מדידות כיווץ בתפוקה גבוהה של סיבי שריר עכבר שלמים המשובצים בהידרוג'ל באמצעות מערכת מבוססת אופטיקה

Summary

ניתן להעריך את תפקוד שרירי השלד על ידי כימות ההתכווצות של סיבי שריר מבודדים, באופן מסורתי באמצעות גישות מייגעות בעלות תפוקה נמוכה. במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אופטיקה בעלת תפוקה גבוהה לכימות ההתכווצות של סיבי שריר משובצים בהידרוג'ל. לגישה זו יש יישומים לסינון תרופות ופיתוח טיפולי.

Abstract

תרבית תאים במבחנה היא כלי רב עוצמה להערכת תהליכים תאיים ולבדיקת אסטרטגיות טיפוליות. עבור שרירי השלד, הגישות הנפוצות ביותר כוללות התמיינות של תאי אב מיוגנים לצינורות שריר לא בשלים או תרבית ex vivo לטווח קצר של סיבי שריר בודדים מבודדים. יתרון מרכזי של תרבית ex vivo על פני מבחנה הוא שימור הארכיטקטורה התאית המורכבת ומאפייני ההתכווצות. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול ניסיוני לבידוד סיבי שריר שלמים של flexor digitorum brevis מעכברים ותרבית ex vivo שלהם לאחר מכן. בפרוטוקול זה, סיבי השריר מוטמעים בהידרוג'ל מטריצת ממברנה מבוססת פיברין ומרתף כדי לשתק את הסיבים ולשמור על תפקוד ההתכווצות שלהם. לאחר מכן אנו מתארים שיטות להערכת תפקוד התכווצות סיבי השריר באמצעות מערכת כיווץ מבוססת אופטיקה בעלת תפוקה גבוהה. סיבי השריר המשובצים עוברים גירוי חשמלי כדי לגרום להתכווצויות, ולאחר מכן התכונות התפקודיות שלהם, כגון קיצור סרקומר ומהירות התכווצות, מוערכות באמצעות כימות מבוסס אופטיקה. צימוד תרבית סיבי שריר עם מערכת זו מאפשר בדיקות תפוקה גבוהה של ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים על תפקוד התכווצות ומחקרי ex vivo של הפרעות שרירים גנטיות. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם גם לחקר תהליכים תאיים דינמיים בסיבי שריר באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים.

Introduction

ההתקדמות בטכניקות תרביות תאי מבחנה פתחה אפשרויות חדשות לחקר יכולות התחדשות רקמות, מנגנונים תאיים פתופיזיולוגיים ואסטרטגיות טיפוליות עוקבות, כל זאת תוך שימוש ברקמות יונקים בתנאים מבוקרים היטב ^1,2,3. השימוש במערכות תרבית חוץ גופית מבוסס היטב בתחום מחקר השרירים ^4,5. באופן כללי, במבחנה מובחנת myotubes בוגר מתאי אב מיוגנים משמשים 2,6,7,8. למרות שהושגה התקדמות בפרוטוקול ההתמיינות ליצירת סיבי שריר בוגרים יותר⁹, חוסר הבשלות שלהם עדיין מגביל את תרגום הממצאים להגדרה in vivo ^1,10. נושא מרכזי אחד בתחום הביולוגיה של השריר הוא חוסר היכולת של צינורות מיו-צינור ממוינים במבחנה למצות באופן מלא את המבנים התוך-תאיים המורכבים, תהליכי איתות התא והאינטראקציות החוץ תאיות שנצפו ברקמת שריר טבעית, וחשוב מכך, לשחזר את כוחות ההתכווצות המיוצרים על ידי סיבי שריר 1,2,10,11,12 . בנוסף, ההתכווצות הבלתי מתואמת של צינוריות השריר במהלך תהליך ההתמיינות גורמת לעיתים קרובות לניתוק ספונטני ממנות התרבית, מה שהופך את הערכת ההתכווצות של מיוצינוריות מובחנות במבחנה למאתגרת ומוגבלת להערכה איכותית או כמותית למחצה 8,11,12,13. מגבלות אלה מחייבות לעתים קרובות ניסויים קבועים in vivo עם בעלי חיים, במיוחד אם התכווצות שרירים היא תוצאת ניסוי עיקרית¹.

חלופה לגידול בצינורות מיו-צינור מובחנים היא תרבית ex vivo של סיבי שריר בוגרים מבודדים ^1,14. במהלך תרבית ex vivo, רקמת שריר בוגרת התפתחותית נכרתת מהגוף, ואחריה בידוד תא בודד לגידול בתנאי מעבדה ^1,14. סיבי השריר הבוגרים המבודדים שומרים על המבנים התאיים המורכבים שלהם שנצפו ברקמה הטבעית^14,15, ושיטה זו פותחת את האפשרות להתערבויות ישירות, כגון מניפולציה גנטית ובדיקת תרופות^, בסביבת תרבית מוגדרת היטב וניתנת לשליטה. אחד הדיווחים הראשונים על בידוד סיבי שריר השלד ותרבות ex vivo מתוארך לשנות השלושים; עם זאת, התפוקה של סיבים ברי קיימא מפרוטוקול זה הייתה נמוכה¹⁶. עם אופטימיזציה מתמשכת של הליך הבידוד ותנאי התרבית, שיפור משמעותי בכמות סיבי השריר קיימא ומתפקדים אפשרי כעת 14,15,17,18,19. שיפור אחד כזה בתנאי התרבית כרוך בציפוי צלחות תרבית בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים כדי לקדם את היצמדות סיבי השריר המבודדים לצלחת התרבית^15,18,20. בדרך כלל, ציפוי למינין משמש, שכן למינין הוא אחד המרכיבים הנפוצים ביותר בתוך מטריצה תאית של שרירים^20,21. האופטימיזציה של הליך הבידוד בשילוב עם ציפוי צלחות התרבית אפשרו לשדה מחקר השרירים לשמור על סיבי שריר מבודדים בני קיימא עם ארכיטקטורה תאית שלמה ופונקציונליות כיווץ בתרבית לפרקי זמן קצרים 1,15,18,22.

הגישה הקונבנציונלית ביותר המשמשת בתחום השרירים למדידת כוח ויכולות כיווץ היא הרכבת סיבי שריר בודדים בין מנוע נהג אורך ומתמר כוח^23,24. באופן כללי, סיבי השריר המשמשים למערכים מוטוריים אלה מנותחים מרקמה קפואה או טרייה, ולאחר מכן חלחול או "עור", המאפשר הפעלת סידן חיצונית, כאשר ריכוזי סידן משתנים משמשים לגרימת התכווצות סיבי שריר²⁴. בעוד ששיטה זו היא תקן הזהב למדידות התכווצות סיבי שריר, ניתן למדוד רק סיב שריר אחד בכל פעם, מה שהופך טכניקה זו להליך מייגע וגוזל זמן²⁵. יתר על כן, הליך הבידוד והעור של סיבי השריר משבש את המבנים השונים המעורבים בצימוד עירור-התכווצות (כלומר, שחרור סידן וספיגה מחדש לאחר מכן לתוך הרשתית הסרקופלזמית), ובכך אינו מאפשר מחקר של קינטיקה הרפיה וכל מחלה שעלולה להשפיע על תהליך זה^26,27. חלופה להכנת סיבי העור היא שימוש בדיסקציה מכנית לבידוד סיבי שריר שלמים, שם ניתן למדוד כוחות התכווצות בתגובה להפעלה חשמלית²⁸; עם זאת, גישה זו מאתגרת מבחינה טכנית וגוזלת זמן רב, וכתוצאה מכך מדידות בתפוקה נמוכה. לבסוף, הן בתכשירים בעלי עור והן בתכשירים שלמים, תאי השריר מוסרים לחלוטין מהסביבה החוץ תאית במהלך מדידות התכווצות 24, מה שהופך את חקירת ההשפעה של הרכב/נוקשות המטריקס החוץ תאי על התכווצות סיבי השריר^לבלתי אפשרית²⁴. כתוצאה מכך, יש צורך בפיתוח שיטות חלופיות שיאפשרו מדידות התכווצות סיבי שריר של סיבי שריר שלמים מבודדים באופן בתפוקה גבוהה תוך שחזור הקשר בין סיבי השריר למטריצה החוץ תאית.

לאחרונה פותחה גישה חדשה מבוססת אופטיקה למדידות התכווצות סיבי שריר בתפוקה גבוהה²⁹. מערכת אופטית זו מודדת את המחזוריות של סרקומרים כדי להעריך את אורך הסרקומר במהלך התכווצות באמצעות הדמיה במהירות גבוהה. בתוך מערכת זו, התאים נשארים במקומם בצלחת התרבית בזמן שהאופטיקה זזה, ובכך ממזערים את הזמן הדרוש בין מדידות של תאים מרובים²⁹. יתרון מרכזי של שימוש בגישה מבוססת אופטיקה זו בתפוקה גבוהה הוא שהיא מאפשרת לפתח תנאי תרבית הדומים לאלה של הרקמה המקומית. גישה המשמשת לחיקוי תנאי invivo טבעיים היא הטמעת תאים בהידרוג'לים³⁰. בדרך כלל, הידרוג'ל הוא חומר ויסקו-אלסטי המסוגל לשמור על נפחו וצורתו, ולהידרוג'לים יש תכונות של חומרים מוצקים ונוזליים כאחד³¹. החלק המוצק מורכב משרשראות פולימריות המקושרות זו לזו, ויוצרות מבנה שנראה דומה לרשת^30,31. ניתן לכוונן את תכונות החומר של הידרוג'לים כדי לחקות את שקיעת המטריקס של השרירים^30,31. לפיכך, השילוב של מערכת מבוססת אופטיקה בעלת תפוקה גבוהה עם תאים המשובצים בהידרוג'לים פותח אפשרויות חדשות להעריך את ההשפעות של הרכב מטריצה חוץ-תאית ותכונות מכניות על תפקוד סיבי השריר.

המטרה הכוללת של מאמר זה היא 1) לתאר את המתודולוגיה לבידוד אנזימטי ולתרבית ex vivo של סיבי שריר בתנאים המחקים את סביבת הרקמה הטבעית ו-2) להעריך את התכווצות סיבי השריר באמצעות גישה בעלת תפוקה גבוהה. אנו מתארים מתודולוגיה מפורטת לבידוד קל של מספר רב של סיבי שריר בודדים משריר ה-FDB (flexor digitorum brevis) באמצעות עיכול אנזימטי. בנוסף, אנו מתארים טכניקה להטמעת סיבי השריר המבודדים בהידרוג'ל על בסיס פיברין לצורך חיקוי הסביבה הטבעית של השרירים ושיפור הכדאיות וההתכווצות של סיבי השריר. לאחר מכן אנו מתארים שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת התכווצויות סיבי שריר חיים במבחנה באמצעות מערכת זו שפותחה לאחרונה. יתרון נוסף של הליך הטבעה זה הוא אימוביליזציה של סיבים במהלך התכווצות, מה שעשוי לשפר את יחס האות לרעש של מדידות אלה. שיטת הטבעה זו של ג'ל ישימה הן עבור פולימר יחיד והן עבור הליכי אנקפסולציה של ג'ל מרוכב, ומקלה על הערכת ההשפעות של הרכב מטריצה חוץ-תאית על התכווצות סיבי השריר.

Protocol

עבור מחקרי התכווצות ex vivo , רקמות לאחר המוות הושגו מבעלי חיים שהוקרבו לפרויקטים מחקריים מאושרים אחרים ו / או עודפי רבייה של אוניברסיטת VU בהתאם לדירקטיבת המועצה האירופית (2010/63/EU) באישור חוק מחקר בעלי חיים של הולנד.

1. הכנת החומר

1. מכינים פיפטות לטריטורציה (מאחסנים 70% אתנול בארון זרימה עד לשימוש). חתכו את הקצוות של שני קצוות P1,000 כדי ליצור גדלים שונים של חורים; ודא שהחור גדול מספיק כדי שהשריר יוכל לעבור דרכו מבלי לחסום את הפיפט. העבירו את הקצוות החתוכים דרך להבה כך שהם יהפכו חלקים.
2. הכינו מנות סילגארד כמתואר במקום אחר³², ועיקרו מראש עם 70% אתנול לשימוש באבטחת הכף והשריר בזמן הבידוד.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בכלי Sylgard לאחר ניקוי יסודי עם מים נטולי יונים, ואתנול 70%.
3. הכינו את התמיסות הבאות לפני הליך הבידוד: מדיום דיסקציה, מדיום תרבית פיברין ומדיום לעיכול שרירים (ראו טבלה 1).
   הערה: יש לעקר את מדיום עיכול השרירים באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר. כל הפתרונות המוכנים צריכים להיות מאוזנים באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי ב 37 ° C ו 5% CO2 לפחות 30 דקות לפני השימוש.
4. לאחר עיכול השריר, הכינו את התמיסות הבאות ליציקת ההידרוג'ל: תערובת תאים ותערובת מטריצה (ראו טבלה 2). ערבבו את תערובת התאים ואת תערובת המטריצות ביחס של 1:1 לקבלת ריכוז פיברין סופי של 2.5 מ"ג/מ"ל.
   הערה: הכינו את המטריצה על קרח, והשתמשו בקצוות פיפטה מצוננים כדי למנוע פילמור מוקדם מדי של מטריצת קרום המרתף. יחס טרומבין:פיברינוגן של 1:10 (יחידות למ"ג פיברינוגן) המשמש כאן עבר אופטימיזציה לזמן פילמור של 30 דקות. אם הג'ל מתפלמר תוך 30 דקות, יש להשתמש בריכוז תרומבין נמוך יותר. עיין בדיון לקבלת מידע נוסף.

2. דיסקציה של שרירי FDB

1. הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם. יש לחטא את הגפה האחורית ב-70% אלכוהול.
2. חתכו את הרגל האחורית התחתונה מעל הקרסול. יש לפתוח את העור בצד הגבי של כף הרגל לכיוון אצבעות הרגליים.
   הערה: יש לחתוך את הרגל האחורית התחתונה במפרק הקרסול כדי למנוע נזק לשרירי הגפיים התחתונות ולשוקה, אם יהיה צורך בהם מאוחר יותר.
3. מקלפים בזהירות את העור לכיוון אצבעות הרגליים. היזהר לא לפגוע בשריר. ה- FDB הוא השריר השטחי ביותר בצד הגחוני של כף הרגל.
4. מניחים את כף הרגל המנותחת בצלחת Sylgard עם 10 מ"ל של בינוני דיסקציה שחומם מראש ב 37 ° C. נעצו את כף הרגל דרך העור שעדיין מחובר לאצבעות הרגליים, והצמידו את הרגל התחתונה מעבר לקרסול.
5. בזהירות להסיר את רקמת החיבור על גבי השריר. חותכים את הגיד בעקב, ומרימים את השריר למעלה על ידי הגיד שלו.
6. חותכים לצד ומתחת לשריר דרך רקמת החיבור. ממשיכים לחתוך עד לחשיפת גידי הבוהן.
7. כאשר חצי מאורך שלושת הגידים חשוף, חותכים את הגידים ומשחררים את השריר מכף הרגל. אופציונלי: לחתוך את הגיד הלטרלי הרביעי ואת סיבי השריר שלו.
8. נקו את רקמת החיבור מהשריר, והעבירו לצינור המכיל אמצעי דיסקציה שחומם מראש.

3. עיכול שרירים FDB

1. הכינו את מדיום העיכול של השרירים בהתאם לטבלה 1.
2. מעבירים את שרירי ה-FDB למדיום העיכול של השריר באמצעות פיפטה סרולוגית. יש לדגור באינקובטור תרביות רקמה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ למשך 80 דקות.
   הערה: הפעם יש למטב עבור כל אצווה של collagenase. העיכול הושלם כאשר השריר מתחיל להתפורר ונראה מוגדל. ראה את הדיון עבור אופטימיזציה של זמן העיכול.
3. לאחר העיכול, להעביר את השריר לצינור 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של מדיום דיסקציה, ולדגור במשך 30 דקות לפני trituration.

4. טריטורציה של שרירי FDB ושקיעת כוח הכבידה

1. Triturate את השריר באמצעות טיפים trituration מוכן מראש (שלב 1.1) על ידי pipetting השריר, הולך מן הגדול ביותר לגודל הקטן ביותר. אם שלב זה אורך יותר מ-5 דקות, הכניסו את השריר לאינקובטור למשך 5 דקות כדי לאפשר לו לנוח.
2. עשו טריטורציה עד שסיבי השריר ירדו בעיקר מהגיד והגיד יכול לעבור דרך קצה P200. הסר את הגידים.
3. הוסף את סיבי ה- FDB המנותקים לצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תווך דיסקציה, ואפשר לסיבים להתיישב באינקובטור למשך 20 דקות. שימו לב לגלולה שנוצרה.
4. אופציונלי: הסר 10 מ"ל בינוני מהחלק העליון וחזור על שלב 4.3. שלב זה מקל על הסרת פסולת עודפת ותאים מונונוקלציה הקשורים.

5. הטבעה של סיבי FDB

1. בזהירות להסיר את כל המדיום מהחלק העליון של גלולת הסיב. להשהות מחדש את התאים ב 875 μL של תערובת תאים לכל שריר FDB (על קרח).
   הערה: שריר FDB אחד מניב מספיק סיבים לשבע בארות של צלחת בת 24 בארות. צפיפות זו ניתנת להתאמה בהתאם לצרכי הניסוי. נפח הג'ל הבא (250 μL) מותאם לפורמט של 24 בארות, אך ניתן לשנות את קנה המידה שלו בהתאם לפורמטים אחרים.
2. Aliquot 125 μL של התא לערבב לתוך צינורות microcentrifuge יחיד.
3. באר אחת בכל פעם, להוסיף 125 μL של תערובת מטריצה aliquot תרחיף התא, וערבוב על ידי pipeting למעלה ולמטה בזהירות, הימנעות היווצרות של בועות.
4. מעבירים מיד את התערובת הסופית לבאר.
   הערה: הקפידו לזלף את התערובת למרכז הבאר. חזור על שלב 5.3 ושלב 5.4 עבור כל באר.
5. ממצקים את הג'לים באינקובטור למשך 30-45 דקות. לאחר התמצקות, מוסיפים בזהירות את מדיום התרבות לבארות.
   הערה: צנרת מהירה יכולה לנתק את ההידרוג'ל מהבאר. מנקודה זו ואילך, ניתן לגרות ולמדוד את הסיבים. עם זאת, מניסיוננו, מתן אפשרות לסיבים להסתגל לתנאי התרבית למשך 24 שעות עשוי לשפר את התכווצות הסיבים.
6. לתרבות ארוכה יותר, לחדש את מדיום התרבות על ידי חצי שינוי כל 2 ימים. לשם כך, הסר מחצית ממדיום התרבות, והחלף אותו בכמות שווה של מדיום טרי.

6. מדידות כיווץ מבוססות אופטיקה

1. הפעל את מערכת מדידת ההתכווצות מבוססת האופטיקה (ראה טבלת חומרים), את מנורת הפלואורסצנציה, את קוצב התא החשמלי ואת המחשב. הגדר את הממריץ החשמלי ל- 1.0 הרץ, 10.0 וולט ומשך דופק של 5.00 אלפיות השנייה כדי לעורר את סיבי השריר המבודדים.
2. הכניסו את הלוח למערכת המדידה. חברו את הקוצב לתוספת הקצב, והכניסו אותו לצלחת התרבית.
3. פתח את התוכנית IonWizard, ופתח קובץ חדש על ידי לחיצה על קובץ (בפינה השמאלית העליונה של המסך) | חדש.
4. בדוק אם התוכנית נמצאת בניסוי הנכון, Skeletal Sarcomere, על ידי לחיצה על חדש | לאסוף ניסוי. כדי לשנות את הניסוי, לחץ על הניסוי הרצוי ולחץ על הוסף. עבור ניסוי סרקומר השלד , החל את ההגדרות הבאות: Sarc 20x, קווים ממוצעים, FFT יחיד, קצב דגימה של 250 הרץ וזמן רכישה של 10 שניות.
   הערה: יש להכין את הגדרות הניסוי לפני הניסוי. ניתן להתאים את ההגדרות לצרכי הניסוי.
5. התאם את הטמפרטורה של מערכת המדידה ל 25 ° C. לחץ על פתח את מאתר התאים מתחת לסרגל הכלים והמתן למסך חדש שיופיע. בפינה השמאלית העליונה של מסך זה, בחר את סוג הצלחת ואת הבארות הפעילות.
   הערה: המדידות מבוצעות בטמפרטורה של 25°C כדי להפחית את מהירות ההתכווצות של סיבי שריר ה-FDB המתעוותים במהירות, ובכך למנוע תת-דגימה של אירוע ההתכווצות.
6. הביאו את הסיבים למיקוד על-ידי התאמת פס מחוון המיקוד. לחלופין, השתמש במקש W ובמקש S עבור פונקציית מיקוד זו.
7. אפשר את הקצב כדי להתחיל את הגירוי החשמלי. שימו לב שהסיבים מתחילים עכשיו להתעוות.
   הערה: אם אין סיבים מתעוותים, ודא שכל החוטים מחוברים ושקוצב הקצב שקוע לחלוטין. אם לאחר מכן עדיין אין תנועה, הסיבים עשויים שלא להגיב עקב עיכול יתר או נזק מוגזם במהלך trituration.
8. מקדו את אזור המדידה בקצה הסיב כך שהסרקומרים יפעלו אנכית. ודא שהסרקומרים נמצאים בפוקוס. אם הסרקומרים נמצאים במיקוד, פסגה אחת גלויה בסרגל הכלים. במהלך ההתכווצות, שיא זה ינוע ימינה ככל שהסרקומר יתקצר.
   הערה: ניתן לכוונן את אזור המדידה הסגול לפני תחילת הניסוי. כדי להבטיח מדידה נכונה, כלול ~ 20 סרקומרים. אם שיא זה משנה צורה במהלך התכווצות, הדבר עשוי להצביע על כך שהסרקומר מוסתר או לא ממוקד במהלך ההתכווצות, מה שיוצר רעש.
9. התחל את הניסוי על ידי לחיצה על התחל בסרגל הכלים. הקש על מקש Q כדי להתחיל מדידה, והמתן עד שהתוכנית תמדוד 10 מעברי כיווץ. אם יותר מארבעה ארעיים נראים נטולי רעשים, קבל את המדידה על-ידי הקשה על מקש Z . אם הארעיים משמיעים רעש רב מדי, דחו את המדידה על ידי לחיצה על מקש X .
10. יש למדוד בין 10 סיבים ל-20 סיבים בכל מצב. מיקומם של הסיבים שנמדדו בעבר נשמר.
11. אופציונלי: הוסף תרכובות, ולאחר מכן ניתן למדוד מחדש סיבים בשלב זה.
12. בסיום הניסוי, לחץ על לחצן העצירה בסרגל הכלים התחתון כדי לסגור את חלון מאתר התאים . שמור את הקובץ והתחל קובץ חדש.
13. כדי לנתח את הנתונים, פתח את התוכנית "שולחן העבודה Cytosolver". לחץ על ייבוא ובחר את הקבצים שברצונך לנתח.
14. לאחר שהתוכנית סיימה את הניתוח, חפש פסגות כחולות, אדומות ואפורות. הפסגות הכחולות הן פסגות ארעיות המקובלות בתוכנית. הפסגות האדומות הן פסגות ארעיות שנדחות על ידי התוכנית, והפסגות האפורות הן ארעיות שנדחות על ידי המשתמש.
    הערה: ניתן להתאים את קריטריוני הדחייה בתוכנת הניתוח. באופן כללי, ערכים נדחים אם הם חורגים מגבול נגזרת מרבי, וארעיים נדחים בהתבסס על ערכי התאמת עקומה R² של <0.95.
15. לחץ על ייצוא. סמן את התיבות הבאות: ממוצע נתונים ארעיים וייצוא ל- Excel.
16. בסיום, כבה את כל המכונות. הוציאו את צלחת התרבית, והשליכו אותה. נקו את אלקטרודות הפייסר עם מים שעברו דה-יוניזציה ו-70% אתנול.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה, סיבי שריר FDB בודדים בודדו והוטמעו בהידרוג'ל. סקירה כללית של הליך נתיחת השרירים מוצגת באיור 1. שריר ה-FDB חשוף בגידים שלמים ונחתך מהפאשיה. שמירה על גידים של השרירים כנקודות קיבוע ממזערת נזק פוטנציאלי לסיבי השריר במהלך הליך הבידוד. ניתן לחתוך עודפי רקמת חיבור כדי להפחית פסולת וצמיחה של סוגי תאים משניים. לאחר כריתת השריר וניקוי מספיק, השריר מתעכל אנזימטית באמצעות collagenase, וסיבי שריר בודדים משתחררים על ידי טריטורציה לפני הטמעת התאים המבודדים בהידרוג'לים. הבידוד של סיבי שריר FDB מספק סיבי שריר קצרים יחסית, שיש להם את היתרון של מניפולציה קלה. בשל גודלם, סיבי שריר FDB יכולים להיות pipeted בבטחה ללא נזק הנגרם על ידי סבך והם מוטמעים בקלות בתוך הידרוג'ל. מכיוון שסיבי שריר בודדים אינם נצמדים היטב ללוחות התרבית, הטמעת הסיבים בהידרוג'ל מבטיחה שהסיבים יישארו במקומם במהלך תרבית התאים ומדידות ההתכווצות. יתר על כן, הוספת מטריצת קרום מרתף לג'ל הפיברין מאפשרת אינטראקציות בין סיבי השריר לבין המטריצה, המחקה את הסביבה הטבעית in vivo . סיבי שריר בודדים בודדים ניתנים למניפולציה ומתוחזקים בתרבית במשך מספר ימים לאחר הבידוד. באיור 2 מוצגת דוגמה של סיבי FDB מבודדים המשובצים במטריצת הידרוג'ל. לסיבים הבריאים יש סרקומרים נראים לעין והם נמתחים ישר (חץ כחול), בעוד שהסיבים המעוקלים בדרך כלל פגומים או לא קיימא (חץ צהוב) ויש להוציא אותם מהמדידות. סיבים מכווצים במיוחד מופיעים כעצמים כדוריים כהים במטריצה (חץ אדום). אם הליך הבידוד היה מוצלח, חלקם של סיבים בריאים צריך להיות ~ 75%. חלק גדול יותר של סיבים hypercontracted בדרך כלל מצביע על נזק במהלך הליך הבידוד. הקרום של סיבי השריר יכול להיפגע או על ידי עיכול יתר של השריר או נזק לסיבים במהלך trituration. נזק trituration מתרחשת בעיקר אם השריר הוא מעוכל, ולכן, לא מתפרק בקלות.

פונקציונליות הסיבים ויכולת הקיום שלהם הוערכו באמצעות מדידות כיווץ של סיבי השריר באמצעות מערכת מדידת כיווץ מבוססת אופטיקה ובתפוקה גבוהה. המערכת מפיקה מספר פרמטרים, כגון אורך הסרקומר, אחוז קיצור הסרקומר, מהירות ההתכווצות ומהירות ההרפיה. באמצעות מערכת מדידת ההתכווצות, ניתן למדוד התכווצות סרקומר לכל סיב שריר. איור 3 מראה דוגמאות להתכווצויות סיבי שריר שנמדדו באמצעות מערכת המדידה. ממתכווץ יחיד חולף מתקבלים הפרמטרים הבאים: אורך סרקומר בנקודת ההתחלה, משך התכווצות, אורך סרקומר בכיווץ מקסימלי ומשך הרפיה (איור 3A). פרמטרים אלה משמשים לחישוב אחוז הקצרה, ההתכווצות וההרפיה של סרקומר. ניתן לחשב ערכי מהירות ממוצעת גם מערכי משך הזמן והקיצור המוחלט, במידת הצורך. מדידת התכווצות תקפה כוללת קו בסיס ישר, ואחריו ירידה לפסגה, וחזרה לקו הבסיס (איור 3A). רעש, סרקומרים לא ממוקדים או תנועה חריגה של הסיב יכולים להשפיע על המדידה הארעית (איור 3B,C), וניתן להשליך את המדידות האלה באופן ידני או להידחות על-ידי תוכנית הניתוח. בגישה זו, הדמיה ברורה של הסרקומרים חשובה למדידת הצירים; לכן, כל דבר שמקטין את הראות של הסרקומרים עלול להכניס רעש. זה יכול להתרחש אם יש תנועה של הסרקומרה מחוץ למישור המוקד במהלך התכווצות. מדידות שבהן סדרה של התכווצויות שונות במהירות או בעומק צריכות גם הן להיכלל במערך הנתונים.

נתוני ההתכווצות של סיבי שריר בודדים המתקבלים עם מערכת זו יכולים לשמש להשוואת תנאי תרבית שונים. יעילות המערכת מודגמת באיור 4. כאן, מדדנו את ההתכווצויות של סיבי שריר FDB הן בתבניות תרבית דו-ממדיות (לוחיות תרבית מצופות למינין) והן בתבניות תרבית תלת-ממדיות (פיברין הידרוג'ל). אחוז גבוה יותר של מדידות שמישות הושג בתלת-ממד, שכן הטמעת הסיבים בג'ל מנעה מתנועה צידית ומתוצרי תנועה אחרים להשפיע על המדידה (איור 4A). להטמעת הסיבים לא הייתה השפעה משמעותית על ערכי הקיצור של הסרקומר או על ערכי מהירות ההתכווצות המרבית בהשוואה לסיבים בתרבית דו-ממדית (איור 4B). כדי להמחיש כיצד מטריצות שונות משפיעות על ההתכווצות של סיבי שריר FDB, השווינו גם את הפיברין הידרוג'ל הזה למטריצה טהורה של קרום מרתף (4 מ"ג/מ"ל) (איור 4C). ההתכווצות המופחתת שנצפתה במטריצת קרום המרתף הטהורה נבעה ככל הנראה מקשיחות הג'ל או מאינטראקציות מוגברות בין תאים למטריצה. נבדקו גם ריכוזי פיברין של עד 7 מ"ג/מ"ל, ללא השפעה משמעותית על מהירות ההתכווצות והקיצור (נתונים שלא פורסמו). השימוש בהידרוג'ל מבוסס פיברין זה מבטיח הפרעה מינימלית לפרמטרים של התכווצות.

איור 1: סקירה כללית של הליך נתיחת שרירי FDB. (A) הגפה האחורית נחתכת מעל הקרסול (קו מקווקו אדום), ו-(B) העור מוסר על-ידי חיתוך לאורך החלק העליון של כף הרגל לאורך הקו הכחול המקווקו. (C) כף הרגל נעוצה דרך הקרסול והעור באצבעות הרגליים. (D) מבט מיקרוסקופי על השריר החשוף ושל רקמת החיבור הסובבת אותו. הפאשיה נראית כשכבה לבנה אטומה שדרכה עובר כלי הדם. (E) הפאשיה מוסרת מהשריר, והגיד נחתך לאורך הקו המקווקו האדום. (F) שריר ה-FDB מופרד מהרקמה הבסיסית על ידי הרמה וחיתוך מתחת ולצד השריר. (G) כאשר הגידים של הבהונות נראים בבירור, ה-FDB נחתך לאורך הקו המקווקו האדום. (H) ה-FDB מאובטח על ידי הגידים, וניתן להסיר את הגיד הצידי הרביעי ואת סיביו על ידי חיתוך לאורך הקו המקווקו האדום. כעת ניתן לקצץ את עודפי הפאשיה. (I) לאחר הניקוי, שריר ה-FDB מועבר לתמיסת הקולגנאז. פסי קנה מידה = (D-I) 2 מ"מ. קיצור: FDB = flexor digitorum brevis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונה מיקרוסקופית של סיבי שריר FDB המשובצים בהידרוג'ל לאחר 24 שעות של תרבית. חץ כחול: דוגמה לסיב שריר FDB בר קיימא. חץ צהוב: דוגמה לסיב שריר FDB מעוות. סיבי שריר מעוותים עשויים להיות בעלי כדאיות מופחתת והתכווצויות לקויות, ולכן יש להוציא אותם מהמדידות. חץ אדום: דוגמה לסיב שריר FDB היפר-מכווץ. התכווצות יתר מוגזמת מתרחשת כאשר טריטורציה מבוצעת במרץ רב מדי או יכולה להיגרם על ידי עיכול יתר של collagenase או שימוש במדיום תרבית לא מאוזן. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצור: FDB = flexor digitorum brevis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דוגמה למעברי התכווצות סיבים שנמדדו באמצעות מערכת התכווצות מבוססת אופטיקה בעלת תפוקה גבוהה. (A) דוגמה של התכווצות רגילה חולפת. ארעי זה מתקבל מהסרקומרים המוקפים בריבוע הסגול המוצג בסרגל הכלים התחתון. הארעי מורכב מהרכיבים הבאים: אורך סרקומר בקו הבסיס (ירוק), משך התכווצות (כחול), אורך סרקומר בכיווץ מקסימלי (סגול) ומשך הרפיה (אדום). פרמטרים כגון מהירות ואחוז ההתכווצות מחושבים מערכים אלה. (ב) דוגמה להתכווצות לא מספקת חולפת. מדידות אלה מתרחשות כאשר אות הסרקומרה אינו נקלט עקב רעש (ראו חיצים אדומים). (C) דוגמה של ארעי התכווצות שיש לו חפץ תנועה (ראו חיצים ירוקים). תוצרי תנועה מתרחשים כאשר סיב השריר נע מחוץ למוקד במהלך הכיווץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: נתונים מייצגים שהתקבלו באמצעות מערכת התכווצות בתפוקה גבוהה המבוססת על אופטיקה בהשוואה בין תנאים דו-ממדיים לעומת תלת-ממדיים והידרוג'לים שונים . (A) אחוז מדידות ההתכווצות המקובלות והדחיות שמצאה תוכנית ניתוח הנתונים בתרבית דו-ממדית ובתרבות תלת-ממדית המבוססת על 30 מדידות. (B) השוואה של מהירות ההתכווצות המרבית בסיבי שריר בתרבית דו-ממדית ובסיבי שריר בתרבית תלת-ממדית שבודדו משלושה עכברים לאחר 24 שעות של תרבית. (C) השוואה של קיצור הסרקומרה בסיבי שריר בתרבית דו-ממדית ובסיבי שריר בתרבית תלת-ממדית שבודדו משלושה עכברים לאחר 24 שעות של תרבית. (D) השוואה של מהירות ההתכווצות המרבית של סיבי שריר משובצים בממברנת מרתף טהורה (Matrigel) וסיבי שריר משובצים פיברין הידרוג'ל שבודדו משלושה עכברים לאחר 24 שעות של תרבית. (E) השוואה בין קיצור סרקומר של סיבי שריר משובצים בממברנת מרתף טהורה (Matrigel) וסיבי שריר משובצים פיברין הידרוג'ל שבודדו משלושה עכברים לאחר 24 שעות של תרבית. הנתונים נותחו באמצעות מבחן t של סטודנט ומוצגים כממוצע ± SD. כל נקודת נתונים היא סיב שריר אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב מדיום הדיסקציה המשמש לניתוח השריר, מדיום תרבית הפיברין המשמש לתרבית סיבי השריר המבודדים, ומדיום עיכול השריר המשמש לעיכול אנזימטי של השרירים המבודדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: הרכב תערובת התאים המשמשת ליציקת ההידרוג'לים ותערובת המטריצות המשמשת ליציקת ההידרוג'לים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

כאן, אנו מפרטים פרוטוקול לביצוע בידוד אנזימטי ותרבית של סיבי שריר FDB בפורמט תרבית תלת מימדית, ואחריו מדידות התכווצות באמצעות מערכת מדידת כיווץ מבוססת אופטיקה. לפרוטוקול זה מספר יתרונות, כולל 1) בידוד ישיר ובזמן של סיבי שריר שלמים רבים משריר יחיד; 2) הטבעה של סיבי השריר במטריצת הידרוג'ל מתכווננת; 3) ביצוע מדידות התכווצות בתפוקה גבוהה באמצעות המערכת מבוססת האופטיקה; 4) היכולת לבצע מדידות חוזרות ונשנות של אותם סיבי שריר לאחר התערבות. הבידוד של סיבי שריר חיים בודדים מספק תאי שריר בוגרים השומרים על תפקוד ההתכווצות שלהם. מכיוון שסיבי השריר המתקבלים מה- FDB של העכבר קטנים יחסית, הם ניתנים למניפולציה בקלות במהלך הבידוד ושומרים על צורתם הישרה, מה שמאפשר מדידות כיווץ במורד הזרם. למרות שהמערכת פותחה בעיקר כדי לחקור התכווצות קרדיומיוציטים, סיבי שרירי השלד מכילים את אותה מנגנון כיווץ עם דפוס סרקומר שניתן להבחין בו בקלות, ולכן ניתן למדוד אותם גם באמצעות מערכת זו²⁹. הצימוד של מדידות התכווצות של תא בודד עם תרבית סיבי שריר חיה ex vivo הוא כלי רב עוצמה להערכת הבריאות והתפקוד של סיבי שריר בוגרים בתגובה להפעלה חשמלית.

מגבלה בשימוש בסיבי שריר מנותקים היא היעדר כוחות חיצוניים (כלומר, מתיחה פסיבית) המופעלים על הסיבים, מה שמביא לאורכי סרקומר נמוכים יותר במנוחה בהשוואה לאלה הנמצאים in vivo. למרות שאורך סרקומר של 2.4-2.5 מיקרומטר מבטיח ייצור כוח אופטימלי, אורך הסרקומר במנוחה יכול להשתנות מאוד³³. בעוד שאורך הסרקומר במנוחה in vivo של ה-FDB טרם תואר, הנתונים שלנו שלא פורסמו מצביעים על אורך ממוצע של 2.2 מיקרומטר. התוצאות הנוכחיות מראות אורך סרקומר ממוצע במנוחה של ~1.95 מיקרומטר בסיבי FDB פרוקים לאחר 24 שעות בתרבית (איור 3). למרות שאורך סרקומר מנוחה נמוך זה יגרום לייצור כוח נמוך יותר, אורך של ~1.95 מיקרומטר עדיין אמור לייצר >90% מהכוח המרבי³⁴. לכן, אורכי סרקומר אלה צריכים להספיק כדי לקבוע הבדלים בתפקוד הסיבים בין מודלים גנטיים שונים או בעקבות טיפולים תרופתיים. בנוסף, הטבעה של סיבים בהידרוג'ל מספקת נקודות רבות נוספות להידבקות בהשוואה לסיבים דו-ממדיים צפים חופשיים, מה שיגביל את התקצרות נוספת של סרקומר לאורך זמן.

אחד היתרונות של פרוטוקול בידוד סיבי שריר זה הוא השימוש בשריר מהיר קל לניתוח המורכב מסיבי שריר קטנים יחסית בהשוואה לשרירים אחרים, כגון extensor digitorum longus (EDL). גודלם הקטן יותר הופך את בידוד השרירים למתאים יותר להפרדה מבוססת טריטורציה, ובכך מקטין את הסיכוי לנזק הנגרם על ידי פיפט או סבך לסיבי השריר. המטריצה החוץ תאית של שרירי FDB ניתנת לעיכול אנזימטי בקלות עם collagenase, ומאפשרת בידוד של מאות סיבי שריר בפרק זמן קצר. עם זאת, עיכול יתר עלול להוביל לנזק לסיבי השריר. ניתן לזהות את עיכול היתר של סיבי השריר כאשר השריר מתפרק כמעט מיד בעת טריטוציה של השריר או כאשר חלק גדול מנפח התא מתכווץ יתר על המידה במהלך הליך זריעת התא. כדי למנוע עיכול יתר של השריר, זמן העיכול צריך להיות אופטימלי עבור כל אצווה collagenase. כדי לבדוק זאת, שני שרירי FDB צריכים להיות מעוכלים במקביל לזמן עיכול מדורג של 5 דקות ביניהם. יש לבחור את זמן העיכול עם התשואה הגבוהה ביותר של סיבי שריר קיימא. לאחר מכן יש לבצע אופטימיזציה זו פעם נוספת, שוב עם 5 דקות של הפרדה בזמן העיכול. יש להשתמש בזמן העיכול המניב את סיבי השריר בעלי יכולת הקיימא הגבוהה ביותר כזמן העיכול האופטימלי עבור אצווה הנוכחית של collagenase. דרך נוספת להגביל את השונות בין אצווה לאצווה של collagenase תהיה לחשב ישירות את יחידות הפעילות למיליליטר של תמיסת מלאי ולאחר מכן לשחזר את אצוות collagenase הבאות לאותה כמות. לבסוף, ייתכן שיהיה צורך למטב את זמני העיכול בין זני עכברים שונים, לדוגמה, אם חוקרים בעלי חיים זקנים או חולים המציגים שקיעת מטריצה חוץ-תאית מוגברת^35,36.

האפשרות של צנרת סיבי שריר מבודדים קיימא פותחת אפשרויות לתרבית סיבי שריר FDB בתנאי תרבית שונים. אפשרות אחת כזו היא גידול סיבים אלה בהידרוג'לים כדי לחקות את סביבת תרבית הרקמה המקומית. פרוטוקול הטבעה זה מבטיח שהסיבים יישארו במקומם במהלך מדידות ההתכווצות ועבר אופטימיזציה כדי לאפשר לסיבים לשקוע לתחתית הצלחת לפני שהג'ל שוקע. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים פרוטוקול זה כדי להתאים להבדלים במלאי הטרומבין והפיברינוגן. אם פעילות הטרומבין גבוהה מדי, הג'ל ישקע בטרם עת, והסיבים עשויים להישאר תלויים במקומות גבוהים יותר מחוץ למישור המוקד של המיקרוסקופ. אם זה קורה, יחס טרומבין:פיברינוגן צריך להיות מותאם. ניתן לבדוק זאת על ידי ציפוי סיבים בריכוזי טרומבין נמוכים יותר ויותר ולשים לב כמה זמן לוקח הפילמור. בדרך כלל, זה לא אמור לקרות מהר יותר מ -30 דקות. עם זאת, ריכוז תרומבין נמוך מדי עלול גם לפגוע בתהליך פילמור. שיטה נוספת לוודא שהסיבים נמצאים במישור המוקד הנכון היא לזרוע אותם תחילה באמצעות פרוטוקול דו-ממדי ולאחר מכן להוסיף שכבת הידרוג'ל על הסיבים לאחר שהם נצמדו לצלחת התרבית. עם זאת, יש להיות מודעים לכך שהסרת התווך מהסיבים עלולה לגרום להתכווצות יתר, שכן הם רגישים להתייבשות. כמו כן, לא ברור אם ההידרוג'ל יתחבר במלואו לצלחת התרבית, והוא עשוי להשתחרר בקלות רבה יותר. לכן, הליך הטמעה זה עדיף לשמירה על סיבים בני קיימא ובמקום למדידות התכווצות.

השימוש בפרוטוקול זה מאפשר לחקור את דינמיקת ההתכווצות של סיבי שריר בוגרים ex vivo וניתן ליישם אותו הן על עכברים בריאים והן על אלה הנושאים מוטציות גנטיות למחלות שרירים. כמו כן, הוא מאפשר לבחון כיצד תנאי תרבית או תוספת של תרכובות משפיעים על תפקוד סיבי השריר. נתוני ההתכווצות המתקבלים באמצעות המערכת מבוססת האופטיקה נותנים אינדיקציה ליכולת ההתכווצות של סיבי שריר בודדים חיים, ושינויים ביכולת זו יכולים להיות מתואמים לבריאות הסיבים. עם זאת, נתונים אלה לבדם אינם מספיקים כדי לקבוע אם שינויים אלה מתרחשים בשלבי הגישור הצולב, אקטין מיוזין או שחרור סידן של התכווצות שרירים. למרות שאיננו מתארים שיטות למדידת איתות סידן בפרוטוקול זה, מערך זה מסוגל גם למדוד מעברי סידן מבוססי פורה בתאי שריר מתכווצים²⁹. החיסרון של מערכת זו הוא ששריר FDB מכיל רק סיבי שריר מסוג IIa/IIx מהירים, ושרירים המכילים סיבים מסוג I בגודל זה טרם תוארו³⁷. זה מבטל את היכולת לחקור תפקוד ספציפי לסוג הסיבים באמצעות שיטה זו. הפרוטוקול שאנו מציעים כאן יכול להיות מותאם באופן פוטנציאלי לשרירים אחרים כגון EDL או הסולאוס כדי לחקור הבדלים בין סוגי סיבים. בשל גודלם הגדול יותר, פרוטוקול זה יצטרך להיות מותאם עוד יותר עבור שרירים אלה. סיבים ארוכים יותר נוטים להסתבך במהלך שלב שקיעת הכבידה וייקרעו אם יטופלו על ידי פיפט, מה שיוביל ליבול נמוך יותר. בשל חוסר התאימות שלהם עם pipetting, סיבים ארוכים יותר, ולכן, הם גם פחות תואמים את טכניקת הטבעה ג'ל. מדידות של סיבים אלה עדיין יכולות להיעשות בפורמט תרבית דו-ממדית, אך הסיבים עשויים לנוע יותר במהלך ההתכווצות בשל גודלם, ובכך להשפיע על יחס האות לרעש. מגבלה נוספת של מערכת זו היא חוסר היכולת לבצע מדידות כוח לצד מדידות הכיווץ, כגון מדידות הכוח שניתן לקבל באמצעות תכשירים אחרים מסיבי שריר שלמים²⁸. עם זאת, מגבלה זו ניתן לעקוף על ידי הערכת הכוח שנוצר על ידי סיבי השריר. ניתן להעריך את הכוח שנוצר של סיבי השריר אם צורת סיבי השריר במהלך מצבים מכווצים ורגועים, כמו גם מודולוס יאנג של המטריצה, ידועים²⁵. עם זאת, מערכת אופטית זו מספקת גישה קלה לשימוש ובעלת תפוקה גבוהה לחקר תפקוד כיווץ השרירים ופותחת מגוון אפשרויות חדשות לחקר מחלות שרירים גנטיות והתערבויות טיפוליות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aprotinin, from Bovine Lung	Thermo Scientific	AAJ63039MC	100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C.  Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Collagenase type 2	Worthington	77336	10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous.
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fibrinogen from Bovine Plasma	Sigma Aldrich	50-176-5054	20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher	A1413201	4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C.
Gibco MEM High glucose + pyruvate	Thermo Fisher	11095080
Horse serum	Thermo Fisher	H1270
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning	CB-40230	4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C.
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Serum Replacement 2 (50x)	Sigma Aldrich	S9388
Thrombin, Bovine Plasma	Thermo Scientific	AAJ63383EXP	125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Tranexamic Acid	Thermo Scientific	AC228042500	80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C.  Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Equipment
24-well electrical stimulator	IonOptix	N/a
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
MultiCell Cytocypher	IonOptix	N/a
MyoCam-S3	IonOptix	N/a
MyoPacer	IonOptix	N/a
SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent	Dow corning	N/a
Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15002-08
Software
CytoSolver	IonOptix	N/a
IonWizard	IonOptix	N/a