トランスレーショナルペイン研究のためのオープンソースのリアルタイム閉ループ電気閾値追跡

要約

APTrackは、Open Ephysプラットフォーム用に開発されたソフトウェアプラグインで、リアルタイムのデータ視覚化とニューロン活動電位の閉ループ電気閾値追跡を可能にします。ヒトC線維侵害受容器やマウスC線維およびAδ線維侵害受容器のマイクロニューログラフィにこれをうまく使用しました。

要約

侵害受容器は、潜在的に有害な有害な有害刺激を知らせる一次求心性ニューロンのクラスです。侵害受容器の興奮性の増加は、急性および慢性の疼痛状態で起こる。これにより、異常な進行中の活動が生じるか、有害な刺激に対する活性化閾値が低下します。この興奮性の増加の原因を特定することは、メカニズムベースの治療法の開発と検証に必要です。単一ニューロンの電気的閾値追跡は、侵害受容器の興奮性を定量化することができる。そこで、このような測定を可能にし、ヒトやげっ歯類での使用を実証するアプリケーションを開発しました。APTrackは、時間ラスタプロットを使用して、リアルタイムのデータの視覚化と活動電位の識別を提供します。アルゴリズムは、閾値を超えることによって活動電位を検出し、電気刺激後の潜時を監視します。次に、プラグインは、アップダウン法を使用して電気刺激振幅を変調し、侵害受容器の電気的閾値を推定します。このソフトウェアはOpen Ephysシステム(V0.54)上に構築され、JUCEフレームワークを使用してC ++でコーディングされました。これは、Windows、Linux、およびMacオペレーティングシステムで動作します。オープンソースコードが利用可能です(https://github.com/ マイクロニューログラフィー/ APTrack)。電気生理学的記録は、伏在神経のティーズドファイバー法を使用したマウス皮膚神経製剤と、表在腓骨神経の微小ニューログラフィーを使用した健康なヒトボランティアの両方の侵害受容器から採取されました。侵害受容器は、熱的および機械的刺激に対するそれらの応答によって、ならびに伝導速度の活動依存的な減速を監視することによって分類された。このソフトウェアは、時間ラスタプロットによる活動電位の識別を簡素化することにより、実験を容易にしました。私たちは、in vivoヒトマイクロニューログラフィ中、およびex vivoマウスのCファイバーとAδファイバーの電気生理学的記録中に、単一ニューロン活動電位のリアルタイム閉ループ電気閾値追跡を実証します。我々は、ヒトの熱感受性C繊維侵害受容器の電気的閾値が受容場を加熱することによって減少することを示すことによって原理の証明を確立する。このプラグインは、単一ニューロン活動電位の電気的閾値追跡を可能にし、侵害受容器興奮性の変化の定量化を可能にします。

概要

侵害受容器は、末梢神経系の主要な求心性ニューロンであり、明白または潜在的に組織に損傷を与えるイベントによって活性化され、急性疼痛において重要な保護的役割を果たします¹。動物モデル、健康なヒトボランティア、および患者におけるCファイバーおよびAδファイバー侵害受容器からの電気生理学的記録は、さまざまな疼痛状態における感作および異常な自発的活動を明らかにした2,3,4,5,6,7。患者の侵害受容器興奮性のこれらの変化の根底にあるメカニズムを理解することで、標的治療介入が可能になります⁸。しかし、^{特に患者において}侵害受容器の興奮性を直接評価するツールはほとんどありませんが9、そのようなツールの有用性の可能性はよく認識されています^10,11。

全神経電気的閾値追跡は、ヒトの軸索興奮性を調べるために使用することができる¹²。しかしながら、大きく、有髄した末梢ニューロンが感覚化合物活動電位の振幅に不釣り合いに寄与するので、全神経電気的閾値追跡はC線維機能の評価を可能にしない^11、13。実際、以前の研究では、糖尿病性神経障害および化学療法誘発性多発ニューロパチーを伴う慢性神経因性疼痛コホートにおける全神経電気的閾値追跡は、軸索興奮性に差を示さなかった¹¹。

以前の研究では、単一ニューロンレベルでの電気的閾値追跡を使用して、 ex vivo ラット皮膚神経調製物におけるからかい繊維記録中のC線維侵害受容器の興奮性を調べました¹⁴。著者らは、カリウム濃度の増加、酸性条件、およびブラジキニンのすべてが、活動電位発生の電気的閾値の低下に反映されるように、C線維侵害受容器の興奮性を増加させることを実証した。さらに、熱感受性侵害受容器の受容野を加熱すると電気的閾値が低下したが、熱感受性侵害受容器は電気的閾値の増加を示した¹⁴。これは、単一ニューロンの電気的閾値追跡が可能であり、有用である可能性があるという重要な証拠を提供しますが、現在、特に人間の研究のために、そのような調査を可能にするために利用できるソフトウェアおよび/またはハードウェアソリューションはありません。

ヒトにおいて、マイクロニューログラフィーは、C線維の電気生理学的特性を直接評価するために利用可能な唯一の方法である¹⁵。このアプローチは、慢性疼痛を有する患者における侵害受容器機能障害を実証するために使用されている2,3,4,5,6,7。マイクロニューログラフィーは、単一ニューロンの活動電位を検出できます。ただし、信号対雑音比が低いため、研究者はマーキング技術を使用してCファイバーの活性を特徴付けています¹⁶。マーキング技術では、閾値超の電気刺激が皮膚のC線維受容野に適用されます。この電気刺激は、Cファイバーの伝導速度によって決定される一定の遅延で発生する活動電位を生成します。C繊維は活動依存的な減速を示し、それによってそれらの伝導速度は減少し、したがって、それらの伝導潜時は活動電位放電の期間中に増加する¹⁷。基礎条件下では、C繊維は通常、有害な刺激がないと活動電位を生成しないため、低周波電気刺激に応答する伝導潜時は一定です。発火を誘発する機械的、熱的、または薬理学的刺激は、活動依存性の減速を誘発し、付随する低周波電気刺激によって誘発される活動電位の潜時を増加させる。これにより、低い信号対雑音比のコンテキストで、加えられた非電気的刺激に対する応答を客観的に識別することができます。したがって、活動依存性減速は、C繊維¹⁶を機能的に特徴付けるために使用することができる。実際、C繊維の異なる機能クラスは、刺激周波数の変化を伴う電気刺激パラダイムにおいて、活動依存性減速の独特のパターンを示す^18、19。Cファイバー活動電位の待ち時間のこの変動性は、それらを監視するように設計されたアルゴリズムにとって課題を提示します。

侵害受容器における進行中の活動は、低周波電気刺激中の潜時の潜時の変動性の増加をもたらし、これもまた活動依存性の減速によるものである。この増加した変動性、つまりジッタは、励起性の定量化可能な代理尺度です²。活動電位潜時の変動性のさらなる原因は、単一のニューロンの交互の末端枝が刺激されるフリップフロップを含み、これは誘発された活動電位が相互に排他的である2つ(またはそれ以上)のベースライン潜時を有する原因となる²⁰。最後に、末梢ニューロンの終末枝の温度の変化も熱力学的に活動電位潜時変化を引き起こし、加温は伝導速度を増加させ、冷却は伝導速度を遅くします¹⁹。したがって、侵害受容性Cファイバーの閉ループ電気閾値追跡を実行しようとするソフトウェアは、電気的に誘発される活動電位の潜時の変化を考慮しなければならない。

Cファイバー侵害受容器の種間電気的しきい値追跡の目標を達成するために、Open Ephysプラットフォーム²¹用のオープンソースソフトウェアプラグインであるAPTrackを開発し、リアルタイム、閉ループ、電気的しきい値追跡、および遅延追跡を可能にしました。ヒトマイクロニューログラフィ中のCファイバー侵害受容器の電気的閾値追跡が可能であることを示す概念実証データを提供します。さらに、このツールがげっ歯類 のex vivo からかい繊維電気生理学に使用できることを示し、ヒトとげっ歯類の間のトランスレーショナル研究を可能にします。ここでは、研究者が侵害受容器の機能と興奮性の研究を支援するためにこのツールを実装して使用する方法について詳しく説明します。

プロトコル

ヒト微小ニューログラフィ実験は、ブリストル大学生命科学部研究倫理委員会によって承認されました(参照番号:51882)。すべての研究参加者は書面によるインフォームドコンセントを与えた。動物実験は、ブリストル大学動物福祉および倫理審査委員会の承認後、1986年英国動物(科学的手順)法に従ってブリストル大学で実施され、プロジェクトライセンスの対象となりました。

1. Open Ephys GUI と APTrack のインストール

1. ソフトウェアのマニュアルを参照して、サポートされている Open Ephys グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) の最新バージョン (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) を見つけ、GUI をダウンロードしてインストールします。
2. 次の URL から互換性のあるバージョンの GUI をインストールします。 https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases。
3. GitHub から最新バージョンをダウンロードします: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases。Windows コンピューターの場合は、.dll ファイルをプラグイン フォルダー (通常は C:\Program Files\Open Ephys\plugins) にコピーします。MacOS コンピューターの場合は、.bundle ファイルをパッケージの [コンテンツ/プラグイン] フォルダーにコピーします。

2.記録刺激装置の組み立て

1. 製造元が提供するケーブルを使用して集録ボードをコンピュータに接続し、電源を入れます。
   注:ヒトマイクロニューログラフィーでは、USB 3.0アイソレータを使用して参加者をコンピューターから電気的に隔離し、取得ボードはげっ歯類の研究に使用される主電源電圧電源とは対照的にポータブルバッテリーで駆動されました。ステッピングモーター制御ボードを除くすべてのUSB接続は、人間の研究中にUSBアイソレーターを通過しました。
2. I/Oボードを集録ボードのアナログ入力ポートに接続します。シリアル・ペリフェラル・インターフェース(SPI)ケーブルを使用して、Intan RHD記録ヘッドステージをアクイジション・ボードに接続します。
   注:ここではIntan 16チャンネルバイポーラヘッドステージを使用しましたが、他のモノポーラRHD2000シリーズヘッドステージを使用することもできます。
3. パルスパルをコンピュータ²²に接続する。PulsePalを使用してアナログ電圧制御刺激装置(DS4など)で組み立てるには、マウスのからかいファイバー録音と同様に、手順2.5.1〜2.5.3に従います。ステッピングモーターを使用してロータリーエンコーダベースの刺激装置(DS7など)で組み立てる場合は、人間のマイクロニューログラフィ記録と同様に、手順2.6.1-2.6.8に従います(図1)。
4. 以下で説明するように、GUIでシグナル・チェーンを構築します。
   1. Rhythm FPGAプラグインを左クリックしてシグナルチェーンにドラッグし、シグナルチェーンに挿入します。これにより、GUIがアクイジション・ボードに接続されます。ADCボタンをクリックして、I/OボードからADCチャンネルの記録を開始してください。ADCボタンは、オンになるとオレンジ色に点灯します。
      注:以前に記録した実験データを再生したい場合は、Rhythm FPGAの代わりにファイルリーダープラグインを最初に使用できます。これをAPTrackと組み合わせて使用 すると、以前の実験での活動電位の視覚化と遅延追跡が可能になります。
   2. バンドパス・フィルタをシグナル・チェーンに挿入します。デフォルト設定の300〜6,000 Hzは、人間とマウスの両方の記録に適しています。さらに、その後にスプリッターを挿入します。
   3. APTrackプラグインをスプリッターの片側のシグナルチェーンに挿入し、反対側のLFPビューアを挿入します。LFPビューアは、従来のオシロスコープのような電圧トレースビューを提供し、実験中に役立ちます。
   4. プラグインの後にレコードノードを挿入します。ドロップダウンメニューで、データ保存形式をバイナリからOpen Ephysに変更します。これにより、適切に機能する単純なシグナル・チェーンが完成します(図2)。しかしながら、追加の成分は、実験要件によって決定されるように追加され得る。
      注:シグナル・チェーン内のプラグインの前にレコード・ノードを配置した場合、活動電位トラッキング情報は保存されません。
   5. GUIの右上にある再生ボタンをクリックして、アクイジションボードからのデータの送信と視覚化を開始します。録音を開始するには、再生ボタンの横にある円形の録音ボタンをクリックします。
      注:レコードをクリックするのを忘れがちです。これを防ぐために、取得を開始した瞬間からデータを記録します。
5. アナログ電圧制御刺激装置で組み立てるには、以下に説明する手順に従ってください。
   1. アナログ電圧入力によって刺激振幅が制御される定電流刺激装置の電源を入れます。この場合、DS4を使用しました(図1)。
   2. PulsePal出力チャンネル1は、アナログ電圧コマンド用です。この信号をBNC Tスプリッタで分割し、定電流刺激器入力とI/Oボードに接続して指令電圧を記録します。
   3. PulsePal出力チャンネル2は、電気刺激TTLイベントマーカー用です。これをI / Oボードに接続して、プラグインが使用する刺激TTLイベントマーカーと事後分析が記録されるようにします。
6. アナログ電圧制御刺激装置で組み立てるには、以下に説明する手順に従ってください。
   1. 回転式符号化ダイヤルによって刺激振幅が制御される定電流刺激装置の電源を入れます。この場合、DS7を使用しました(図1)。
   2. メーカー提供のケーブルと磁気マウントを使用して、ステッピングモーター制御ボードをステッピングモーターに接続します。
   3. 標準のUSB A-USBマイクロBケーブルを使用して、コントロールボードをコンピューターに直接接続します。USBアイソレータの参加者側の制御ボードは、12Vの主電源にも接続されているため、接続しないでください。
   4. コントロールボードを初めて使用する場合は、ステッピングモータースクリプトをGitHubからコントロールボードにアップロードします。これは、一度だけ、またはステッピングモータースクリプトのソフトウェアアップデートがリリースされた場合にのみ実行する必要があります。
   5. 定電流刺激装置の刺激振幅ダイヤルを0mAに設定します。カスタム取り付けブラケットを使用して、ステッピングモーターと刺激振幅ダイヤルをインターフェースします。これらは3Dプリントできるため、安価で迅速、かつカスタマイズ可能な取り付けソリューションが可能になります。GitHub に問い合わせて、選択した刺激装置用にマウントが既に設計されているかどうかを確認してください。
   6. カスタムバレルアダプターを使用して、ステッピングモーターバレルを刺激振幅制御ダイヤルに接続します。これらのアダプターは、強度と耐久性の理由から金属で構成する必要があります。ただし、定期的に交換する必要があるかもしれませんが、3Dプリントされた部品も適しています。GitHubを参照して、選択した刺激装置用にバレルアダプターがすでに設計されているかどうかを確認してください。
   7. カスタムマウントとバレルアダプターを使用して、コントロールボード/ステッピングモーター装置を刺激装置コントロールダイヤルに緩く取り付けます。
      注意: ソフトウェアが起動され、ステッピングモーターが自動的に位置ゼロに設定されると、マウントとバレルアダプターは後で締められます。
   8. プロトコルステップ2.5.2-2.5.3(出力チャンネル1をスティミュレーターに接続することを除いたもの)で説明されているようにPulsePalを接続します。さらに、出力チャンネル2をDS7スティミュレータに接続してトリガします。
7. マウスの皮膚神経製剤を下記のように調製する。
   1. 生後2〜4か月のC57BL / 6Jマウス(この研究では、英国チャールズリバーラボラトリーズ)に、餌と水を 自由摂取で提供します。
   2. ペントバルビタールナトリウム(≥200 mg/kg)の腹腔内注射による麻酔薬の過剰摂取による淘汰と循環の停止を確認した後、Zimmermannらによって記述された方法を使用して、マウスの後足の背側とこの領域を神経支配する伏在神経から皮膚を解剖します²³。
   3. 皮膚神経製剤を、特注のデュアルチャンバーアクリルバス(15 mL /分の灌流速度、30 mL容量)の半分で30〜32°Cで30〜32°Cに維持します。小さな穴からミネラルオイルで満たされたチャンバーに神経を通し、ワセリンで密封します。オイルは絶縁された記録環境を提供します。
   4. 超微細鉗子を使用して神経幹から2本の細いフィラメントを取り除き、バイポーラ銀/塩化銀記録電極の両側に1本ずつ吊るします。
   5. RHD2216 16チャンネル・バイポーラ・ヘッドステージを使用してニューラル信号をデジタル化および増幅し、アクイジション・ボードを使用して処理します。300〜6,000 Hzのバンドパスフィルターを使用して30 kHzで信号をサンプリングし、GUIを使用して視覚化します。
   6. 鈍いガラス棒を使用して、製剤の皮膚をなでます。低振幅質量活性を使用して、プレパレーションが生きていることを確認します。
8. 以下に説明するようにヒトC線維微小ニューログラフィを行う。
   1. 前述のように、書面によるインフォームドコンセントを提供した参加者とマイクロニューログラフィーを実施します²⁴。
   2. 参加者をベッドに快適にリクライニングさせ、枕で支えた状態で、超音波スキャナーを使用して表在性腓骨神経を特定し、外側くるぶしの約5〜10 cm近位のターゲット領域をマークします。
   3. 70%アルコールワイプ中の2%クロルヘキシジンを使用して標的領域の周囲の皮膚を滅菌し、滅菌参照電極を目的の記録部位の近くの皮下、すねの中レベルで挿入します。
   4. 滅菌記録電極を、ターゲット領域内の超音波ガイダンスの下で表在腓骨神経に挿入します。
   5. RHD2216 16チャンネル・バイポーラ・ヘッドステージを使用してニューラル信号をデジタル化および増幅し、アクイジション・ボードを使用して処理します。300〜6,000 Hzのバンドパスフィルターを使用して30 kHzで信号をサンプリングし、GUIを使用して視覚化します。
      注:アクイジション機器は、5 kV RMS絶縁のUSB 3.0アイソレータによってラップトップから電気的に絶縁され、カスタムメイドの12Vバッテリ電源 を介して 電力を供給されました。
   6. 皮膚を優しくなでて機械的に誘発された質量活動を明らかにすることにより、神経内ポジショニングが成功したことを確認します。さらに、参加者は通常、神経内ポジショニングが成功すると、足の背外側の感覚異常を報告します。

