Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להדמיה ישירה של פעילויות מטבוליות בתאים המווסתים על ידי חומצות אמינו באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (DO-SRS) המשולב במיקרוסקופ פלואורסצנטי עירור של שני פוטונים (2PEF).

Abstract

חומצות אמינו ארומטיות חיוניות (AAAs) הן אבני בניין לסינתזה של ביומסות חדשות בתאים ולשמירה על תפקודים ביולוגיים תקינים. לדוגמה, אספקה שופעת של AAAs חשובה לתאים סרטניים כדי לשמור על הצמיחה והחלוקה המהירה שלהם. עם זאת, יש ביקוש גובר לגישת הדמיה ספציפית מאוד, לא פולשנית עם הכנת דגימה מינימלית כדי לדמיין ישירות כיצד תאים רותמים AAAs עבור חילוף החומרים שלהם באתרו. כאן, אנו מפתחים פלטפורמת הדמיה אופטית המשלבת חיטוט תחמוצת דאוטריום (D2O) עם פיזור ראמאן מגורה (DO-SRS) ומשלבת DO-SRS עם פלואורסצנטיות עירור של שני פוטונים (2PEF) במיקרוסקופ יחיד כדי להמחיש ישירות את הפעילות המטבולית של תאי HeLa תחת רגולציה AAA. באופן קולקטיבי, פלטפורמת DO-SRS מספקת רזולוציה מרחבית גבוהה וספציפיות של חלבונים ושומנים מסונתזים חדשים ביחידות תא HeLa יחיד. בנוסף, מודל 2PEF יכול לזהות אותות אוטופלואורסצנטיים של ניקוטין-אמיד אדנין די-נוקלאוטיד (NADH) ופלבין באופן נטול תוויות. מערכת ההדמיה המתוארת כאן תואמת הן למודלים במבחנה והן למודלים in vivo , שהיא גמישה לניסויים שונים. זרימת העבודה הכללית של פרוטוקול זה כוללת תרבית תאים, הכנת מדיה לתרבית, סנכרון תאים, קיבוע תאים והדמיית דגימה בשיטות DO-SRS ו-2PEF.

Introduction

להיות חומצות אמינו ארומטיות חיוניות (AAAs), פנילאלנין (Phe) וטריפטופן (Tryp) יכול להיספג על ידי גוף האדם כדי לסנתז מולקולות חדשות לקיום פונקציות ביולוגיות נורמליות1. Phe נדרש לסינתזה של חלבונים, מלנין וטירוזין, ואילו Tryp נדרש לסינתזה של מלטונין, סרוטונין וניאצין 2,3. עם זאת, צריכה עודפת של AAAs אלה יכולה לווסת את המטרה של יונקים במסלול רפמיצין (mTOR), לעכב קינאז חלבון המופעל על ידי AMP, ולהפריע לחילוף החומרים במיטוכונדריה, לשנות באופן קולקטיבי את הביוסינתזה של מקרומולקולות ולהוביל לייצור של מבשרים ממאירים, כגון מיני חמצן תגובתי (ROS) בתאים בריאים 4,5,6. הדמיה ישירה של דינמיקה מטבולית משתנה תחת עודף רגולציה AAA חיונית כדי להבין את תפקידם של AAA בקידום התפתחות סרטן וצמיחה של תאים בריאים 7,8,9.

מחקרי AAA מסורתיים מסתמכים על כרומטוגרפיית גז (GC)10. שיטות אחרות, כגון דימות תהודה מגנטית (MRI), הן בעלות רזולוציות מרחביות מוגבלות, דבר המקשה על ביצוע אנליזה תאית ותת-תאית של דגימות ביולוגיות11. לאחרונה, סופח/יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) פותח כדי להבהיר את התפקיד של AAAs בסינתזות שומנים וחלבונים בהתפשטות סרטן עם סמנים ביולוגיים לא פולשניים12,13,14. עם זאת, טכניקה זו עדיין סובלת מעומקי הדמיה רדודים, רזולוציה מרחבית ירודה והכנת דגימות נרחבת. ברמה התאית, ניתן לעקוב אחר איזוטופים יציבים לא רעילים, כגון חנקן-15 ופחמן-13, באמצעות הדמיה מרובת איזוטופים וספקטרומטריית מסות יונים משנית ננומטרית כדי להבין את שילובם במקרומולקולות. עם זאת, שיטות אלה הרסניות לדגימות ביולוגיות חיות15,16. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא טכניקה רבת עוצמה נוספת שיכולה לדמיין דינמיקה מטבולית17. קצב הסריקה האיטי במהלך דימות AFM, לעומת זאת, עלול לגרום לעיוות תמונה כתוצאה מסחיפה תרמית.

פיתחנו שיטת הדמיה דו-אורתוגונלית לא פולשנית על-ידי צימוד תחמוצת דאוטריום (D2O), מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (DO-SRS) ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של עירור שני פוטונים ללא תוויות (2PEF). שיטה זו משיגה רזולוציה מרחבית גבוהה וספציפיות כימית בעת הדמיה של דגימות ביולוגיות 18,19,20,21,22,23,24. פרוטוקול זה מציג את היישומים של DO-SRS ו- 2PEF כדי לבחון את הדינמיקה המטבולית של שומנים, חלבונים ושינויים ביחס חמצון-חיזור במהלך התקדמות סרטן. כאשר D2O הוא צורה איזוטופית יציבה של מים, ביומולקולות תאיות יכולות להיות מסומנות בדאוטריום (D) בשל הפיצוי המהיר שלו עם סך כל מי הגוף בתאים, ויוצרים קשרי פחמן-דאוטריום (C-D) באמצעות חילופי אנזימטיים21. קשרי C-D במקרומולקולות מסונתזות חדשות, כולל שומנים, חלבונים, דנ"א/רנ"א ופחמימות, ניתנים לזיהוי באזור הדממה התאית של ספקטרום ראמאן 20,21,22,25,26,27. עם שני פולסי לייזר מסונכרנים, קשרי C-D של ליפידים וחלבונים מסונתזים חדשים יכולים להיות מוצגים על תאים בודדים באמצעות הדמיה היפרספקטרלית (HSI) מבלי לחלץ או לתייג אותם עם חומרים ציטוטוקסיים. בנוסף, למיקרוסקופ SRS יש את היכולת לבנות מודלים תלת מימדיים (3D) של אזורים נבחרים בעלי עניין בדגימות ביולוגיות על ידי לכידת ושילוב קבוצה של תמונות חתך22,26. עם הדמיה נפחית היפרספקטרלית ותלת-ממדית, DO-SRS יכול להשיג התפלגות מרחבית של מקרומולקולות מסונתזות חדשות בתאים בודדים, יחד עם סוג האברונים המאפשרים את תהליך קידום צמיחת הסרטן תחת תקנה22 של AAA. יתר על כן, באמצעות 2PEF, אנו יכולים לקבל אותות אוטופלואורסצנטיים של פלבין וניקוטין-אמיד אדנין דינוקלאוטיד (NADH) ברזולוציה גבוהה, עומק חדירה עמוק ונזק ברמה נמוכה בדגימות ביולוגיות21,23,24. אותות אוטופלואורסנציה של פלבין ו- NADH שימשו לאפיון הומאוסטזיס חמצון-חיזור וחמצון שומנים בתאי סרטן22,26. ככזה, לא רק שהצימוד של DO-SRS ו-2PEF מספק אנליזה תת-תאית של דינמיקה מטבולית מווסתת AAA בתאים סרטניים עם פיזור מרחבי גבוה, מידע על ספציפיות כימית והכנת דגימה מינימלית, אלא שהשיטה גם מפחיתה את הצורך לחלץ או לתייג מולקולות אנדוגניות בריאגנטים רעילים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים תחילה את ההליכים של D2O והכנת חומצות אמינו, כמו גם תרבית תאים סרטניים. לאחר מכן, אנו מראים את הפרוטוקולים של דימות DO-SRS והדמיית 2PEF. לבסוף, אנו מציגים את התוצאות המייצגות של SRS והדמיית 2PEF, המדגימות שינויים מטבוליים מווסתים AAA של שומנים וחלבונים, ושינויים ביחס חמצון-חיזור בתאים סרטניים. המחשה מפורטת של התהליך מודגשת באיור 1.

Protocol

1. הכנת מדיה

  1. הכינו 10 מ"ל של בקרה ועודף AAAs בתווך הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) המכיל 50% D2O.
    1. עבור אמצעי הבקרה, למדוד ולערבב 10 מ"ג של אבקת DMEM עם 4.7 מ"ל של מים מזוקקים כפול (ddH2O) בצינור חרוטי 15 מ"ל. אבקת DMEM מכילה את כל חומצות האמינו בריכוזים סטנדרטיים. מערבלים היטב והופכים את הצינור כדי להבטיח שהפתרון מעורבב היטב. הוסף 4.7 מ"ל של D2O, 0.5 מ"ל של נסיוב בקר עוברי (5% FBS), ו 0.1 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין (1%). מערבלים היטב והופכים את הצינור כדי להבטיח שהפתרון מעורבב היטב.
    2. עבור מדיום הטיפול 15x Phe, למדוד ולערבב 10 מ"ג של אבקת DMEM עם 4.7 מ"ל של ddH2O, 0.5 מ"ל של FBS (5%), ו 0.1 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין (1%) בצינור חרוטי 15 מ"ל. מערבלים היטב והופכים את הצינור כדי להבטיח שהפתרון מעורבב היטב. מוסיפים את עודפי אבקת ה-Phe בריכוז של 924 מ"ג/ליטר למדיום. מערבלים היטב והופכים את הצינור כדי להבטיח שהפתרון מעורבב היטב.
    3. עבור מדיום טיפול Tryp 15x, למדוד ולערבב 10 מ"ג של אבקת DMEM עם 4.7 מ"ל של ddH2O, 0.5 מ"ל של FBS (5%) ו 0.1 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין (1%) בצינור חרוטי 15 מ"ל. מערבלים היטב והופכים את הצינור כדי להבטיח שהפתרון מעורבב היטב. מוסיפים את עודפי אבקת Tryp בריכוז של 224 מ"ג/ליטר למדיום. מערבלים היטב והופכים את הצינור כדי להבטיח שהפתרון מעורבב היטב.
    4. הוסף מתיונין ותראונין במינון של 30.0 מ"ג/מ"ל ו-95.0 מ"ג/מ"ל, בהתאמה, לכל הצינורות החרוטיים של השלבים הקודמים. מערבלים היטב והופכים את הצינור. אין צורך להוסיף נתרן פירובט לאמצעי התרבות.
    5. סנן את אמצעי הבקרה והטיפול באמצעות מסנן מזרקים בקוטר 25 מ"מ עם מסנני קרום פוליאתרסולפון 0.22 מיקרומטר.
    6. אטמו את כל הצינורות החרוטיים המכילים מדיה עם פרפילם ואחסנו ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות. לפני טיפול בתאים עם מדיה, לחמם את כל המדיה ל 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש למדוד ולשלב את ריאגנטים אבקתיים ונוזליים בהתבסס על הנפח הכולל של אמצעי הטיפול והבקרה.

2. הכנת דגימת תאים

  1. שמור על תאי סרטן צוואר הרחם (HeLa) בבקבוק תרבית (כלומר, T10, T25 וכו ') באמצעות DMEM סטנדרטי בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° C ו 5% פחמן דו חמצני (CO2).
  2. תרבית משנה של תאי HeLa ביחס פיצול של 1:10 עד הגעה ל-80% או יותר כדאיות תאים.
  3. לאחר שהתאים משיגים מפגש של 80% ומעלה, המשיכו לזרוע 2 x 105 תאים לכל באר על צלחת של 24 בארות באמצעות DMEM בתוספת 0.5% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    1. לפני זריעת התא, להכין צלחת 24 באר עם מעוקר, poly-d-lysin, מצופה למינין, כיסויים עגולים, בקוטר 12 מ"מ. יש לטבול את הכיסויים באתנול 70% ולייבש בעדינות באמצעות מגבונים ללא סיבים. מניחים את הכיסויים הנקיים בבארות המתאימות של הצלחת.
    2. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80% בשלב 2.2, שטפו את התאים פעם אחת עם 1x פוספט מלח חוצץ (PBS) ללא יוני מגנזיום וסידן.
    3. הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק את התאים הדבקים מהבקבוק ולדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 3 דקות.
    4. הוסף DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, פיפטה עדינה למעלה ולמטה, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות.
    5. להשהות מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת 0.5% FBS ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    6. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, מיקרוסקופ אור וטריפאן כחול, וזרעו צפיפות של 2 x 105 תאים לכל באר של צלחת 24 באר. לחלופין, ניתן להשתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים.
    7. החזירו את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2, ונערו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה.
  4. לאחר 8 שעות, החלף את מדיית התרבות הישנה במדיית 50% D 2 O/עודף Phe או 50% D2O/עודף מדיית טריפ (Tryp media). להחזיר את התאים לאינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 36 שעות.
  5. לאחר 36 שעות, תקן את התאים בשקופיות מיקרוסקופ.
    1. לפני התיקון, הכינו שקופיות מיקרוסקופ עם ספייסרים להדמיה בקוטר 9 מ"מ והניחו 15 μL של 1x PBS בתוספת יוני סידן ומגנזיום.
    2. שטפו את התאים עם 1x PBS בתוספת יוני סידן ומגנזיום.
    3. הוסיפו 0.5 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) 4% נטולת מתנול והשאירו את הצלחת מתחת למכסה המנוע למשך כ-15 דקות.
    4. יש לשאוף את תמיסת ה-PFA ולשטוף עם 1x PBS בתוספת יוני סידן ומגנזיום פעמיים.
    5. הוסף 1.5 מ"ל של 1x PBS בתוספת יוני סידן ומגנזיום בכל באר.
    6. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא בעדינות את הכיסויים מכל באר. הפוך והנח את הצד המכיל את התא של הכיסויים על מרווחי ההדמיה כדי ליצור קשר עם PBS שהוכן בשלב 2.5.1. ודא שהצד שאינו מכיל תאים חשוף לאוויר.
    7. בעזרת לק שקוף, אטמו את השכבה החיצונית של הכיסוי בעזרת ספייסר ההדמיה.
  6. אחסנו את שקופיות המיקרוסקופ בטמפרטורה של 4°C כאשר לא מדובר בהדמיה.

3. מדידת ספקטרוסקופיית ראמאן ספונטנית (איור 2)

  1. השתמשו במיקרוסקופ ראמאן קונפוקלי כדי לקבל ספקטרום ראמאן ספונטני (איור 2A).
  2. הפעל את הלייזר על-ידי סיבוב המקש למצב ON .
  3. לחץ פעמיים על סמל התוכנה LabSpec6 כדי לפתוח את תוכנת הרכישה.
  4. יש להעמיס את הדגימה הביולוגית על מחזיק הדגימה ישירות מתחת לעדשת המטרה.
  5. בתוכנה, לחץ על מצלמה סמל כדי להפעיל את מצלמת הווידאו.
  6. כוונן את מישור המיקוד כדי לזהות אזור עניין באמצעות עדשת האובייקט 50x. הזז את הג'ויסטיק כדי לשלוט בתרגום המתכנן של שלב XY וסובב את הג'ויסטיק כדי לשנות את עומק המיקוד.
  7. לאחר בחירת המיקום למדידה, עבור לעדשת 100x אובייקטיבית עם 40 mW של כוח עירור. לחץ על סמל העצירה האדום כדי לכבות את מצלמת הווידאו.
  8. בחר סורג של 1800 שורות למ"מ והגדר את טווח הרכישה מ- 400 ס"מ-1 עד 3,150 ס"מ-1.
  9. הגדר את זמן הרכישה ל- 90 שניות, את ההצטברות ל- 3 ואת הבינינג ל- 4 לקבלת הרעש הנמוך ביותר והספקטרום המדויק ביותר.
    הערה: ניתן למטב פרמטרי הדמיה אלה כך שיתאימו לניסוי.
  10. לחץ על סמל החץ כדי להפעיל את התצוגה בזמן אמת.
  11. כוונן את היסט הרמאן (cm-1) לערך לפי בחירה כדי לכוונן את מישור המיקוד.
    הערה: בניסוי זה, לייזר הרמאן התמקד בטיפות השומנים, שהכילו ריכוז גבוה של קשרי CH2 . לכן, נבחרה לשם כך הסטת ראמאן של 2,850 ס"מ-1 שתאמה את מצבי המתיחה של קשר CH2 .
  12. כוונן את מישור המיקוד באמצעות הג'ויסטיק כדי למטב את יחס האות לרעש הטוב ביותר.
  13. לאחר בחירת מישור המיקוד, לחץ על סמל העצירה האדום לקבלת תצוגה בזמן אמת.
  14. בחר בסמל העיגול כדי להתחיל את רכישת הספקטרום.
  15. לאחר שהאזור התאי נלקח, השתמש באותו מישור מיקוד כדי למדוד את הרקע באמצעות PBS. החסרו את ספקטרום הרקע מכל ספקטרום מטרה תת-תאי באמצעות יישום תוכנת מחשב נפרד, כגון Origin (איור 1B).

4. ניסויי הדמיה עם 2PEF ו-SRS

הערה: תיאורים מפורטים של יישור לייזר SRS ניתן למצוא בדוח קודם28. פרוטוקול זה מתמקד בפעולה של SRS רב-מודאלי ומערכת הדמיה 2PEF (איור 2C, D).

  1. לחץ על התחל כדי לחמם את הלייזר.
  2. בצע את הפקודה כדי להגדיר את המתגים הראשיים של יחידת הבקרה והצג על: 1) לחץ על המתג הראשי של תיבת הבקרה IX3-CBH למצב מופעל, 2) לחץ על המתג הראשי של בקר לוח המגע למצב מופעל, 3) לחץ על המתג הראשי של מתאם החשמל של ספק הכוח עבור שלט לייזר LD OBIS 6 המחובר לשילוב הלייזר הראשי FV31-SCOMB למצב מופעלו- 4) לחץ על המתג הראשי של מתאם החשמל של ספק הכוח עבור LD OBIS 6 Laser Remote המחובר לשילוב הלייזר המשני FV31-SCOMB למצב מופעל.,
  3. לחץ על המתגים הראשיים של גלאי הפוטודיודה Si ומגבר הנעילה מופעל.
  4. הגדר את קרן סטוקס על 1,031 ננומטר, רוחב פולס על 6 ps, וקצב חזרה על 80 MHz.
  5. יחד עם המיקרוסקופ, הגדר את מערכת picoEmerald שסופקה עם קרן המשאבה המסונכרנת עם אורך גל Tunable מ 720-990 ננומטר, רוחב פולס של 5-6 ps, וקצב חזרה של 80 MHz. כוח העירור הממוצע הן של המשאבה והן של סטוקס הוא 450 mW. מטב את עוצמת העירור כדי למזער את נזקי האור לדגימה.
  6. השתמש במעבה שמן בעל צמצם מספרי גבוה (NA) (כלומר, 1.4 NA) כדי לאסוף את הסטוקס ולשאוב אלומות שבהן הדגימה מורכבת על ידי פליטת כמה טיפות על המעבה.
  7. הרכיבו את הדגימה על השמן והניחו טיפת מים גדולה על גבי שקופית המיקרוסקופ שבה הדגימה קבועה. זה עבור עדשה אובייקטיבית טבילה במים.
  8. הגדר את מגבר הנעילה ל- 20 MHz. עבד את התמונה כעת באמצעות מודול התוכנה ברזולוציית על.
  9. בחר 512 פיקסלים x 512 פיקסלים ו- 80 μs לפיקסל למשך זמן השהייה.
  10. ברגע שהאזור התאי הרצוי ממוקד כראוי, רכשו את התמונה. באמצעות תוכנת הרכישה של המיקרוסקופ, שמור את התמונות כקובץ גרפי .oir של אולימפוס.
  11. קבל תמונת רקע בגודל 1,900-1 והחסר אותה מכל התמונות הסלולריות.
  12. כדי לבצע הדמיית 2PEF, השתמש באותו לייזר פיקו-שניות מתכוונן, והגדר את הפלואורסצנטיות האוטומטית נטולת התוויות של Flavin ו-NADH ל-800 ננומטר ו-780 ננומטר, בהתאמה.
  13. השתמש בקוביית מסנן של 460 ננומטר/515 ננומטר כדי לאסוף את הפליטה האוטופלואורסצנטית של Flavin ו- NADH.
  14. התאם את זמן השהייה ל- 8 μs לפיקסל ואת גודל הפיקסלים ל- 512 פיקסלים x 512 פיקסלים. הגדר את פרמטר עוצמת תריס הלייזר ל- 150 mW.
  15. לשחזור תמונה תלת-ממדית, כוונן את אובדן הרמאן המגורה ל-2,850 ס"מ-1 (797 ננומטר).
  16. לאחר זיהוי התאים הבודדים הרצויים, רשום את הלייזר כדי לסרוק ממישור המיקוד העליון כדי לזהות את השכבות העליונות והתחתונות של תאים אלה.
    הערה: מודלים תלת-ממדיים נוצרים ונשמרים כקבצי .oir.

5. ספקטרום וניתוח תמונה

  1. ניתוח ספקטרום
    1. השתמש בתוכנת Origin או ביישומים רלוונטיים אחרים כדי להחסיר את ספקטרום הרקע מכל ספקטרום המטרה התת-תאי.
    2. השתמשו בפעולות המידול המתמטי של MATLAB כדי לעבד את ספקטרום הרמאן עם הפונקציות המובנות של התוכנה. Python יכול לשמש גם לעיבוד ספקטרה.
      1. עיבוד מקדים ספקטרלי מתחיל בהמרת הקבצים למערך. הספקטרום עובר אינטרפולציה בכל סנטימטר הדדי.
      2. לצורך אימות, צור תרשים של הנתונים הגולמיים. בצע את תיקון קו הבסיס בספקטרום הגולמי באמצעות הפונקציה המובנית msbackadj ב- MATLAB. בקצרה, הפונקציה המוכללת מעריכה נקודות בסיס בערכי יחידת הפרדה שזוהו על-ידי המשתמשים ומחזירה את המרחק בין חלונות סמוכים. מנקודות הבסיס, להעריך ולצייר קו רגרסיה. החל החלקה כדי להחליק את קו הרגרסיה כדי להפחית את קו הבסיס מכל ספקטרום גולמי בודד.
      3. בצע נורמליזציה מינימלית מקסימלית על ידי חלוקת עוצמת הרמאן של החלבון ב 2,930 cm-1 בעוצמה של כל שינוי ראמאן. האות 2,930 ס"מ-1 הוא בדרך כלל העוצמה הגבוהה ביותר בספקטרום הרמאן. עם נורמליזציה זו, הערך המרבי הופך ל- 1 ואילו הערך המינימלי הופך ל- 0. כל ערך אחר הופך לנקודה עשרונית בין 0 ל- 1.
      4. ממוצע הספקטרום הבודד של אותו מצב לספקטרום יחיד כדי להפחית רעש.
    3. לאחר העיבוד, השתמש ביישומים, כגון Origin, כדי להציג את כל הספקטרום בו-זמנית. הפסגות המוצגות בספקטרום מייצגות קשר כימי מסוים או קבוצה פונקציונלית מסוימת.
  2. ניתוח תמונה תלת מימדית של טיפות שומנים
    1. השתמש בתוכנת FIJI-ImageJ כדי לעבד את כל התמונות התלת-ממדיות
    2. בצע את הפונקציות: מסנני Bandpass והחלקה עבור אוספי התמונות התלת-ממדיים.
    3. לניתוח תמונה תלת-ממדית, הקצו כל טיפת שומנים לציון כדורי המחושב על ידי מדידת המרחק בין מרכז המסה שלה למשטח. השווה כל ציון כדורי עם ציון כדורי של כדור מושלם באותה תוכנית אוקלידית. השליכו טיפות שומנים עם ציונים כדוריים נמוכים והעריכו את טיפות השומנים הנותרות לפי נפחן וספירתן.
    4. לנתח את הנפח והספירה של טיפות שומנים בין טיפולים שונים לקבלת מובהקות סטטיסטית ביישום תוכנה סטטיסטי מתאים. כאן, GraphPad פריזמה שימש.
  3. ניתוח תמונה היפרספקטרלי דו-ממדי
    1. השתמש בתוכנת FIJI-ImageJ כדי לעבד את כל התמונות ההיפרספקטרליות הדו-ממדיות.
    2. בחרו בערוץ בגודל 2,930 ס"מ-1 ליצירת תמונת מסיכה הכוללת ערכים 0 ו- 1. הקצה את הרקע ל- 0 ואת האזור הסלולרי ל- 1.
    3. הפחת את תעלת החלבון המסומנת בדאוטריום (2,175 cm-1) לתעלת הרקע (1,900 cm-1) כדי להסיר את ההשפעות הפלואורסצנטיות.
    4. חלק את תעלת החלבון המסומנת בדאוטריום המתקבלת בתעלת החלבון (2,930 ס"מ-1) כדי לקבל תמונות יחסיות של קצב תחלופת החלבון.
    5. לאחר מכן, הכפילו את תמונת המסיכה שנוצרה בשלב 5.3.2 בתמונות היחסיות כדי להסיר רעשי רקע שנותרו. כתוצאה מכך, נוצר רקע כהה בכל תמונה ביחס יחסים.
    6. השתמש בכלי בחירה חופשית ב- FIJI-ImageJ כדי לפלח ולחשב ידנית עוצמות פיקסלים המוצגות בתאים בודדים. עוצמות הפיקסלים תואמות את ריכוזי הקשר הכימי המוצג לעין.
    7. נתח את עוצמות הפיקסלים לקבלת מובהקות סטטיסטית ביישום תוכנה סטטיסטי מתאים. כאן, GraphPad פריזמה שימש. חזור על ניתוח זה עם הניתוח היחסי הנותר.

תוצאות

התוספת של עודפי AAA בריכוזים של פי 15 למדיה של תרבית תאים המכילה 50% D2O יצרה רצועות C-D ראמאן נפרדות של ליפידים וחלבונים מסונתזים חדשים בתאי HeLa (איור 2B). ניסויים קודמים בוצעו עם רמות ריכוז שונות, כגון 2x ו- 5x, ולמרות שהנתונים אינם מוצגים, ריכוז 15x יצר את רצועות C-D Raman המובהקות בי?...

Discussion

הדמיית DO-SRS ו-2PEF יושמה כדי לחקור דינמיקה מטבולית במודלים שונים של ex vivo, כולל דרוזופילה ורקמות אנושיות 21,22,23,24,26,27,33. שיטת ההדמיה המשמשת במחקר זה משלבת DO-SRS ומיק?...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר יג'ואן לי ואנתוני פונג על תמיכתם הטכנית, ולמעבדת Fraley על קו התאים. אנו מודים לקרנות הסטארט-אפ של UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 ופרס עמית הלמן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Serological Pipettes Avantor (by VWR)75816-100https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge TubeVWR89039-664https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-freeThermoFisher Scientific28906https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plateFisherbrandFB0112929https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PESFoxx Life Sciences381-2216-OEMhttps://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter CubeOlympusOCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser RemoteOlympusSupply power to the laser
Band-pass FilterKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm Terminator Mini CircuitsSTRM-50
BNC CableThorlabs2249-CCoaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric MirrorThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
Centrifuge
CondenserOlympus
Cover GlassCorning2850-25https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supplyTopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagentmpbio 196055https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium PyruvateMilliporeSigma38210000https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate 
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumCorningMT10027CVhttps://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJImageJVersion 1.53t 24 August 2022https://imagej.net/software/fiji/downloads
Heavy Water (Deuterium Oxide)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.7732-18-5https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela CellsATCCCCL-2https://www.atcc.org/products/ccl-2
HemocymeterMilliporeSigmaZ359629-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass FilterChroma TechnologyET890/220mFilter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)Cytiva SH300880340https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) SolutionCytivaSH30042.02https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser SystemApplied Physics & Electronics, Inc.picoEMERALDpicoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning MicroscopeOlympusFV1200MPE
IX3-CBH Control boxOlympusControl the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror MountThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Low-Profile Hex Adjusters
L-PhenalynineSigmaP5482-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-TryptophanSigmaT8941-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6Horiba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In AmplifierZurich InstrumentsN/Ahttps://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam SplitterSemrockDi02-R980-25x36980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLABMathWorksVersion: R2022bhttps://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope SlidesFisherbrand12-550-003https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging SoftwareOlympusFluoView
MPLN 100x, OlympusOlympusMPLAPONhttps://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, OlympusOlympusMPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil CondenserOlympus 6-U130https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail PolishWet n WildB01EO2G5O4https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
OriginOriginLabOrigin 2022b (9.95)https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
ParafilmFisher ScientificS37440https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)Thermofischer - Gibco14040117https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/StreptomycinThermofischer - Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope AssemblyThorlabsRS99Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald SystemA.P.EN/Ahttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC ConnectorsPomona Electronics2902Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode DetectorHome BuiltN/ADYI series
Silicon Wafer
SpacersGrace Bio-Labs654008https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopyHoriba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering MicroscopyHome BuiltN/A
Touch  Panel ControllerOlympusControl the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) Lonza17-942Ehttps://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
TweezersKaverme - AmazonB07RNVXXV1https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Two Photon Excitation Fluorescence MicroscopyHome BuiltN/A
Weighing Paper VWR12578-165https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich LabOneQ SoftwareZurich InstrumentsControl the Zurich lock-in amplifier

References

  1. Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
  2. Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837 (2020).
  3. Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
  4. Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
  5. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  6. Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
  7. Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
  8. Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
  9. Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
  10. Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
  11. Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. The potential of metabolic imaging. Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).
  12. Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
  13. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
  14. Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
  15. Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
  16. Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
  17. Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
  18. Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
  19. Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
  20. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  21. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  22. Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
  23. Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
  24. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
  27. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
  28. Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
  29. Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
  30. Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
  31. Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
  32. Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
  33. Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
  34. Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
  35. Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
  36. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging. bioRxiv. , (2022).
  37. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  38. Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
  39. Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved