Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos

Resumo

Apresentamos um protocolo para visualizar diretamente as atividades metabólicas em células reguladas por aminoácidos usando microscopia Raman estimulada de espalhamento Raman estimulado com óxido de deutério (água pesada D₂O) (DO-SRS), que é integrada à microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (2PEF).

Resumo

Aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs) são blocos de construção para sintetizar novas biomassas em células e sustentar funções biológicas normais. Por exemplo, um suprimento abundante de AAAs é importante para que as células cancerosas mantenham seu rápido crescimento e divisão. Com isso, há uma demanda crescente por uma abordagem de imagem altamente específica, não invasiva, com preparação mínima da amostra para visualizar diretamente como as células aproveitam os AAAs para seu metabolismo in situ. Aqui, desenvolvemos uma plataforma de imagem óptica que combina sondagem de óxido de deutério (D₂O) com espalhamento Raman estimulado (DO-SRS) e integra DO-SRS com fluorescência de excitação de dois fótons (2PEF) em um único microscópio para visualizar diretamente as atividades metabólicas das células HeLa sob regulação AAA. Coletivamente, a plataforma DO-SRS fornece alta resolução espacial e especificidade de proteínas e lipídios recém-sintetizados em unidades únicas de células HeLa. Além disso, a modalidade 2PEF pode detectar sinais de autofluorescência de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e Flavina de forma livre de marcação. O sistema de imagem aqui descrito é compatível com modelos in vitro e in vivo , o que é flexível para vários experimentos. O fluxo de trabalho geral deste protocolo inclui cultura celular, preparação de meios de cultura, sincronização celular, fixação celular e imagem de amostra com as modalidades DO-SRS e 2PEF.

Introdução

Sendo aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs), fenilalanina (Phe) e triptofano (Tryp) podem ser absorvidos pelo organismo humano para sintetizar novas moléculas para sustentar funções biológicas normais¹. Phe é necessário para a síntese de proteínas, melanina e tirosina, enquanto Tryp é necessário para a síntese de melatonina, serotonina, e niacina ^2,3. No entanto, o consumo excessivo desses AAAs pode regular o alvo mamífero da via da rapamicina (mTOR), inibir a proteína quinase ativada por AMP e interferir no metabolismo mitocondrial, alterando coletivamente a biossíntese de macromoléculas e levando à produção de precursores malignos, como espécies reativas de oxigênio (EROs) em células saudáveis ^4,5,6. A visualização direta da dinâmica metabólica alterada sob regulação excessiva do AAA é essencial para entender o papel dos AAA na promoção do desenvolvimento do câncer e do crescimento de células saudáveis ^7,8,9.

Os estudos tradicionais de AAA baseiam-se na cromatografia gasosa (GC)¹⁰. Outros métodos, como a ressonância magnética (RM), têm resoluções espaciais limitadas, dificultando a análise celular e subcelular de amostras^{biológicas11}. Recentemente, a dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) foi desenvolvida para elucidar o papel dos AAAs na síntese lipídica e proteica na proliferação do câncer com biomarcadores não invasivos12,13,14. No entanto, essa técnica ainda sofre com profundidades de imagem rasas, baixa resolução espacial e preparação extensa da amostra. Em nível celular, isótopos estáveis não tóxicos, como nitrogênio-15 e carbono-13, podem ser rastreados com imagens multiisótopos e espectrometria de massa de íons secundários em nanoescala para entender sua incorporação em macromoléculas. No entanto, esses métodos são destrutivos para amostras biológicas vivas^15,16. A microscopia de força atômica (MFA) é outra técnica poderosa que pode visualizar a dinâmica^{metabólica17}. A lentidão da varredura durante a aquisição de AFM, por outro lado, pode causar distorção da imagem do resultado da deriva térmica.

Desenvolvemos uma modalidade de imagem biortogonal não invasiva acoplando microscopia de espalhamento Raman estimulado sondado com óxido de deutério (D₂O) e microscopia de fluorescência de excitação de dois fótons label-free (2PEF). Esta modalidade alcança alta resolução espacial e especificidade química na obtenção de imagens de amostras biológicas 18,19,20,21,22,23,24. Este protocolo introduz as aplicações de DO-SRS e 2PEF para examinar a dinâmica metabólica de lipídios, proteínas e alterações da razão redox durante a progressão do câncer. Sendo a D₂O uma forma isotópica estável da água, as biomoléculas celulares podem ser marcadas com deutério (D) devido à sua rápida compensação com a água corporal total nas células, formando ligações carbono-deutério (C-D) através da troca enzimática²¹. As ligações C-D em macromoléculas recém-sintetizadas, incluindo lipídios, proteínas, DNA/RNA e carboidratos, podem ser detectadas na região silenciosa celular do espectro Raman 20,21,22,25,26,27. Com dois pulsos de laser sincronizados, ligações C-D de lipídios e proteínas recém-sintetizados podem ser exibidas em células individuais via imagem hiperespectral (HSI) sem extraí-las ou marcá-las com agentes citotóxicos. Além disso, a microscopia SRS tem a capacidade de construir modelos tridimensionais (3D) de regiões selecionadas de interesse em amostras biológicas, capturando e combinando um conjunto de imagens transversais^22,26. Com imagens volumétricas hiperespectrais e 3D, DO-SRS pode obter distribuições espaciais de macromoléculas recém-sintetizadas em células únicas, juntamente com o tipo de organelas que facilitam o processo de promoção do crescimento do câncer sob regulação do^AAA22. Além disso, usando 2PEF, podemos obter sinais de autofluorescência de Flavina e nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) com alta resolução, profundidade de penetração profunda e danos de baixo nível em amostras biológicas^21,23,24. Sinais de autofluorescência de flavina e NADH têm sido utilizados para caracterizar a homeostase redox e a peroxidação lipídica em células^{cancerosas22,26}. Como tal, não só o acoplamento de DO-SRS e 2PEF fornece análise subcelular da dinâmica metabólica regulada por AAA em células cancerosas com alta distribuição espacial, informações de especificidade química e preparação mínima de amostras, mas o método também reduz a necessidade de extrair ou rotular moléculas endógenas com reagentes tóxicos. Neste protocolo, apresentamos primeiramente os procedimentos de preparação de D₂O e aminoácidos, bem como cultura de células cancerígenas. Em seguida, mostramos os protocolos de imagem DO-SRS e imagem por 2PEF. Finalmente, apresentamos os resultados representativos da imagem SRS e 2PEF, que demonstram alterações metabólicas de lipídios e proteínas reguladas por AAA e alterações na razão redox em células cancerosas. Uma ilustração detalhada do processo é destacada na Figura 1.

Protocolo

1. Preparação da mídia

1. Preparar 10 mL de AAAs controle e excesso em meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 50% D₂O.
   1. Para o meio controle, medir e misturar 10 mg de pó de DMEM com 4,7 mL de água bidestilada (ddH₂O) em um tubo cônico de 15 mL. O pó de DMEM contém todos os aminoácidos em concentrações padrão. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicionar 4,7 mL de D₂O, 0,5 mL de soro fetal bovino (SFB a 5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%). Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada.
   2. Para o meio de tratamento 15x Phe, medir e misturar 10 mg de DMEM em pó com 4,7 mL de ddH₂O, 0,5 mL de FBS (5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%) em um tubo cônico de 15 mL. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicionar o excesso de pó de Phe na concentração de 924 mg/L ao meio. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada.
   3. Para o meio de tratamento Tryp 15x, medir e misturar 10 mg de pó de DMEM com 4,7 mL de ddH₂O, 0,5 mL de FBS (5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%) em um tubo cônico de 15 mL. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicione o excesso de Tryp pó a uma concentração de 224 mg/L ao meio. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada.
   4. Adicionar metionina e treonina a 30,0 mg/mL e 95,0 mg/mL, respectivamente, a todos os tubos cônicos das etapas anteriores. Vórtice completamente e inverta o tubo. Não é necessário adicionar piruvato de sódio aos meios de cultura.
   5. Filtrar o meio de controle e tratamento com um filtro de seringa de 25 mm com filtros de membrana de polietersulfona de 0,22 μm.
   6. Selar todos os tubos cônicos contendo mídia com parafilme e armazenar a 4 °C por até 3 semanas. Antes de tratar as células com meio, aqueça todos os meios a 37°C.
      NOTA: Os reagentes em pó e líquidos devem ser medidos e combinados com base no volume total dos meios de tratamento e controle.

2. Preparação da amostra celular

1. Manter células de câncer cervical (HeLa) em um frasco de cultura (ou seja, T10, T25, etc.) usando DMEM padrão suplementado com FBS a 10% e penicilina/estreptomicina a 1% a 37 °C e dióxido de carbono (CO_{2) a} 5%.
2. Sub-cultivar as células HeLa na proporção de 1:10 até atingir 80% ou mais de viabilidade celular.
3. Uma vez que as células atinjam 80% ou mais de confluência, proceda à semeadura de 2 x 10⁵ células por poço em uma placa de 24 poços usando DMEM suplementado com SFB a 0,5% e penicilina/estreptomicina a 1%.
   1. Antes da semeadura celular, prepare uma placa de 24 poços com laminina, esterilizada, poli-d-lisina, laminina, laminina, lamínica, com 12 mm de diâmetro. Submergir as lamínulas em etanol 70% e secar suavemente usando lenços sem fiapos. Coloque as tampas limpas nos poços apropriados da placa.
   2. Quando as células atingirem 80% de confluência na etapa 2.2, lavá-las uma vez com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem íons magnésio e cálcio.
   3. Adicionar tripsina a 0,25% para dissociar as células aderentes do frasco e incubar a 37 °C e 5% CO₂ por 3 min.
   4. Adicionar DMEM suplementado com FBS a 10% e penicilina/estreptomicina a 1%, pipetar suavemente para cima e para baixo e coletar as células por centrifugação a 300 x g à temperatura ambiente (TR) por 3 min.
   5. Ressuspender as células em DMEM suplementado com SFB a 0,5% e penicilina/estreptomicina a 1%.
   6. Conte as células usando um hemocitômetro, microscópio de luz e azul de tripano e semeie uma densidade de 2 x 10⁵ células por poço de uma placa de 24 poços. Como alternativa, um contador de células automatizado pode ser usado para contar as células.
   7. Devolver as células à incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ e agitar suavemente a placa para distribuir as células uniformemente.
4. Após 8 h, substituir o meio de cultura antigo por meios de Tryp 50% D 2 O/excesso de Phe ou50% D₂O/excesso de Tryp. Retornar as células à incubadora a 37 °C e 5% CO₂ por 36 h.
5. Após 36 h, fixar as células em lâminas de microscópio.
   1. Antes da fixação, prepare as lâminas do microscópio com espaçadores de imagem de 9 mm de diâmetro e coloque 15 μL de PBS 1x suplementado com íons cálcio e magnésio.
   2. Enxaguar as células com 1x PBS suplementado com íons cálcio e magnésio.
   3. Adicionar 0,5 mL de solução de paraformaldeído (PFA) sem metanol a 4% e deixar a placa sob a capa de biossegurança por aproximadamente 15 min.
   4. Aspirar a solução de PFA e enxaguar com 1x PBS suplementado com íons cálcio e magnésio duas vezes.
   5. Adicionar 1,5 mL de 1x PBS suplementado com íons cálcio e magnésio em cada poço.
   6. Use pinças estéreis para agarrar suavemente as tampas de cada poço. Inverter e colocar o lado que contém células das tampas nos espaçadores de imagem para entrar em contato com o PBS preparado na etapa 2.5.1. Certifique-se de que o lado que não contém células está exposto ao ar.
   7. Usando esmalte transparente, sele a camada externa da lamínula com o espaçador de imagem.
6. Conservar as lâminas do microscópio a 4 °C quando não estiver a efectuar imagens por imagem.

3. Medida por espectroscopia Raman espontânea (Figura 2)

1. Utilizar microscópio Raman confocal para obtenção de espectros Raman espontâneos (Figura 2A).
2. Ligue o laser girando a chave para a posição ON .
3. Clique duas vezes no ícone do software LabSpec6 para abrir o software de aquisição.
4. Coloque a amostra biológica no porta-amostras diretamente abaixo da lente objetiva.
5. No software, clique no ícone Câmera para ligar a câmera de vídeo.
6. Ajuste o plano de foco para identificar uma região de interesse com a lente objetiva de 50x. Mova o joystick para controlar a conversão da plaina do estágio XY e gire o joystick para alterar a profundidade de foco.
7. Depois de escolher a posição para medição, mude para a lente objetiva de 100x com 40 mW de potência de excitação. Clique no ícone vermelho Parar para desligar a câmera de vídeo.
8. Selecione uma grade de 1800 linhas/mm e defina a faixa de aquisição de 400 cm-1 a 3.150 ^cm-1.
9. Defina o Tempo de Aquisição para 90 s, o Acúmulo para 3 e o Binning para 4 para o menor ruído e espectro mais preciso.
   NOTA: Esses parâmetros de imagem podem ser otimizados para se ajustar ao experimento.
10. Clique no ícone de seta para ativar a exibição em tempo real.
11. Ajuste o deslocamento Raman (^cm-1) para um valor de escolha para ajustar o plano de foco.
    OBS: Neste experimento, o laser Raman foi focalizado nas gotículas lipídicas, que continham uma alta concentração de ligações CH₂ . Portanto, um desvio Raman de 2.850 ^cm-1 que correspondesse aos modos de alongamento da ligação CH₂ foi selecionado para o propósito.
12. Ajuste o plano de foco com o joystick para otimizar a melhor relação sinal-ruído.
13. Depois de escolher o plano de foco, clique no ícone vermelho Parar para uma exibição em tempo real.
14. Selecione o ícone Círculo para iniciar a aquisição de espectro.
15. Uma vez que a região celular é tomada, use o mesmo plano de foco para medir o fundo com PBS. Subtraia o espectro de fundo de cada espectro alvo subcelular usando um aplicativo de software de computador separado, como o Origin (Figura 1B).

4. Experimentos de imagem com 2PEF e SRS

NOTA: Descrições detalhadas do alinhamento do laser SRS podem ser encontradas em um relatório anterior²⁸. Este protocolo concentra-se na operação de um sistema multimodal de imagens SRS e 2PEF (Figura 2C, D).

1. Clique em Iniciar para aquecer o laser.
2. Siga a ordem para definir os interruptores principais da unidade de controle e o monitor ligado: 1) pressione o interruptor principal da caixa de controle IX3-CBH para On, 2) pressione o interruptor principal do controlador do painel de toque para On, 3) pressione o interruptor principal do adaptador AC da fonte de alimentação para LD OBIS 6 Laser Remote conectado ao combinador laser principal FV31-SCOMB para One 4) pressione o interruptor principal do adaptador AC da fonte de alimentação para LD OBIS 6 Laser Remote conectado ao combinador sublaser FV31-SCOMB para On.
3. Pressione os interruptores principais do detector de fotodiodo Si e do amplificador de bloqueio On.
4. Defina o feixe de Stokes em 1.031 nm, a largura de pulso em 6 ps e a taxa de repetição em 80 MHz.
5. Acoplado ao microscópio, ajuste o sistema picoEmerald fornecido com o feixe de bomba sincronizado com um comprimento de onda ajustável de 720-990 nm, uma largura de pulso de 5-6 ps, e uma taxa de repetição de 80 MHz. O poder de excitação médio da bomba e do Stokes é de 450 mW. Otimize o poder de excitação para minimizar os fotodanos para a amostra.
6. Use um condensador de óleo de alta abertura numérica (NA) (ou seja, 1,4 NA) para coletar os Stokes e feixes de bomba onde a amostra é montada emitindo algumas gotas no condensador.
7. Monte a amostra sobre o óleo e coloque uma gota de água grande em cima da lâmina do microscópio onde a amostra é fixada. Isso é para a lente objetiva de imersão em água.
8. Ajuste o amplificador de bloqueio para 20 MHz. Processe a imagem agora usando o módulo de software de super-resolução.
9. Selecione 512 pixels x 512 pixels e 80 μs/pixel para o tempo de permanência.
10. Uma vez que a região celular desejada esteja focada corretamente, adquira a imagem. Usando o software de aquisição do microscópio, salve as imagens como um arquivo gráfico .oir da Olympus.
11. Adquira uma imagem de fundo a 1.900 ^{cm-1 e subtraia-a} de todas as imagens celulares.
12. Para realizar imagens com PFE2, use o mesmo laser de picossegundo ajustável e ajuste a autofluorescência livre de Flavina e NADH para 800 nm e 780 nm, respectivamente.
13. Use um cubo de filtro de 460 nm/515 nm para coletar a emissão retroespalhada de autofluorescência de Flavin e NADH.
14. Ajuste o tempo de permanência para 8 μs/pixel e o tamanho do pixel para 512 pixels x 512 pixels. Defina o parâmetro de potência do obturador a laser para 150 mW.
15. Para reconstrução de imagens 3D, ajuste a perda Raman estimulada para 2.850 ^cm-1 (797 nm).
16. Uma vez que as células individuais desejadas tenham sido identificadas, registre o laser para escanear a partir do plano de foco superior para detectar as camadas superior e inferior dessas células.
    Observação : modelos 3D são gerados e salvos como arquivos .oir.

5. Análise de espectros e imagens

1. Análise de espectros
   1. Use o software Origin ou outros aplicativos relevantes para subtrair o espectro de fundo de todos os espectros de destino subcelulares.
   2. Use as operações de modelagem matemática do MATLAB para processar os espectros Raman com as funções integradas do software. Python também pode ser usado para processamento de espectros.
      1. O pré-processamento espectral começa com a conversão dos arquivos em uma matriz. Os espectros são interpolados a cada centímetro recíproco.
      2. Para validação, represente graficamente os dados brutos. Execute a correção de linha de base nos espectros brutos usando a função interna msbackadj no MATLAB. Em resumo, a função interna estima os pontos da linha de base em valores de unidade de separação identificados pelos usuários e retorna a distância entre as janelas adjacentes. A partir dos pontos basais, estime e desenhe uma linha de regressão. Aplique Suavização para suavizar a linha de regressão para subtrair a linha de base de cada espectro bruto individual.
      3. Realizar a normalização min-max dividindo a intensidade Raman da proteína a 2.930 ^cm-1 pela intensidade de cada deslocamento Raman. O sinal de 2.930 ^cm-1 é tipicamente a maior intensidade no espectro Raman. Com essa normalização, o valor máximo é transformado em 1, enquanto o valor mínimo é transformado em 0. Todos os outros valores são transformados em um decimal entre 0 e 1.
      4. Faça a média dos espectros individuais da mesma condição em um único espectro para reduzir o ruído.
   3. Uma vez processado, use aplicativos, como o Origin, para exibir todos os espectros simultaneamente. Os picos exibidos nos espectros representam uma ligação química específica ou grupo funcional.
2. Análise de imagens 3D de gotículas lipídicas
   1. Use o software FIJI-ImageJ para processar todas as imagens 3D
   2. Execute as funções Filtros de passagem de banda e Suavização para as pilhas de imagens 3D.
   3. Para análise de imagens 3D, atribua cada gota lipídica a um escore esférico calculado medindo-se a distância entre seu centro de massa e a superfície. Compare cada escore esférico com um escore esférico de uma esfera perfeita no mesmo plano euclidiano. Descarte gotículas lipídicas com baixos escores esféricos e avalie as gotículas lipídicas remanescentes quanto ao seu volume e contagens.
   4. Analisar o volume e a contagem de gotículas lipídicas entre diferentes tratamentos para obter significância estatística em um software estatístico apropriado. Aqui, o GraphPad Prism foi usado.
3. Análise de imagens hiperespectrais 2D
   1. Use o software FIJI-ImageJ para processar todas as imagens hiperespectrais 2D.
   2. Selecione o canal de 2.930 ^cm-1 para criar uma imagem de máscara que contenha valores 0 e 1. Atribua o plano de fundo a 0 e a região celular a 1.
   3. Subtrair o canal de proteína marcada com deutério (2.175 cm-1) para o canal de fundo (1.900 ^cm-1) para remover os efeitos fluorescentes.
   4. Divida o canal de proteína marcada com deutério resultante pelo canal de proteína (2.930 ^cm-1) para obter imagens ratiométricas da taxa de turnover proteico.
   5. Em seguida, multiplique a imagem da máscara feita na etapa 5.3.2 pelas imagens ratiometric para remover quaisquer ruídos de fundo restantes. Como resultado, um fundo escuro é gerado em cada imagem ratiométrica.
   6. Use a ferramenta Freehand Selection no FIJI-ImageJ para segmentar e calcular manualmente as intensidades de pixel exibidas em células individuais. As intensidades de pixel correspondem às concentrações da ligação química que está sendo visualizada.
   7. Analise as intensidades de pixel para obter significância estatística em um aplicativo de software estatístico apropriado. Aqui, o GraphPad Prism foi usado. Repita essa análise com o restante da análise ratiométrica.

Resultados

A adição do excesso de AAAs em concentrações de 15x aos meios de cultura celular contendo 50% D₂O produziu bandas Raman C-D distintas de lipídios e proteínas recém-sintetizados em células HeLa (Figura 2B). Experimentos anteriores foram realizados com diferentes níveis de concentração, como 2x e 5x, e embora os dados não sejam apresentados, a concentração de 15x produziu as mais distintas bandas Raman C-D de lipídios e proteínas recém-sintetizados. Especificamente,...

Discussão

DO-SRS e 2PEF têm sido aplicados para investigar a dinâmica metabólica em vários modelos ex vivo, incluindo Drosophila e tecidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. A modalidade de imagem usada neste estudo integra a microscopia DO-SRS e 2PEF, que pode superar outros métodos de image...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological Pipettes	Avantor (by VWR)	75816-100	https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge Tube	VWR	89039-664	https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-free	ThermoFisher Scientific	28906	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plate	Fisherbrand	FB0112929	https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PES	Foxx Life Sciences	381-2216-OEM	https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter Cube	Olympus		OCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote	Olympus		Supply power to the laser
Band-pass Filter	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuits	STRM-50
BNC Cable	Thorlabs	2249-C	Coaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric Mirror	Thorlabs	BB1-E03	750 - 1100 nm
Centrifuge
Condenser	Olympus
Cover Glass	Corning	2850-25	https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supply	TopWard	6302D
Dichroic Mount	Thorlabs	KM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent	mpbio	196055	https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate	MilliporeSigma	38210000	https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Corning	MT10027CV	https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJ	ImageJ	Version 1.53t 24 August 2022	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Heavy Water (Deuterium Oxide)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	7732-18-5	https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela Cells	ATCC	CCL-2	https://www.atcc.org/products/ccl-2
Hemocymeter	MilliporeSigma	Z359629-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass Filter	Chroma Technology	ET890/220m	Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH300880340	https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution	Cytiva	SH30042.02	https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser System	Applied Physics & Electronics, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning Microscope	Olympus	FV1200MPE
IX3-CBH Control box	Olympus		Control the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror Mount	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Low-Profile Hex Adjusters
L-Phenalynine	Sigma	P5482-25G	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-Tryptophan	Sigma	T8941-25G	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6	Horiba XploRA	N/A	https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In Amplifier	Zurich Instruments	N/A	https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam Splitter	Semrock	Di02-R980-25x36	980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLAB	MathWorks	Version: R2022b	https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-003	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging Software	Olympus	FluoView
MPLN 100x, Olympus	Olympus	MPLAPON	https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, Olympus	Olympus	MPLAPON	https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil Condenser	Olympus	6-U130	https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail Polish	Wet n Wild	B01EO2G5O4	https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0
Origin	OriginLab	Origin 2022b (9.95)	https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
Parafilm	Fisher Scientific	S37440	https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	Thermofischer - Gibco	14040117	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/Streptomycin	Thermofischer - Gibco	15140122	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope Assembly	Thorlabs	RS99	Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald System	A.P.E	N/A	https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC Connectors	Pomona Electronics	2902	Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode Detector	Home Built	N/A	DYI series
Silicon Wafer
Spacers	Grace Bio-Labs	654008	https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopy	Horiba XploRA	N/A	https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering Microscopy	Home Built	N/A
Touch  Panel Controller	Olympus		Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl)	Lonza	17-942E	https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
Tweezers	Kaverme - Amazon	B07RNVXXV1	https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy	Home Built	N/A
Weighing Paper	VWR	12578-165	https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich LabOneQ Software	Zurich Instruments		Control the Zurich lock-in amplifier