3. ソフトウェアのセットアップと末梢神経細胞の同定と表現型

1. 以下の説明に従ってソフトウェアをセットアップします。
   1. GUIを開きます(図3)。ステッピングモーター制御ボードがPCに接続されている場合、それが検出され、位置ゼロに設定されます。刺激装置の刺激振幅ダイヤルとステッピングモーターの両方がゼロに設定されているため、手順2.6.5〜2.6.7で説明されているカスタムマウントとバレルアダプターを締めます。
      注意: ステッピングモーターと刺激振幅ダイヤルの両方が「ゼロ」になっていない場合、ステッピングモーターがコントロールダイヤルをその範囲外に回そうとすると、損傷を引き起こす可能性があります。
   2. オプションメニューで、 トリガーチャンネルを選択します。パルスパル出力チャンネル2から電気刺激TTLマーカーを含む ADCチャンネル を選択します。
   3. オプションメニューで、データチャンネルを選択し、電気生理学的 データを含むチャンネルを選択します。
   4. 刺激コントロールパネルで、スライダーを使用して初期、最小、および最大の刺激振幅を定義します。TTLマーカーが生成されるように、電流刺激が0より上に設定されていることを確認してください。
      注意: 一部の刺激装置は、入力と出力のスケーリング比が1:1ではありません。適切な刺激振幅を選択する際には、この点を考慮してください。例えば、定電流刺激装置からのより高い出力を達成するために、いくつかの刺激システムでは1:10の出力比を選択することができる。
   5. 刺激コントロールパネルで、Fをクリックして刺激指示を含むファイルをロードします。電気刺激プロトコルは、目的の刺激周波数と持続時間で構成されるカンマ区切り値(CSV)ファイルとして保存されるため、ユーザーは実験用の複雑な刺激パラダイムを作成できます。テンプレートの例は、こちらから入手できます。 https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
   6. 刺激コントロールパネルで、>をクリックして、ロードされた刺激パラダイムを開始します。デフォルトでは、APTrackは、定電流刺激装置の刺激振幅を制御するために、さまざまな振幅の0.5ミリ秒の持続時間の正の方形波パルスを生成するようにPulsePalに要求します。
   7. 時系列ラスタープロットは、電気刺激に対する応答で更新を開始し、新しい刺激応答ごとに右側に新しい列として表示されます。
2. 単一ニューロンの活動電位を視覚化して識別します。
   1. 単一ニューロンの活動電位の検出を成功させるには、適切な画像閾値を設定することが重要です。時系列ラスター プロット パネルで、画像の低、検出、および高の閾値を調整します。
      1. オプションメニューで配色を選択します。WHOT(ホワイトホット)モード(デフォルト)では、低画像スレッショルドを下回る電圧は黒でエンコードされます。低画像と検出スレッショルドの間の電圧はグレースケールでエンコードされます。検出スレッショルドを超える電圧は緑色でエンコードされ、高画像スレッショルドを超える電圧は赤色でエンコードされます。
   2. 末梢ニューロンは、低い刺激周波数(<0.25Hz)で一定の潜時応答を示し、これらの応答は、それらの伝導速度および刺激部位と記録部位の間の距離によって決定される。適切な画像しきい値を設定すると、アルゴリズムによって検出されたしきい値超過イベントが緑色でエンコードされます(図4)。
   3. 記録されている神経によって神経支配されている皮膚領域の周りで刺激電極を体系的に動かし、各部位で最低3つの刺激イベントを可能にします。各電気刺激イベントの後の同じ時点で発生する閾値交差イベント(緑色でマーク)の時系列ラスタープロットを監視します。
      注:マウスでは、5 mAの検索刺激が使用されました。ヒトでは、経皮的電気検索刺激の振幅は、7/10を超えないように口頭による疼痛評価まで滴定された。
   4. 同じ潜時および同じ刺激位置で連続して現れる3つのしきい値交差イベント(緑色のバー)を確認します。これは、末梢ニューロン活動電位の同定を示す。
   5. ターゲットニューロンの受容野の最も電気的に敏感な点を特定することにより、刺激電極の位置を最適化し、電極を所定の位置に固定します。ヒトマイクロニューログラフィのこの時点で、バイポーラ電気刺激に皮内電気鍼治療針(直径0.2 mm)を使用するように切り替え、マウスでは、刺激位置が一定になるようにカスタム経皮刺激プローブを使用します。
3. 末梢ニューロンの分類と感覚表現型を実行します。
   1. シミュレーション振幅を手動で調整するか、必要に応じてAPTrackを使用して、ターゲット活動電位の電気的しきい値を推定します(手順4.1〜4.2で説明)。
   2. 感覚表現型プロトコル全体で、0.25Hzの周波数で推定電気閾値の2倍で受容野を刺激します。
   3. 伝導距離を伝導潜伏時間で割ることにより、ニューロンの伝導速度を計算します。C繊維は≤2 m/sの伝導速度で識別できます。
   4. フォン・フレイフィラメントを使用して受容野を機械的に刺激し、活性化の機械的閾値を決定します。機械感覚は、電圧トレースに見える誘発活動電位と、十分な力でニューロン(Cファイバーの場合は)の潜時の増加によって識別できます。
   5. ニューロンの受容野を加熱し、十分な熱を加えると、電圧トレースで見える活動電位とニューロンの潜時の増加(Cファイバーの場合)を再び監視します。熱に敏感でないニューロンは、軸索伝播に対する熱力学的効果のために潜伏期の減少を示す。
      注:ヒトマイクロニューログラフィーでは、TSC-IIを使用して迅速かつ正確な熱制御を行います。マウスの準備では、周囲の液体への急速な熱放散を制限しながらニューロン終末へのアクセスを可能にするために、受容野の上に置かれたアルミニウム隔離チャンバーに加温または冷却された合成間質液を追加します。熱電対を使用して温度を記録します。
   6. 受容野を冷却し、電圧トレースに見える活動電位と、十分な低温適用時にニューロンの潜伏時間が著しく増加するのを再び監視します。すべてのニューロンは、軸索伝播に対する熱力学的効果のために潜時の増加を示すため、潜時の増加のみに基づいてニューロンを冷感症としてラベル付けする場合は注意してください。

4.遅延と電気的しきい値の追跡

1. 以下で説明するように、待機時間の追跡を実行します。
   1. 時系列ラスタープロットで単一ニューロンの活動電位を特定したら、時系列ラスタープロットの右側にある灰色の線形スライダーを移動して、検索ボックスの位置を調整します。
   2. 時系列ラスター プロットの下で、検索ボックスの幅の回転スライダーを適切な幅に調整します。検索ボックスの幅を狭くして、過渡ノイズスパイク、自発発的に発火する活動電位、またはその他の近くの一定の遅延活動電位が目的の活動電位として誤認される可能性を減らします。
   3. ターゲット活動電位の追跡を開始するには、マルチユニット追跡テーブルの下にある+をクリックします。待ち時間の位置、2〜10刺激を超える発火率(オプションメニューで調整)、検出されたピーク振幅など、ターゲット活動電位の詳細を含む新しい行がテーブルに追加されます。
   4. 活動電位がマルチユニットトラッキングテーブルに追加されると、その後の電気刺激ごとにレイテンシトラッキングアルゴリズム(図5)が自動的に実行されます。
   5. 時系列ラスター プロットに複数の離散活動電位が表示されている場合は、上記のようにそれらを複数ユニット追跡テーブルに追加します。同時遅延追跡のためにテーブルに追加できる活動電位の理論上の最大数は、最大 32 ビット整数値です。
   6. マルチユニット トラッキング テーブルの [Track Spike ] チェックボックスをオンにして、遅延トラッキング アルゴリズムによって決定される特定の活動電位の適切な位置に検索ボックスを移動します。これにより、レイテンシートラッキングをリアルタイムで監視し、トラッキングが期待どおりにアクティビティポテンシャルに従っていることを確認できます。他のスパイクの待機時間の追跡は、バックグラウンドで通常どおり続行されます。
   7. 各行の最後にある削除ボタンを使用して、複数ユニットの追跡テーブルから追跡された活動電位を削除します。
2. 以下に説明するように、電気的しきい値トラッキングを実行します。
   1. 刺激コントロールパネルの増分率と減分率を0.1 Vから0.5 Vの間で調整します。 これらの値は等しく保ち、これが実験パラダイムの一部でない限り、実験中に調整しないでください。
   2. 刺激周波数の変調が実験パラダイムの一部でない限り、刺激周波数が適切なレート(通常は0.25〜0.5Hz)に設定されていることを確認してください。侵害受容器の発火率を増加させると、侵害受容器の電気的閾値が変化する可能性がある。
   3. 活動電位が正常に追跡されたら、マルチユニット追跡テーブルの[追跡しきい値]ボックスにチェックマークを付けると、電気的 しきい値追跡 アルゴリズムが開始されます(図6)。
      注意: 電気的しきい値追跡は、ターゲット活動電位でのみ実行されます。実際、マルチユニットトラッキングテーブル内の他の活動電位の発火率は、刺激振幅が変化するにつれてそれに応じて更新されます。
   4. 刺激振幅を手動で調整して、電気的しきい値の推定値にします。これにより、電気的しきい値を決定するための待ち時間が短縮されます。信頼できる電気的閾値を確立するのにかかる時間は、刺激周波数、増加率および減少率、ならびに初期刺激からニューロンの電気的閾値までの刺激振幅の差に依存する。
   5. ソフトウェアは、ニューロンの電気的閾値の推定にアップダウン法を使用します。マルチユニットトラッキングテーブルでは、発火率は2〜10回の以前の刺激(オプションメニューで選択)にわたって決定されます。考慮する刺激イベントの数を選択します。数値を大きくすると、しきい値推定値の信頼性は高まりますが、達成に時間がかかります。
   6. 人間のマイクロニューログラフィーでは、過度の参加者の不快感を防ぐために、電気刺激の痛みを監視することが重要です。侵害受容器、特にサイレント/睡眠中のCファイバーの研究中に、いくらかの不快感は避けられません。.電気的しきい値追跡中に刺激振幅が増加する間、定期的に痛みの評価を尋ね、定電流刺激装置の近くに留まり、参加者の要求に応じてそれを解除します。
      注意: または、刺激コントロールパネルの [ ]ボタンをクリックして、ユーザーインターフェイスから電気刺激を解除することもできます。
   7. 50%の発火率は、おおよその電気的しきい値が決定されたことを示します。
   8. 電気的閾値追跡中に、温度または薬物操作などの受容野に実験的操作を適用する。侵害受容器の電気的閾値に対するこれらの操作の影響が追跡されます。
      注意: 実験操作後に新しい侵害受容器のしきい値を特定するのに十分な時間を確保してください。.

結果

実験を制御するソフトウェアの代表例を 図7に示します。アップダウン法を使用して刺激振幅を繰り返し調整し、単一の侵害受容器の電気的閾値を効果的に見つけます。初めて、マイクロニューログラフィ中のヒトにおけるリアルタイムの単一ニューロン電気閾値追跡の実現可能性を実証しました(図7A)。さらに、マウスAδファイバーにおける電気的閾値追跡を示します(図7B)。ここで使用される閾値交差による活動電位の識別は、経時的な電気的閾値を追跡するのに十分である。ファラデーケージとバンドパスフィルターを使用して信号対雑音比を改善するなど、録音中の電気的ノイズを最小限に抑えるための手順を実行することをお勧めします。

電気的閾値追跡がヒトにおける侵害受容器興奮性の変化の尺度として使用できることを実証するために、段階的加熱パラダイム中の電気的閾値の追跡が行われました(図8)。侵害受容器端子の温度を上げると、侵害受容器の興奮性の増加を反映して、活動電位を引き出すために必要な電気刺激電流が減少しました(図8C)。これは、C繊維侵害受容器¹⁴に発現される熱感受性イオンチャネルによる受容体電位の発生によって引き起こされた可能性が高い。最高温度ステップである44°Cでは、熱誘発活動電位が惹起された(図8A、刺激数86-96)。これにより、侵害受容器が高周波放電後に耐火状態になる可能性があるため、電気的閾値が増加します。予想通り、追跡された活動電位の待ち時間は、温度が上昇するにつれて減少しました。これは、C繊維の伝導速度を増加させる伝導機構への熱力学的効果によって起こると考えられている。このCファイバーはまた、フリップフロップ(図8B、刺激番号47〜54)を示す可能性があり、活動電位がアルゴリズム検索ウィンドウの外にある場合、次の電気刺激の振幅が誤って増加する可能性があります。

図1:げっ歯類と人間のAPTrackを使用した侵害受容器の電気的しきい値追跡に必要な機器のセットアップとケーブル接続の概略図。刺激振幅制御の2つの異なる方法に注意してください:人間のセットアップで手動で調整された刺激装置用のステッピングモーターと、げっ歯類のセットアップで入力電圧制御された刺激装置用のPulsePal。(1) Open Ephys プラットフォーム用のプラグインを実行している PC (Windows、Mac、または Linux)。(2) DS7の刺激振幅ダイヤルを操作するステッピングモータ。(3)ヒトでの使用が承認された定電流刺激装置。ここではDS7を使用しました。(4)人間の参加者をPCから隔離するUSB 3.0オプトアイソレータ(オプション、人間の研究にのみ必要)。(5)PulsePal V2パルスジェネレータは、TTLタイムスタンプ(出力チャンネル2)と要求された刺激振幅(出力チャンネル1)に対応する電圧ステップを生成します。(6)動物に使用するための定電流刺激装置;ここでは、DS4を使用しました。(7)システム用のDC電源(げっ歯類のセットアップに使用される主電源DC電源と人間のセットアップに使用されるバッテリーDC電源)。(8)買収委員会。(9)熱電対出力やTTLマーカーなど、記録する信号を伝送するBNC同軸ケーブルを接続するためのI / Oボード。(10)侵害受容器電気生理学的記録を受けているマウス皮膚神経製剤。(11)浅腓骨神経のC線維からの微小ニューログラフィ記録を受けているヒト参加者。(12)録音の取得とデジタル化のためのIntan RHD2216ヘッドステージ。(13) 記録電極が接続され、RHD2216ヘッドステージに信号を渡すことを可能にするIntan電極アダプタボード。(14)BNC同軸接続を介して温度を出力できる熱刺激システム。(15)機械的刺激イベントおよび薬物適用をマークするために使用される3.3Vバッテリー駆動のボタン/フットペダル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:テンプレート・シグナル・チェーン 赤い矢印は、I/OボードからのADC入力を有効にするためのボタンを指しています。黄色の矢印は、Open Ephys ファイル形式を選択するためのドロップダウン メニューを示します。緑色の矢印は、[再生] ボタンと [録音] ボタンを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:グラフィカルユーザーインターフェイス。 GUIは4つの主要コンポーネントで構成されています。(1) 時系列ラスタープロットパネル(緑色)は、データの視覚化とプロットの制御に関連する設定用です。アクティビティ依存の緩やかな減速を示す一定の遅延応答は、緑色の矢印で示されます。(2)刺激振幅パラメータを設定し、刺激パラダイムスクリプトをロードするための刺激コントロールパネル(黄色)。(3)待ち時間および電気的閾値追跡を追跡およびアクティブ化するための活動電位を追加するためのマルチユニット追跡テーブル(青色)。(4) オプション データおよびTTLトリガーのカラースタイルと入力チャンネルを選択するためのメニュー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:APTrackを使用した時間ラスタプロットでのリアルタイムデータ視覚化による一定遅延活動電位の識別の促進。 これは、高い信号対雑音比の例です。時間ラスタプロットに表示されるデータは、微小神経撮影中に表在腓骨神経から記録されたヒトCファイバーからのものです。電圧トレースは、Open Ephys内のオシロスコープのようなLFPビューアプラグインです。APTrackユーザーインターフェイスは、プラグインのグラフィカルユーザーインターフェイスです。追跡された活動電位は緑色の矢印で示され、時系列ラスタープロットの境界にある円形のスライダーは、アルゴリズムがしきい値を超えるイベントを検索する検索ボックスの位置を制御するためのものです。電気刺激アーチファクトは、電圧トレースに青色でマークされています。アナログ電圧コマンドの刺激振幅は赤で示されています。これは、刺激装置に設定されたスケーリング係数によっては、刺激電流振幅と同じでない場合があることに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: 待機時間追跡アルゴリズムのグラフ表示。 簡単に言えば、活動電位がしきい値の超過によって検出された場合、検索ボックスはピーク電圧の時点でそれ自体を中心にするようにその位置を調整します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:電気的しきい値追跡アルゴリズムのグラフ表示。 簡単に言えば、活動電位がしきい値の交差によって検出されると、刺激振幅は減少率だけ減少します。活動電位が検出されない場合、刺激振幅は増分率だけ増加します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:0.25 Hzの刺激周波数での単一ニューロン活動電位の自動電気的閾値追跡 。 (A)微小神経造影実験中の浅腓骨神経のヒトC線維の連続痕跡。(B)皮膚神経調製中の伏在神経のマウスAδ線維の連続痕跡は、線維電気生理学をからかった。活動電位が特定されると、トレースは赤色に着色され、刺激振幅が減少しました。ソフトウェアアルゴリズムは、発火の確率が50%に必要な刺激振幅を効果的に検出します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:ヒトCファイバー侵害受容器の熱刺激中の0.25Hz刺激周波数での電気的閾値追跡。 y軸は、パラダイムの開始からの刺激数をコード化します。(A)電気刺激後の4,000ミリ秒の電圧トレースで、しきい値を超えたイベントは赤でマークされています。(B)追跡された活動電位の周りにズームインした A からの電圧トレース。追跡された活動電位が検出されたとき、痕跡は赤色に着色された。青い縦線は、追跡対象のユニットのベースライン遅延です。(C)APTrackによって命令される刺激電流。青い縦線はベースラインの電気的しきい値です。(D)受容場TCS-II熱刺激プローブ温度。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

化合物	濃度
ナクル	107.8 ミリリットル
NaHCO3	26.2 ミリリットル
ティッカー	3.5ミリリットル
NaH2PO4	1.67ミリリットル
CaCl2	1.53 ミリリットル
マグネシウムソ4	0.69 ミリM
グルコン酸ナトリウム	9.64ミリリットル
蔗糖	7.6 ミリリットル
グルコース	5.55 ミリリットル

表1:マウス皮膚神経製剤²³用の合成間質液の内容物。

ディスカッション

APTrackは、Open Ephysプラットフォームで使用するためのソフトウェアプラグインです。このプラットフォームは、オープンソースで柔軟性があり、実装が安価であるため、このプラットフォームを選択しました。定電流刺激装置の費用を除いて、プラグインの使用を開始するために必要なすべての機器は、執筆時点で約5,000米ドルで購入できます。これにより、研究者が末梢神経電気生理学研究にAPTrackをより簡単に実装できるようになることを願っています。さらに、研究者は実験のニーズに合わせてソフトウェアを自由に変更できます。重要なことに、このツールは、ヒトで初めて、単一のCファイバー侵害受容器の電気的閾値追跡を可能にしました。

信号対雑音比が高いほど、アルゴリズムは活動電位をより適切に識別できます。マイクロニューログラフィー中の信号対雑音比は、ほとんどの記録で十分でしたが、ユーザーは時間の経過に伴う信号劣化のリスクに注意する必要があります。これは、追跡された活動電位の振幅が検出しきい値を下回ると、刺激振幅が誤って増加するため、より長い実験プロトコルでは特に重要です。これは、実験者がプラグインを監視し、必要に応じて設定を調整することで軽減できます。信号対雑音比はバンドパスフィルタリングによって改善されますが、より大きなトランジェントは、検索ボックスの時間枠内に到着した場合、活動電位と誤認される可能性があります。過渡ノイズを活動電位と誤認するリスクは、プラグインが活動電位を検索する時間枠を狭め、しきい値設定を最適化することで軽減できます。ただし、プラグインのパフォーマンスを妨げる可能性のある状況はまだあります。より大きな振幅の活動電位がアルゴリズムの検索ボックスウィンドウ内にある場合、自発的な活動は、ターゲット活動電位として誤認されるため、困難を引き起こす可能性があります。さらに、対象のニューロンにおける自発的な活動は、電気刺激がその不応期に低下し、活動電位の生成に失敗することを意味する可能性がある。ソフトウェアの使用が困難になるのは、一次求心性ニューロンがフリップフロップを示し、それによって単一のニューロンの交互の末端枝が刺激され、誘発された活動電位が相互に排他的な2つ(またはそれ以上)のベースライン潜時を有する場合にも生じ得る²⁰。高いS/N比のフリップフロップを示すニューロンからの記録中に、ニューロンが示すすべての潜在的な伝導速度をカプセル化するために検索ボックスの幅を増やすことにより、遅延と電気的閾値の追跡に成功しました。しかしながら、電気的閾値は、興奮されているニューロンの末端枝に依存して変化し得、これは、電気刺激の部位から代替侵害受容器終末までの距離の違いに一部起因している可能性が高い。例えば、テンプレートマッチングを含む活動電位識別プロセスに関する追加の作業は実行可能であり、このソフトウェアに統合することができる。バンドストップまたは適応型ノイズフィルタリング用のGUIプラグインは、開発されれば、シグナルチェーンのAPTrackの上流で使用することもできます。

決定された電気的しきい値は、ユーザー定義の数の電気刺激(通常は2〜10)にわたって、50%の確率で活動電位を引き出すために必要な電流であると考えています。電気刺激の形態は0.5msで、正の矩形波パルスです。これは、ニューロンの興奮性の一般的に使用される尺度であるレオベースの決定と同じではありません。プラグインは、レオベースを決定するように適合させることができます。しかし、加熱中に発生すると仮定されているような興奮性の動的変化は、電気的閾値の推定値よりもレオベースの変化で定量化することがより困難であったため、より単純な尺度を追求しました。

このソフトウェアは、人間とげっ歯類の両方の実験で使用できます。これは、電気刺激システムの柔軟なサポートによって可能になります。このソフトウェアは、アナログコマンド電圧を受け入れる刺激装置、またはステッピングモーターと手動でインターフェースできる任意の刺激装置で動作します。マイクロニューログラフィーでは、人間の研究で使用するために設計され、その刺激がダイヤルで制御されたCEマークの定電流刺激装置と一緒に使用しました。アナログ電圧コマンドを受け入れる刺激装置は、刺激間の回路を切断しないため、ノイズが多くなる可能性があり、アナログ入力の50/60Hzのハムまたはノイズが録音に送信されます。回路を接続するために追加のTLLトリガ信号を必要とする刺激器は、アナログ電圧入力に類似した電流で刺激を生成できるため、プラグインでの使用に最適です。これにより、刺激間の記録にノイズが伝達されるのを防ぎます。

このソフトウェアは、単純なアップダウン方式を使用して電気的しきい値を推定します。これは何十年にもわたって心理物理学のテストで使用されてきました²⁵。アップダウン法に沿って、刺激振幅を変調するための電気的閾値追跡アルゴリズムは、次の刺激の振幅を計算するときに、前の刺激の振幅と応答のみを考慮します。これは、刺激振幅が真の電気的閾値を中心に振動し、閾値が安定していると仮定すると、50%の発火率を生成することを意味します。インクリメントまたはデクリメントの最小サイズは0.01Vです。これは、刺激器の入出力比が1V:1で、ステップ変化がこれほど小さいとするのに十分な分解能を持つと仮定すると、0.01mAに相当します。プラグインは、ユーザー定義の以前の刺激の数(50-2)に対して10%の発火率に達するたびに、ターゲット活動電位の電気的しきい値のライブ推定値を更新します。事後的に、最後の2〜10回の刺激に対する刺激振幅の移動平均を使用して電気的しきい値を推定することをお勧めしますが、この推定値は、発火率が50%で比較的安定している場合にのみ正確であることに注意してください。電気的スレッショルドのライブ推定値と事後推定値の両方で、分解能、信頼性、および考慮すべき時間のバランスがあります。より小さなインクリメントステップとデクリメントステップを使用すると、電気的しきい値推定の精度が向上しますが、摂動後に最初に新しい電気的しきい値を見つけるのにかかる時間が長くなります。より多くの以前の刺激に対して電気的閾値を計算すると、信頼性が向上しますが、正確な推定値に到達するために必要な時間が長くなります。

APTrackは、末梢神経記録に使用するために、特に、活動電位潜時が根底にあるニューロン活動に応じて変化する可能性のある期間にわたる実験的および病理学的摂動中のCファイバーの電気的閾値を追跡するために設計されました。この方法により、軸索興奮性だけでなく、健康なボランティアや患者の侵害受容器発生電位を調べることができます。電気生理学の他の分野が、刺激ロックされた活動の電気的閾値追跡を必要とする実験で使用するためにこのツールを採用し、適応させる可能性があると予想しています。たとえば、これは、APTrackから駆動される光パルスによる光遺伝学的刺激に簡単に適合させることができます。プラグインはオープンソースであり、GPLv3ライセンスの下で研究者が利用できます。これは、適応性のある低コストのオープンソースデータ収集システムであるOpen Ephysプラットフォーム上に構築されています。プラグインは、ダウンストリームプラグインに追加のフックを提供して、アクションポテンシャル情報を抽出し、追加のユーザーインターフェイスまたは適応パラダイムを提供します。プラグインは、活動電位の視覚化と遅延追跡のためのシンプルなユーザーインターフェイスをリアルタイムで提供します。また、以前のデータを再生し、時系列ラスタープロットを使用して視覚化することもできます。さらに、以前のデータの再生中に遅延追跡を実行することもできます。リアルタイムの遅延追跡に利用できる他のソフトウェアパッケージがありますが、それらはオープンソースではなく、電気的しきい値追跡を実行できません^26、27。APTrackは、データの視覚化に時間ラスタプロットを使用するため、電圧トレースから一定の遅延活動電位を識別する従来の方法よりも優れています。さらに、信号対雑音比の低い実験で使用した経験から、時間ラスタプロットの視覚化手法により、他の方法では見逃されていた可能性のある一定の遅延活動電位を特定できることを示しています。

全神経閾値追跡は、軸索興奮性を評価するために広く使用されている方法です¹³。げっ歯類C線維における単一ニューロンの電気的閾値追跡は、侵害受容器の興奮性を定量化するために以前に使用されており¹⁴、ヒトにおけるその有用性は認識されています^10,11;しかし、これまで、これは不可能でした。げっ歯類とヒト末梢神経の両方の電気生理学的研究において、単一の侵害受容器の興奮性を直接測定するための新しいオープンソースツールを提供しています。APTrackは、ヒトの単一ニューロン活動電位のリアルタイムのオープンソースの電気的閾値追跡を初めて可能にします。げっ歯類とヒトの間の侵害受容器のトランスレーショナル研究を促進することが期待されます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12V DC Power Supply	NA	NA	To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators.
36 Pin Electrode Adapter Board	Intan Technology	C3410	APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021.
APTrack Plugin	NA	NA	https://github.com/Microneurography/APTrack
Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode	Custom	NA	Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Concentric Stimulating Electrode	World Precision Instruments	SNE-100	For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode	Custom	NA	For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography.
BNC T Splitter (1+)	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter.
BNC to BNC cables (3+)	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard BNC cables.
C6H11NaO7	Merck	S2054	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
CaCl2	Merck	C5670	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Digitimer DS4 Constant Current Stimulator	Digitimer	DS4	Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022.
Digitimer DS7 Constant Current Stimulator	Digitimer	DS7A	Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022.
Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes	Harmony Medical	NA	For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography.
Glucose	Fisher Scientific	G/0450/60	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
HDMI Cable	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board.
KCl	Merck	P9541	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
MgSO4	Acros Organics	213115000	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Mineral Oil	Merck	330779	Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent.
NaCl	Merck	S9888	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3	Merck	S6014	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3	Merck	S0751	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Open Ephys Acquisition Board	Open Ephys	NA	APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022.
Open Ephys Graphical User Interface	Open Ephys	NA	https://github.com/open-ephys/plugin-GUI
Open Ephys I/O Board	Open Ephys	NA	APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022.
PulsePal V2	Sanworks	1102	APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly.
RHD 6ft SPI Cable	Intan Technology	C3206	APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021
RHD2216 16ch Bipolar Headstage	Intan Technology	C3313	APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage.
Sucrose	Fisher Scientific	S/8560/60	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
TCS-II Thermal Stimulator	QST.Lab	NA	For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography.
Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference)	FHC	30085	For microneurography recordings. 35mm.
Ultrasound Scanner iQ+	Butterfly Network	NA	For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography.
USB 3.0 5kV RMS Isolation	Inota Technology	7055-D	For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022.
USB-A to micro USB-B cable (2)	NA	NA	APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing.
uStepper S-lite + NEMA17 motor	uStepper	NA	To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022.
Von Frey Filaments	Ugo Basile	37450-275	For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors.