהסף החשמלי המשוער בתדר של 0.25 הרץ לאורך כל פרוטוקול הפנוטיפ החושי.
   3. חשב את מהירות ההולכה של תא העצב על-ידי חלוקת מרחק ההולכה בחביון ההולכה. ניתן לזהות סיבי C על ידי מהירות הולכה של ≤2 מטר לשנייה.
   4. גירוי מכני של שדה הקלט באמצעות חוטי פון פריי כדי לקבוע את הסף המכני להפעלה. ניתן לזהות מכנוסנסציה על ידי פוטנציאלי פעולה מעוררים הנראים על עקבות המתח ועלייה בחביון של תא העצב, אם הוא סיב C, בכוח מספיק.
   5. מחממים את שדה הקלט של תא העצב, שוב צופים בפוטנציאלי פעולה הנראים על עקבות המתח ועלייה בחביון של תא העצב, אם הוא סיב C, על יישום חום מספיק. נוירונים רגישים לחום יציגו ירידה בהשהיה עקב ההשפעה התרמודינמית על התפשטות אקסונלית.
      הערה: במיקרונוירוגרפיה אנושית, השתמש ב- TSC-II לבקרה תרמית מהירה ומדויקת. בהכנת העכבר, הוסף נוזל אינטרסטיציאלי סינתטי מחומם או מקורר לתא בידוד אלומיניום הממוקם מעל שדה הקלט כדי לאפשר גישה למסופי הנוירונים תוך הגבלת פיזור חום מהיר לתוך הנוזל שמסביב. רשום את הטמפרטורה באמצעות זוג תרמי.
   6. קררו את שדה הקלט, שוב צפו בפוטנציאלי פעולה הנראים על עקבות המתח ועלייה ניכרת בחביון של תא העצב, אם הוא סיב C, עם יישום קר מספיק. כל תאי העצב יציגו עלייה בחביון עקב ההשפעה התרמודינמית על התפשטות אקסונלית, לכן יש לנקוט משנה זהירות בתיוג תאי עצב כרגישים לקור בהתבסס על עלייה בהשהיה בלבד.

4. מעקב אחר השהיה וסף חשמלי

1. בצע מעקב אחר השהיה כמתואר להלן.
   1. לאחר זיהוי פוטנציאלי פעולה של נוירון יחיד בתרשים הרסטר הרקתי, הזז את המחוון הליניארי האפור בצד ימין של התוויית הרסטר הרקתי כדי להתאים את מיקום תיבת החיפוש.
   2. מתחת להתוויית הרסטר הטמפורלי, התאם את מחוון הרוחב הסיבובי של תיבת החיפוש לרוחב המתאים. הפוך את רוחב תיבת החיפוש לצר יותר כדי להפחית את הסיכוי לקפיצות רעש חולפות, לירי ספונטני של פוטנציאלי פעולה או לזיהוי שגוי אחר של פוטנציאלי פעולה קבועים בקרבת מקום כפוטנציאל הפעולה המעניין.
   3. כדי להתחיל לעקוב אחר פוטנציאל הפעולה הממוקד, לחץ על + מתחת לטבלת המעקב מרובת היחידות. שורה חדשה תתווסף לטבלה המכילה פרטים על פוטנציאל פעולת המטרה, כולל מיקום ההשהיה, אחוז הירי מעל 2-10 גירויים (מותאם בתפריט האפשרויות) ומשרעת השיא שזוהתה.
   4. ברגע שפוטנציאל פעולה נוסף לטבלת המעקב מרובת היחידות, אלגוריתם מעקב ההשהיה (איור 5) יופעל עליו באופן אוטומטי בכל גירוי חשמלי עוקב.
   5. אם קיימים פוטנציאלי פעולה בדידים מרובים הגלויים בתרשים הרסטר הזמני, הוסף אותם לטבלת המעקב מרובת היחידות כמתואר לעיל. המספר המרבי התיאורטי של פוטנציאלי פעולה שניתן להוסיף לטבלה עבור מעקב השהיה בו-זמני הוא הערך השלם המרבי של 32 סיביות.
   6. סמן את התיבה עקוב אחר ספייק בטבלת המעקב מרובת היחידות כדי להזיז את תיבת החיפוש למיקום המתאים עבור פוטנציאל פעולה מסוים זה, כפי שנקבע על-ידי אלגוריתם המעקב אחר השהיה. זה יאפשר לעקוב אחר מעקב ההשהיה בזמן אמת ולוודא שהמעקב עוקב אחר פוטנציאל הפעולה כצפוי. מעקב ההשהיה אחר קוצים אחרים ימשיך כרגיל ברקע.
   7. הסר פוטנציאלי פעולה מסומנים מטבלת המעקב מרובת היחידות באמצעות לחצן המחיקה בסוף כל שורה.
2. בצע מעקב סף חשמלי כמתואר להלן.
   1. התאם את שיעורי ההפרשים והירידה בלוח הבקרה של הגירוי בין 0.1 וולט ל- 0.5 וולט. שמור על ערכים אלה שווים, ואל תתאים אותם במהלך הניסוי אלא אם כן זה חלק מפרדיגמת הניסוי.
   2. ודא שתדר הגירוי מוגדר לקצב מתאים, בדרך כלל 0.25-0.5 הרץ, אלא אם כן אפנון של תדירות הגירוי הוא חלק מפרדיגמת הניסוי. הגדלת קצב הירי של nociceptor עשויה לשנות את הסף החשמלי של nociceptor.
   3. לאחר מעקב מוצלח אחר פוטנציאל פעולה, סמן את התיבה Track Threshold בטבלת המעקב מרובת היחידות, אשר תפעיל את אלגוריתם מעקב הסף החשמלי (איור 6).
      הערה: מעקב סף חשמלי מופעל רק על פוטנציאל הפעולה הממוקד; ואכן, קצבי הירי של פוטנציאלי פעולה אחרים בטבלת המעקב מרובת היחידות יעודכנו בהתאם ככל שמשרעת הגירוי תשתנה.
   4. להתאים את משרעת הגירוי באופן ידני לאומדן הסף החשמלי; זה יקצר את זמן ההמתנה לקביעת סף החשמל. הזמן שלוקח לקבוע סף חשמלי אמין תלוי בתדירות הגירוי, בקצב התוספת והירידה ובהפרש באמפליטודת הגירוי מהגירוי הראשוני לסף החשמלי של תא העצב.
   5. התוכנה משתמשת בשיטה מעלה-מטה להערכת הסף החשמלי של הנוירונים. בטבלת המעקב מרובת היחידות, קצב הירי נקבע על פני 2-10 גירויים קודמים (שנבחרו בתפריט האפשרויות). בחר את מספר אירועי הגירוי שיש לקחת בחשבון; מספר גבוה יותר יגדיל את אמינות אומדן הסף, אך ייקח זמן רב יותר להשיגו.
   6. במהלך מיקרונוירוגרפיה אנושית, חשוב לפקח על הכאב של גירויים חשמליים כדי למנוע אי נוחות מוגזמת המשתתפים; אי נוחות מסוימת היא בלתי נמנעת במהלך המחקר של nociceptors, במיוחד של סיבי C שקטים / ישנים. בקש באופן קבוע דירוגי כאב בזמן שמשרעת הגירוי עולה במהלך מעקב הסף החשמלי והישאר בקרבת ממריץ הזרם הקבוע כדי לנתק אותו לבקשת המשתתף.
      הערה: לחלופין, ניתן לנתק את הגירוי החשמלי דרך ממשק המשתמש על ידי לחיצה על הלחצן [ ] בלוח הבקרה לגירוי.
   7. שיעור ירי של 50% מעיד על כך שנקבע הסף החשמלי המשוער.
   8. בזמן מעקב סף חשמלי, להחיל מניפולציה ניסיונית על שדה הקלט, כגון טמפרטורה או מניפולציות סמים. ההשפעות של מניפולציות אלה על הסף החשמלי של nociceptor יהיה במעקב.
      הערה: המתן מספיק זמן כדי לזהות סף nociceptor חדש לאחר מניפולציה ניסיונית.

תוצאות

דוגמה מייצגת של התוכנה הפועלת לשליטה בניסוי מוצגת באיור 7. הוא מתאים באופן איטרטיבי את משרעת הגירוי באמצעות שיטה מעלה-מטה כדי למצוא ביעילות את הסף החשמלי של nociceptors יחיד. בפעם הראשונה אנו מדגימים את ההיתכנות של מעקב סף חשמלי של נוירון בודד בזמן אמת בבני אדם במהלך מיקרו-נוירוגרפיה (איור 7A). נוסף על כך, אנו מראים מעקב אחר סף חשמלי בסיב Aδ של עכבר (איור 7B). זיהוי פוטנציאלי פעולה על ידי חציית סף, כפי שנעשה בו שימוש כאן, מספיק למעקב אחר ספי חשמל לאורך זמן. אנו ממליצים למשתמשים לנקוט צעדים כדי למזער רעש חשמלי במהלך ההקלטות שלהם, כגון באמצעות כלוב פאראדיי ומסנני פסים כדי לשפר את יחס האות לרעש.

כדי להדגים שמעקב אחר סף חשמלי יכול לשמש כמדד לשינויים ברגישות הנוציצפטורים בבני אדם, בוצע מעקב אחר הסף החשמלי במהלך פרדיגמת חימום מדורגת (איור 8). העלאת הטמפרטורה של הדקי הנוציצפטור הפחיתה את זרם הגירוי החשמלי הדרוש כדי לעורר פוטנציאל פעולה, מה שמשקף עלייה בעוררות הנוציצפטור (איור 8C). זה נגרם ככל הנראה על ידי יצירת פוטנציאלים של קולטן על ידי תעלות יונים רגישות לחום מבוטא ב C-fiber nociceptor¹⁴. בשלב הטמפרטורה הגבוה ביותר, 44°C, נוצרו פוטנציאלי פעולה מעוררים תרמית (איור 8A, גירוי מספר 86-96). זה גורם לעלייה בסף החשמלי כמו nociceptor עשוי להיות במצב עקשן לאחר פריקה בתדר גבוה. כצפוי, ההשהיה של פוטנציאל הפעולה המסומנת פחתה ככל שהטמפרטורה עלתה. הסברה היא שזה קורה בגלל השפעה תרמודינמית על מכונות ההולכה, שמגדילה את מהירות ההולכה של סיב C. סיב C זה עשוי גם להציג כפכפים (איור 8B, גירוי מספר 47-54), אשר יכול לגרום לגירוי החשמלי הבא להיות מוגבר בטעות באמפליטודה אם פוטנציאל הפעולה נופל מחוץ לחלון החיפוש של האלגוריתם.

איור 1: סכמה של מערך הציוד וחיבורי הכבלים הדרושים למעקב אחר סף חשמלי של nociceptor עם APTrack במכרסמים ובבני אדם. שימו לב לשתי השיטות השונות של בקרות משרעת גירוי: מנוע צעד עבור ממריצים מותאמים ידנית במערך האנושי שלנו, ו- PulsePal עבור ממריצים מבוקרי מתח כניסה במערך המכרסמים שלנו. (1) מחשב אישי (Windows, Mac או Linux) המריץ את התוסף עבור פלטפורמת Open Ephys. (2) מנוע צעד המפעיל את חוגת משרעת הגירוי ב-DS7. (3) ממריץ זרם קבוע המאושר לשימוש בבני אדם; כאן השתמשנו ב-DS7. (4) אופטויזולטור USB 3.0, המבודד את המשתתף האנושי מהמחשב (אופציונלי, נדרש רק למחקר בבני אדם). (5) מחולל פולסים PulsePal V2, המפיק חותמות זמן TTL (ערוץ פלט 2) ומדרגות מתח המתאימות למשרעת הגירוי המבוקשת (ערוץ פלט 1). (6) ממריץ זרם קבוע לשימוש בבעלי חיים; כאן השתמשנו ב-DS4. (7) ספק כוח DC למערכת (ספק כוח DC המשמש להתקנת מכרסם וספק כוח DC לסוללה המשמש להתקנה אנושית). (8) לוח רכישה. (9) לוח קלט/פלט לחיבור הכבלים הקואקסיאליים של BNC הנושאים את האותות שיש להקליט, כגון יציאות התרמוזוג וסמני TTL. (10) תכשיר עור-עצב העכבר עובר רישומים אלקטרופיזיולוגיים של נוציצפטור. (11) משתתף אנושי העובר רישום מיקרונוירוגרפיה מסיבי C בעצב הפרוניאלי השטחי. (12) במת Intan RHD2216 לרכישה ודיגיטציה של ההקלטות. (13) לוח מתאם אלקטרודות אינטאן, אליו מחוברות אלקטרודות ההקלטה ומאפשר העברת אות לראש הראש RHD2216. (14) מערכת גירוי תרמי שיכולה להפיק את הטמפרטורה באמצעות חיבור קואקסיאלי BNC. (15) כפתור / דוושת רגל המופעלים באמצעות סוללה של 3.3 וולט המשמשים לסימון אירועי גירוי מכני ויישומי סמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: שרשרת אותות תבנית. החץ האדום מצביע על הלחצן להפעלת קלט ADC מלוח הקלט/פלט. החץ הצהוב מציין את התפריט הנפתח לבחירת תבנית הקובץ Open Ephys. החץ הירוק מציין את הלחצנים הפעל והקלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ממשק משתמש גרפי. ממשק המשתמש הגרפי מורכב מארבעה מרכיבים עיקריים. (1) לוח Temporal Raster Plot (ירוק) לתצוגה חזותית של נתונים ולהגדרות המשויכות לשליטה במשטח. תגובת השהיה קבועה המראה האטה הדרגתית תלוית פעילות מסומנת על ידי החץ הירוק. (2) לוח בקרת גירוי (צהוב) להגדרת פרמטרי משרעת הגירוי וטעינת סקריפטי פרדיגמת הגירוי. (3) טבלת מעקב מרובת יחידות (כחול) להוספת פוטנציאלי הפעולה למעקב והפעלה של מעקב ההשהיה והסף החשמלי. (4) תפריט אפשרויות לבחירת סגנונות הצבע וערוץ הקלט של הנתונים והטריגרים של TTL. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הקלה על זיהוי פוטנציאלים של פעולות השהיה קבועות באמצעות תצוגה חזותית של נתונים בזמן אמת על תרשים רסטר זמני באמצעות APTrack. זוהי דוגמה ליחס אות לרעש גבוה. הנתונים המוצגים בתרשים הרסטר הרקתי הם מרישום סיב C אנושי מהעצב הפרוניאלי השטחי במהלך מיקרונוירוגרפיה. Voltage Trace הוא תוסף דמוי אוסצילוסקופ LFP Viewer בתוך Open Ephys. ממשק המשתמש APTrack הוא ממשק המשתמש הגרפי של התוסף. פוטנציאל הפעולה המסומן מסומן על ידי חצים ירוקים, והמחוון המעגלי על גבול תרשים הרסטר הזמני מיועד לשליטה במיקום תיבת החיפוש שבה האלגוריתמים יחפשו אירועי חציית סף. חפץ הגירוי החשמלי מסומן בכחול על עקבות המתח. משרעת הגירוי של פקודת המתח האנלוגית מסומנת באדום; שים לב שייתכן שזה לא יהיה זהה למשרעת זרם הגירוי בהתאם לגורם קנה המידה שנקבע על המגרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ייצוג גרפי של אלגוריתם מעקב השהיה. במילים פשוטות, אם פוטנציאל פעולה מזוהה על ידי חציית סף, תיבת החיפוש תתאים את מיקומה למרכז עצמה בזמן שיא המתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ייצוג גרפי של אלגוריתם מעקב הסף החשמלי. במילים פשוטות, אם פוטנציאל פעולה מזוהה על ידי חציית סף, משרעת הגירוי תקטן בשיעור הגזימה. אם לא זוהה פוטנציאל פעולה, משרעת הגירוי תוגדל בקצב ההפרש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: מעקב סף חשמלי אוטומטי אחר פוטנציאלי פעולה של נוירון יחיד בתדר גירוי של 0.25 הרץ . (A) עקבות רציפים של סיב C אנושי של העצב הפרוניאלי השטחי במהלך ניסוי מיקרונוירוגרפיה. (B) עקבות רציפים של עכבר Aδ-fiber של עצב saphenous במהלך הכנת עצב העור הקניטו אלקטרופיזיולוגיה של סיבים. העקבות נצבעו באדום כאשר זוהה פוטנציאל פעולה, וכתוצאה מכך חלה ירידה באמפליטודת הגירוי. אלגוריתם התוכנה מוצא ביעילות את משרעת הגירוי הנדרשת לסבירות של 50% לירי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: מעקב אחר סף חשמלי בתדר גירוי של 0.25 הרץ במהלך גירוי תרמי של נציצפטור סיב C אנושי. ציר ה-y מקודד את מספר הגירוי מתחילת הפרדיגמה. (A) מעקב מתח במשך 4,000 אלפיות השנייה לאחר גירוי חשמלי, כאשר אירועי חציית סף מסומנים באדום. (B) מעקב מתח מ-A מוגדל סביב פוטנציאל הפעולה המסומן. העקבות נצבעו באדום כאשר זוהה פוטנציאל הפעולה שזוהה. הקו הכחול האנכי הוא ההשהיה הבסיסית של היחידה המסומנת. (C) זרם גירוי בפיקוד APTrack. הקו הכחול האנכי הוא הסף החשמלי של קו הבסיס. (D) טמפרטורת בדיקה מגרה תרמית TCS-II בשדה הקלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרכובת	ריכוז
NaCl	107.8 מ"מ
NaHCO3	26.2 מ"מ
KCl	3.5 מ"מ
NaH2PO4	1.67 מ"מ
CaCl2	1.53 מ"מ
מגסו4	0.69 מ"מ
נתרן גלוקונאט	9.64 מ"מ
סוכרוז	7.6 מ"מ
גלוקוז	5.55 מ"מ

טבלה 1: תכולת נוזל אינטרסטיציאלי סינתטי להכנת עור-עצב עכבר²³.

Discussion

APTrack הוא תוסף תוכנה לשימוש עם פלטפורמת Open Ephys. בחרנו בפלטפורמה זו מכיוון שהיא קוד פתוח, גמישה וזולה ליישום. לא כולל העלות של ממריץ זרם קבוע, כל הציוד הדרוש כדי להתחיל להשתמש בתוסף ניתן לרכוש בסביבות 5,000 דולר בזמן כתיבת שורות אלה. אנו מקווים שזה יאפשר לחוקרים ליישם APTrack במחקרי האלקטרופיזיולוגיה של העצבים ההיקפיים שלהם ביתר קלות. יתר על כן, חוקרים יכולים לשנות באופן חופשי את התוכנה כך שתתאים לצרכי הניסוי שלהם. חשוב לציין, כלי זה איפשר מעקב סף חשמלי של nociceptors סיבי C בודדים, בפעם הראשונה, בבני אדם.

ככל שיחס האות לרעש גבוה יותר, כך האלגוריתמים יכולים לזהות טוב יותר פוטנציאלי פעולה. יחס האות לרעש במהלך מיקרונוירוגרפיה היה מספיק ברוב ההקלטות שלנו, אך המשתמשים חייבים להיות ערניים לסיכון של ירידה באות לאורך זמן. זה חשוב במיוחד עבור פרוטוקולים ניסיוניים ארוכים יותר, מכיוון שאם המשרעת של פוטנציאל הפעולה העוקב יורדת מתחת לסף הגילוי, משרעת הגירוי תוגדל בטעות; ניתן להקל על כך על ידי נסיינים המנטרים את התוסף ולאחר מכן מתאימים את ההגדרות במידת הצורך. יחס האות לרעש משופר באמצעות סינון פסים, אך ארעיים גדולים יותר עדיין עשויים להיות מזוהים בטעות כפוטנציאלי פעולה אם הם מגיעים במהלך חלון הזמן של תיבת החיפוש. ניתן להפחית את הסיכון לזיהוי שגוי של רעש חולף כפוטנציאל פעולה על ידי צמצום חלון הזמן שבמהלכו התוסף מחפש פוטנציאלי פעולה ועל ידי אופטימיזציה של הגדרות הסף. עם זאת, עדיין ישנם מצבים בהם אנו עשויים להיתקל אשר מעכבים את ביצועי התוסף. פעילות ספונטנית עלולה לגרום לקשיים אם פוטנציאלי פעולה באמפליטודה גדולה יותר נמצאים בחלון תיבת החיפוש של האלגוריתם, מכיוון שהם יזוהו בטעות כפוטנציאל פעולת המטרה. בנוסף, פעילות ספונטנית בתא העצב המעניין עשויה לגרום לכך שהגירוי החשמלי נופל במהלך תקופת העקשנות שלו, מה שגורם לכשל ביצירת פוטנציאל פעולה. קשיים בשימוש בתוכנה יכולים להתעורר גם כאשר נוירונים רגשיים ראשוניים מפגינים כפכף, שבו ענפים טרמינליים חלופיים של נוירון יחיד מגורים, ובכך גורמים לפוטנציאל הפעולה המעורר להיות בעל שתי השהיות בסיסיות (או יותר) שהן בלעדיות זו לזו²⁰. במהלך הקלטות מתאי עצב המציגים כפכפים עם יחסי אות לרעש גבוהים, ביצענו בהצלחה מעקב אחר השהיה וסף חשמלי על-ידי הגדלת רוחב תיבת החיפוש כדי לתמצת את כל מהירויות ההולכה הפוטנציאליות שתא העצב הציג. עם זאת, הסף החשמלי עשוי להשתנות בהתאם לענף הסופי של תא העצב המעורר, אשר סביר להניח בחלקו בשל הבדלים במרחק מאתר הגירוי החשמלי אל הדקי nociceptor חלופיים. עבודה נוספת על תהליך זיהוי פוטנציאל הפעולה שתכלול, למשל, התאמת תבניות היא אפשרית וניתן לשלב אותה בתוכנה זו. תוספי GUI עבור band-stop או סינון רעשים אדפטיבי יכול לשמש גם במעלה הזרם של APTrack בשרשרת האות אם הם פותחו.

אנו מחשיבים את הסף החשמלי שנקבע כזרם הדרוש כדי לעורר פוטנציאל פעולה 50% מהזמן, על פני מספר מוגדר של גירויים חשמליים, בדרך כלל 2-10. המורפולוגיה של גירוי חשמלי היא 0.5 אלפיות השנייה ופעימות גל חיוביות ומרובעות. זה לא אותו דבר כמו קביעת rheobase, מדד נפוץ של רגישות עצבית. התוסף יכול להיות מותאם כדי לקבוע את rheobase. עם זאת, חיפשנו מדד פשוט יותר, מכיוון ששינויים דינמיים ברגישות, כמו אלה ששיערו שיתרחשו במהלך חימום, היו קשים יותר לכימות עם שינויים בבסיס הריאו מאשר אומדן הסף החשמלי שלנו.

תוכנה זו יכולה לשמש הן בניסויים בבני אדם והן במכרסמים. הדבר מתאפשר הודות לתמיכה גמישה במערכות הגירוי החשמלי. התוכנה תעבוד עם כל מגרה המקבל מתח פקודה אנלוגי או ניתן להתממשק ידנית עם מנוע צעד. עבור מיקרונוירוגרפיה, השתמשנו בו עם ממריץ זרם קבוע מסומן CE שתוכנן לשימוש במחקר אנושי והגירוי שלו נשלט על ידי חוגה. ממריצים המקבלים פקודות מתח אנלוגיות יכולים להיות רועשים מכיוון שהם אינם מנתקים את המעגל בין גירויים, כלומר כל זמזום או רעש של 50/60 הרץ בקלט האנלוגי יועברו להקלטה. ממריץ הדורש אות הדק TLL נוסף כדי לחבר את המעגל, המאפשר גירוי בזרם המקביל לכניסת המתח האנלוגי להיווצר, הוא אידיאלי לשימוש עם התוסף. זה מונע את העברת הרעש להקלטה בין גירויים.

התוכנה משתמשת בשיטה פשוטה מעלה-מטה כדי להעריך את הסף החשמלי. זה כבר בשימוש במבחנים פסיכופיזיקליים במשך עשורים רבים²⁵. בהתאם לשיטת מעלה-מטה, אלגוריתם מעקב הסף החשמלי לאפנון משרעת הגירוי לוקח בחשבון רק את המשרעת והתגובה של הגירוי הקודם בעת חישוב המשרעת של הגירוי הבא. משמעות הדבר היא שמשרעת הגירוי תתנדנד סביב הסף החשמלי האמיתי, ובכך תייצר קצב ירי של 50%, בהנחה שהסף יציב. הגודל המינימלי של תוספת או גזירה הוא 0.01 V; זה שווה ערך ל- 0.01 mA בהנחה שלממריץ יש יחס קלט לפלט של 1 V:1 mA ורזולוציה מספקת כדי להשיג שינויי צעד קטנים כל כך. התוסף יעדכן את האומדן החי של הסף החשמלי של פוטנציאל פעולת המטרה בכל פעם שהוא מגיע לקצב ירי של 50% על מספר גירויים קודמים שהוגדרו על ידי המשתמש (2-10). לאחר הוק, אנו ממליצים להשתמש בממוצע מתגלגל של משרעת הגירוי על פני 2-10 הגירויים האחרונים כדי להעריך את הסף החשמלי, ויש לציין כי הערכה זו תהיה מדויקת רק כאשר קצב הירי יציב יחסית ועומד על 50%. הן באומדנים החיים והן באומדנים הפוסט-הוק של הסף החשמלי, יש איזון של רזולוציה, אמינות וזמן שיש לקחת בחשבון. שימוש במדרגות הדרגתיות וגזירה קטנות יותר יגדיל את הדיוק של אומדן הסף החשמלי, אך יגדיל את הזמן שלוקח למצוא את הסף החשמלי החדש בתחילה ולאחר הפרעה. חישוב הסף החשמלי על פני מספר גדול יותר של גירויים קודמים יספק אמינות טובה יותר אך יגדיל את הזמן הדרוש כדי להגיע לאומדן מדויק.

APTrack תוכנן לשימוש ברישומי עצבים היקפיים, במיוחד כדי לעקוב אחר הספים החשמליים של סיבי C במהלך הפרעות ניסיוניות ופתולוגיות על פני תקופות שבהן חביון פוטנציאל הפעולה עשוי להשתנות בהתאם לפעילות העצבית הבסיסית. שיטה זו תאפשר לבחון לא רק את ההתרגשות האקסונלית אלא גם את פוטנציאל מחולל הנוציצפטורים במתנדבים ובחולים בריאים. אנו צופים כי תחומים אחרים של אלקטרופיזיולוגיה עשויים לאמץ ולהתאים כלי זה לשימוש בכל ניסוי הדורש מעקב סף חשמלי של פעילות נעולה גירוי. לדוגמה, זה יכול בקלות להיות מותאם לגירוי אופטוגנטי עם פולסי אור המונעים מ- APTrack. התוסף הוא קוד פתוח וזמין לחוקרים תחת רישיון GPLv3. היא בנויה על פלטפורמת Open Ephys, שהיא מערכת איסוף נתונים בקוד פתוח הניתנת להתאמה, בעלות נמוכה. התוסף מספק ווים נוספים עבור תוספים במורד הזרם כדי לחלץ את המידע הפוטנציאלי לפעולה ולספק ממשקי משתמש נוספים או פרדיגמות אדפטיביות. התוסף מספק ממשק משתמש פשוט להדמיה ומעקב אחר השהיה של פוטנציאלי פעולה בזמן אמת. הוא יכול גם להפעיל נתונים קודמים ולהציג אותם באופן חזותי באמצעות תרשים הרסטר הזמני. יתר על כן, הוא יכול גם לבצע מעקב השהיה במהלך ההפעלה של נתונים קודמים. בעוד שישנן חבילות תוכנה אחרות הזמינות למעקב השהיה בזמן אמת, הן אינן קוד פתוח ואינן יכולות לבצע מעקב סף חשמלי^26,27. ל- APTrack יש יתרון על פני שיטות מסורתיות לזיהוי פוטנציאלים של פעולת השהיה קבועה מעקבות מתח, מכיוון שהוא משתמש בתרשים רסטר זמני עבור התצוגה החזותית של הנתונים. יתר על כן, הניסיון שלנו בשימוש בו בניסויים עם יחסי אות לרעש נמוכים הצביע על כך ששיטת ההדמיה של עלילת הרסטר הטמפורלי מאפשרת זיהוי של פוטנציאלי פעולה קבועים של השהיה שאולי היו מוחמצים אחרת.

מעקב אחר סף עצבי שלם הוא שיטה נפוצה להערכת רגישות אקסונלית¹³. מעקב סף חשמלי של נוירון יחיד בסיבי C של מכרסמים שימש בעבר לכימות רגישות nociceptor¹⁴, והתועלת שלו בבני אדם מוכרת^10,11; עם זאת, עד כה, זה לא היה אפשרי. אנו מספקים כלי חדשני בקוד פתוח למדידה ישירה של רגישות nociceptor יחיד הן במחקרים אלקטרופיזיולוגיים של מכרסמים והן במחקרים אלקטרופיזיולוגיים של עצבים היקפיים אנושיים. APTrack מאפשר לראשונה מעקב סף חשמלי בקוד פתוח בזמן אמת אחר פוטנציאלי פעולה של נוירון יחיד בבני אדם. אנו צופים כי זה יקל על מחקרים תרגומיים של nociceptors בין מכרסמים ובני אדם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12V DC Power Supply	NA	NA	To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators.
36 Pin Electrode Adapter Board	Intan Technology	C3410	APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021.
APTrack Plugin	NA	NA	https://github.com/Microneurography/APTrack
Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode	Custom	NA	Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Concentric Stimulating Electrode	World Precision Instruments	SNE-100	For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode	Custom	NA	For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography.
BNC T Splitter (1+)	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter.
BNC to BNC cables (3+)	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard BNC cables.
C6H11NaO7	Merck	S2054	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
CaCl2	Merck	C5670	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Digitimer DS4 Constant Current Stimulator	Digitimer	DS4	Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022.
Digitimer DS7 Constant Current Stimulator	Digitimer	DS7A	Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022.
Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes	Harmony Medical	NA	For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography.
Glucose	Fisher Scientific	G/0450/60	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
HDMI Cable	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board.
KCl	Merck	P9541	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
MgSO4	Acros Organics	213115000	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Mineral Oil	Merck	330779	Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent.
NaCl	Merck	S9888	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3	Merck	S6014	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3	Merck	S0751	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Open Ephys Acquisition Board	Open Ephys	NA	APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022.
Open Ephys Graphical User Interface	Open Ephys	NA	https://github.com/open-ephys/plugin-GUI
Open Ephys I/O Board	Open Ephys	NA	APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022.
PulsePal V2	Sanworks	1102	APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly.
RHD 6ft SPI Cable	Intan Technology	C3206	APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021
RHD2216 16ch Bipolar Headstage	Intan Technology	C3313	APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage.
Sucrose	Fisher Scientific	S/8560/60	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
TCS-II Thermal Stimulator	QST.Lab	NA	For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography.
Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference)	FHC	30085	For microneurography recordings. 35mm.
Ultrasound Scanner iQ+	Butterfly Network	NA	For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography.
USB 3.0 5kV RMS Isolation	Inota Technology	7055-D	For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022.
USB-A to micro USB-B cable (2)	NA	NA	APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing.
uStepper S-lite + NEMA17 motor	uStepper	NA	To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022.
Von Frey Filaments	Ugo Basile	37450-275	For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors.