JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İki foton uyarma floresan mikroskobu (2PEF) ile entegre olan döteryum-oksit (ağır suD2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu kullanılarak amino asitler tarafından düzenlenen hücrelerdeki metabolik aktiviteleri doğrudan görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Esansiyel aromatik amino asitler (AAA'lar), hücrelerde yeni biyokütlelerin sentezlenmesi ve normal biyolojik fonksiyonların sürdürülmesi için yapı taşlarıdır. Örneğin, kanser hücrelerinin hızlı büyümelerini ve bölünmelerini sürdürmeleri için bol miktarda AAA kaynağı önemlidir. Bununla birlikte, hücrelerin yerinde metabolizmaları için AAA'lardan nasıl yararlandığını doğrudan görselleştirmek için minimum numune hazırlığı ile son derece spesifik, noninvaziv bir görüntüleme yaklaşımına yönelik artan bir talep vardır. Burada, döteryum oksit (D2O) sondalamasını uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) ile birleştiren ve DO-SRS'yi iki fotonlu uyarma floresansı (2PEF) ile entegre eden bir optik görüntüleme platformu geliştiriyoruz. Toplu olarak, DO-SRS platformu, tek HeLa hücre birimlerinde yeni sentezlenen proteinlerin ve lipitlerin yüksek uzamsal çözünürlüğünü ve özgüllüğünü sağlar. Ek olarak, 2PEF modalitesi, nikotinamid adenin dinükleotidi (NADH) ve Flavin'in otofloresan sinyallerini etiketsiz bir şekilde tespit edebilir. Burada açıklanan görüntüleme sistemi, çeşitli deneyler için esnek olan hem in vitro hem de in vivo modellerle uyumludur. Bu protokolün genel iş akışı, hücre kültürü, kültür ortamı hazırlama, hücre senkronizasyonu, hücre fiksasyonu ve DO-SRS ve 2PEF modaliteleri ile numune görüntülemeyi içerir.

Giriş

Esansiyel aromatik amino asitler (AAA'lar), fenilalanin (Phe) ve triptofan (Trip), normal biyolojik fonksiyonları sürdürmek için yeni moleküller sentezlemek üzere insan vücudu tarafından emilebilir1. Fenilalan, proteinler, melanin ve tirozin sentezi için gereklidir, Tryp ise melatonin, serotonin ve niasin 2,3 sentezi için gereklidir. Bununla birlikte, bu AAA'ların aşırı tüketimi, rapamisin (mTOR) yolunun memeli hedefini yukarı regüle edebilir, AMP ile aktive olan protein kinazını inhibe edebilir ve mitokondriyal metabolizmaya müdahale ederek makromolekül biyosentezini toplu olarak değiştirebilir ve sağlıklı hücrelerde reaktif oksijen türleri (ROS) gibi malign öncüllerin üretimine yol açabilir 4,5,6. Aşırı AAA düzenlemesi altında değişen metabolik dinamiklerin doğrudan görselleştirilmesi, AAA'ların kanser gelişimini ve sağlıklı hücrelerin büyümesini teşvik etmedeki rollerini anlamak için gereklidir 7,8,9.

Geleneksel AAA çalışmaları gaz kromatografisine (GC)10 dayanır. Manyetik rezonans görüntüleme (MRI) gibi diğer yöntemler, sınırlı uzamsal çözünürlüklere sahiptir ve bu da biyolojik örneklerin hücresel ve hücre altı analizini gerçekleştirmeyi zorlaştırır11. Son zamanlarda, noninvaziv biyobelirteçler12,13,14 ile kanser proliferasyonunda lipid ve protein sentezlerinde AAA'ların rolünü aydınlatmak için matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu teknik hala sığ görüntüleme derinliklerinden, zayıf uzamsal çözünürlükten ve kapsamlı numune hazırlığından muzdariptir. Hücresel düzeyde, nitrojen-15 ve karbon-13 gibi toksik olmayan kararlı izotoplar, makromoleküllere dahil edilmelerini anlamak için çoklu izotop görüntüleme ve nano ölçekli ikincil iyon kütle spektrometrisi ile izlenebilir. Ancak bu yöntemler canlı biyolojik örneklere zarar vermektedir15,16. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), metabolik dinamikleri görselleştirebilen bir başka güçlü tekniktir17. Öte yandan, AFM görüntüleme sırasında yavaş tarama hızı, termal sapmadan kaynaklanan görüntünün bozulmasına neden olabilir.

Döteryum-oksit (D2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu ve etiketsiz iki foton uyarma floresan mikroskobunun (2PEF) birleştirilmesiyle noninvaziv bir biortogonal görüntüleme modalitesi geliştirdik. Bu modalite, biyolojik numunelerigörüntülerken yüksek bir uzamsal çözünürlük ve kimyasal özgüllük sağlar 18,19,20,21,22,23,24. Bu protokol, kanser ilerlemeleri sırasında lipitlerin, proteinlerin ve redoks oranı değişikliklerinin metabolik dinamiklerini incelemek için DO-SRS ve 2PEF uygulamalarını tanıtmaktadır. D2O'nun kararlı bir izotop su formu olmasıyla, hücresel biyomoleküller, hücrelerdeki toplam vücut suyu ile hızlı bir şekilde dengelenmesi nedeniyle döteryum (D) ile etiketlenebilir ve enzimatik değişim yoluyla karbon-döteryum (C-D) bağları oluşturur21. Lipitler, proteinler, DNA/RNA ve karbonhidratlar dahil olmak üzere yeni sentezlenen makromoleküllerdeki C-D bağları, Raman spektrumunun hücre sessiz bölgesinde 20,21,22,25,26,27 tespit edilebilir. İki senkronize lazer darbesiyle, yeni sentezlenen lipitlerin ve proteinlerin C-D bağları, sitotoksik ajanlarla ekstrakte edilmeden veya etiketlenmeden hiperspektral görüntüleme (HSI) yoluyla tek hücreler üzerinde görüntülenebilir. Ek olarak, SRS mikroskobu, bir dizi kesit görüntüsünü yakalayarak ve birleştirerek biyolojik örneklerde seçilen ilgi alanlarının üç boyutlu (3D) modellerini oluşturma yeteneğine sahiptir22,26. Hiperspektral ve 3D hacimsel görüntüleme ile DO-SRS, AAA düzenlemesi22 kapsamında kanser büyümesini teşvik etme sürecini kolaylaştıran organel türleri ile birlikte tek hücrelerde yeni sentezlenen makromoleküllerin uzamsal dağılımlarını elde edebilir. Ayrıca, 2PEF kullanarak, biyolojik örneklerde yüksek çözünürlüklü, derin penetrasyon derinliği ve düşük seviyeli hasara sahip Flavin ve nikotinamid adenin dinükleotidinin (NADH) otofloresan sinyallerini elde edebiliriz21,23,24. Flavin ve NADH otofloresan sinyalleri, kanser hücrelerinde redoks homeostazını ve lipid peroksidasyonunu karakterize etmek için kullanılmıştır22,26. Bu nedenle, DO-SRS ve 2PEF'in birleştirilmesi, yüksek uzamsal dağılım, kimyasal özgüllük bilgisi ve minimum numune hazırlığı ile kanser hücrelerinde AAA tarafından düzenlenen metabolik dinamiklerin hücre altı analizini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda endojen moleküllerin toksik reaktiflerle ekstrakte edilmesi veya etiketlenmesi ihtiyacını da azaltır. Bu protokolde ilk olarakD2Ove amino asit hazırlama prosedürlerinin yanı sıra kanser hücre kültürü de sunulmaktadır. Daha sonra DO-SRS görüntüleme ve 2PEF görüntüleme protokollerini gösteriyoruz. Son olarak, lipid ve proteinin AAA tarafından düzenlenen metabolik değişikliklerini ve kanser hücrelerinde redoks oranı değişikliklerini gösteren SRS ve 2PEF görüntülemenin temsili sonuçlarını sunuyoruz. İşlemin ayrıntılı bir gösterimi Şekil 1'de vurgulanmıştır.

Protokol

1. Medya hazırlığı

  1. Dulbecco'nun %50D2O içeren modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) 10 mL kontrol ve fazla AAA hazırlayın.
    1. Kontrol ortamı için, 15 mL'lik konik bir tüpte 10 mg DMEM tozunu 4.7 mL çift damıtılmış su (ddH2O) ile ölçün ve karıştırın. DMEM tozu, standart konsantrasyonlarda tüm amino asitleri içerir. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. 4.7 mLD2O, 0.5 mL fetal sığır serumu (% 5 FBS) ve 0.1 mL penisilin / streptomisin (% 1) ekleyin. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin.
    2. 15x Phe tedavi ortamı için, 15 mL'lik konik bir tüpte 10 mg DMEM tozunu 4.7 mLddH2O, 0.5 mL FBS (% 5) ve 0.1 mL penisilin / streptomisin (% 1) ile ölçün ve karıştırın. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. Ortama 924 mg/L konsantrasyonda fazla fenilalanin tozu ekleyin. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin.
    3. 15x Tryp tedavi ortamı için, 15 mL'lik konik bir tüpte 10 mg DMEM tozunu 4.7 mLddH2O, 0.5 mL FBS (% 5) ve 0.1 mL penisilin / streptomisin (% 1) ile ölçün ve karıştırın. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. Ortama 224 mg/L konsantrasyonda fazla Tryp tozu ekleyin. Çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin.
    4. Önceki adımların tüm konik tüplerine sırasıyla 30.0 mg / mL ve 95.0 mg / mL'de metiyonin ve treonin ekleyin. Tüpü iyice girdap yapın ve ters çevirin. Kültür ortamına sodyum piruvat eklenmesi gerekli değildir.
    5. Kontrol ve arıtma ortamını 0,22 μm polietersülfon membran filtreli 25 mm'lik bir şırınga filtresi ile filtreleyin.
    6. Ortam içeren tüm konik tüpleri parafilm ile kapatın ve 4 °C'de 3 haftaya kadar saklayın. Hücreleri besiyeri ile işlemden önce, tüm besiyerini 37°C'ye ısıtın.
      NOT: Toz ve sıvı reaktifler, toplam arıtma ve kontrol ortamı hacmine göre ölçülmeli ve birleştirilmelidir.

2. Hücre numunesi hazırlama

  1. Rahim ağzı kanseri (HeLa) hücrelerini bir kültür şişesinde (yani, T10, T25, vb.), 37 ° C'de% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ve% 5 karbondioksit (CO2) ile desteklenmiş standart DMEM kullanarak.
  2. HeLa hücrelerini% 80 veya daha yüksek hücre canlılığına ulaşana kadar 1:10'luk bir bölünme oranında alt kültürleyin.
  3. Hücreler% 80 veya daha yüksek birleşme elde ettiğinde,% 0.5 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanarak 24 oyuklu bir plaka üzerine oyuk başına 2 x 105 hücre tohumlamaya devam edin.
    1. Hücre tohumlamadan önce, sterilize edilmiş, poli-d-lizin, laminin kaplı, yuvarlak lameller, 12 mm çapında 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. Lamelleri %70 etanole batırın ve tüy bırakmayan mendiller kullanarak nazikçe kurulayın. Temiz lamelleri plakanın uygun kuyularına yerleştirin.
    2. Hücreler adım 2.2'de% 80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri bir kez magnezyum ve kalsiyum iyonları içermeyen 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
    3. Yapışan hücreleri şişeden ayırmak için% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2 3 dakika inkübe edin.
    4. %10 FBS ve %1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM ekleyin, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri 3 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) 300 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
    5. % 0.5 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM'deki hücreleri yeniden süspanse edin.
    6. Bir hemositometre, ışık mikroskobu ve tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın ve 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 x 105 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Alternatif olarak, hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanılabilir.
    7. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre geri koyun ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın.
  4. 8 saat sonra, eski kültür ortamını %50 D2O/fazla Phe veya %50D2O/fazla Tryp besiyeri ile değiştirin. Hücreleri 36 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübatöre geri koyun.
  5. 36 saat sonra, hücreleri mikroskop slaytlarına sabitleyin.
    1. Sabitlemeden önce, 9 mm çapında görüntüleme ara parçalarına sahip mikroskop slaytları hazırlayın ve kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 15 μL 1x PBS yerleştirin.
    2. Hücreleri kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 1x PBS ile durulayın.
    3. 0,5 mL %4 metanol içermeyen paraformaldehit (PFA) çözeltisi ekleyin ve plakayı yaklaşık 15 dakika biyogüvenlik başlığının altında bırakın.
    4. PFA solüsyonunu aspire edin ve iki kez kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 1x PBS ile durulayın.
    5. Her oyuğa kalsiyum ve magnezyum iyonları ile desteklenmiş 1.5 mL 1x PBS ekleyin.
    6. Lamelleri her bir kuyucuktan nazikçe çıkarmak için steril cımbız kullanın. Adım 2.5.1'de hazırlanan PBS ile temas etmek için lamellerin hücre içeren tarafını ters çevirin ve görüntüleme ara parçalarına yerleştirin. Hücre içermeyen tarafın havaya maruz kaldığından emin olun.
    7. Şeffaf oje kullanarak, lamel dış tabakasını görüntüleme ara parçasıyla kapatın.
  6. Mikroskop slaytlarını görüntüleme yapmadığınız zamanlarda 4 °C'de saklayın.

3. Spontan Raman spektroskopisi ölçümü (Şekil 2)

  1. Spontan Raman spektrumları elde etmek için konfokal Raman mikroskobu kullanın (Şekil 2A).
  2. Anahtarı AÇIK konuma çevirerek lazeri açın.
  3. Edinme yazılımını açmak için LabSpec6 yazılım simgesine çift tıklayın.
  4. Biyolojik numuneyi doğrudan objektif merceğin altındaki numune tutucuya yükleyin.
  5. Yazılımda, Kamera Video kamerayı açmak için simge .
  6. 50x objektif lens ile ilgilenilen bir bölgeyi belirlemek için odak düzlemini ayarlayın. XY aşamasının planya çevirisini kontrol etmek için joystick'i hareket ettirin ve odak derinliğini değiştirmek için joystick'i döndürün.
  7. Ölçüm konumunu seçtikten sonra, 40 mW uyarma gücüne sahip 100x objektif merceğe geçin. Video kamerayı kapatmak için kırmızı Durdur simgesine tıklayın.
  8. 1800 satır/mm'lik bir ızgara seçin ve alım aralığını 400 cm-1 ila 3.150 cm-1 arasında ayarlayın.
  9. En az gürültü ve en doğru spektrum için Alım Süresini 90 s'ye, Biriktirmeyi 3'e ve Binning'i 4'e ayarlayın.
    NOT: Bu görüntüleme parametreleri, deneye uyacak şekilde optimize edilebilir.
  10. Gerçek zamanlı ekranı açmak için Ok simgesine tıklayın.
  11. Netleme düzleminde ince ayar yapmak için Raman kaymasını (cm-1) tercih ettiğiniz bir değere ayarlayın.
    NOT: Bu deneyde, Raman lazeri, yüksek konsantrasyondaCH2 bağı içeren lipid damlacıklarına odaklandı. Bu nedenle, amaç içinCH2 bağının germe modlarına uyan 2.850 cm-1'lik bir Raman kayması seçilmiştir.
  12. En iyi sinyal-gürültü oranını optimize etmek için odak düzlemini joystick ile ayarlayın.
  13. Odak düzlemini seçtikten sonra, gerçek zamanlı bir görüntü için kırmızı Durdur simgesine tıklayın.
  14. Spektrum alımını başlatmak için Daire simgesini seçin.
  15. Hücresel bölge alındıktan sonra, PBS ile arka planı ölçmek için aynı odak düzlemini kullanın. Origin gibi ayrı bir bilgisayar yazılımı uygulaması kullanarak her bir hücre altı hedef spektrumundan arka plan spektrumunu çıkarın (Şekil 1B).

4. 2PEF ve SRS ile görüntüleme deneyleri

NOT: SRS lazer hizalamasının ayrıntılı açıklamaları önceki bir rapordabulunabilir 28. Bu protokol, multimodal bir SRS ve 2PEF görüntüleme sisteminin çalışmasına odaklanır (Şekil 2C, D).

  1. Lazeri ısıtmak için Başlat'a tıklayın.
  2. Kontrol ünitesinin ve monitörün ana anahtarlarını açık konuma getirmek için sırayı izleyin: 1) IX3-CBH kontrol kutusunun ana şalterini Açık konumuna getirin, 2) dokunmatik panel denetleyicisinin ana şalterini Açık konumuna getirin, 3) ana lazer birleştirici FV31-SCOMB'a bağlı LD OBIS 6 Lazer Uzaktan Kumanda için güç kaynağının AC adaptörünün ana şalterine basınve 4) alt lazer birleştirici FV6-SCOMB'a bağlı LD OBIS 31 Lazer Uzaktan Kumanda güç kaynağının AC adaptörünün ana şalterini Açık konumuna getirin.
  3. Si fotodiyot dedektörünün ana anahtarlarına basın ve kilitlenin amplifier Açık.
  4. Stokes Işınını 1,031 nm'ye, Darbe Genişliğini 6 ps'ye ve Tekrarlama Hızını 80 MHz'e ayarlayın.
  5. Mikroskoba bağlandığında, senkronize pompa ışını ile birlikte verilen picoEmerald sistemini 720-990 nm arasında Ayarlanabilir Dalga Boyu , 5-6 ps Darbe Genişliği ve 80 MHz Tekrarlama Hızı ile ayarlayın. Hem pompanın hem de Stokes'un ortalama uyarma gücü 450 mW'dir. Numune için fotohasarı en aza indirmek için uyarma gücünü optimize edin.
  6. Kondansatör üzerine birkaç damla yayarak numunenin monte edildiği Stokes ve pompa kirişlerini toplamak için yüksek sayısal açıklıklı (NA) bir yağ kondansatörü (yani 1.4 NA) kullanın.
  7. Numuneyi yağın üzerine monte edin ve numunenin sabitlendiği mikroskop lamının üzerine büyük bir su damlası yerleştirin. Bu, suya daldırma objektif lensi içindir.
  8. Kilitli amplifikatörü 20 MHz'e ayarlayın. Süper çözünürlüklü yazılım modülünü kullanarak görüntüyü şimdi işleyin.
  9. Bekleme süresi için 512 piksel x 512 piksel ve 80 μs/piksel seçin.
  10. İstenen hücresel bölge düzgün bir şekilde odaklandıktan sonra görüntüyü elde edin. Mikroskobun toplama yazılımını kullanarak görüntüleri bir Olympus .oir grafik dosyası olarak kaydedin.
  11. 1.900 cm-1'de bir arka plan görüntüsü elde edin ve bunu tüm hücresel görüntülerden çıkarın.
  12. 2PEF görüntüleme yapmak için aynı ayarlanabilir pikosaniye lazeri kullanın ve Flavin ve NADH'nin etiketsiz otofloresansını sırasıyla 800 nm ve 780 nm'ye ayarlayın.
  13. Flavin ve NADH otofloresan geri saçılan emisyonu toplamak için 460 nm/515 nm filtre küpü kullanın.
  14. Bekleme süresini 8 μs/piksel ve piksel boyutunu 512 piksel x 512 piksel olarak ayarlayın. Lazer deklanşör gücü parametresini 150 mW olarak ayarlayın.
  15. 3D görüntü rekonstrüksiyonu için, uyarılmış Raman kaybını 2.850 cm-1 (797 nm) olarak ayarlayın.
  16. İstenen tek hücreler tanımlandıktan sonra, bu hücrelerin üst ve alt katmanlarını tespit etmek için üst odak düzleminden taramak için lazeri kaydedin.
    NOT: 3B modeller .oir dosyaları olarak oluşturulur ve kaydedilir.

5. Spektrum ve görüntü analizi

  1. Spektrum analizi
    1. Arka plan spektrumunu tüm hücre altı hedef spektrumlarından çıkarmak için Origin yazılımını veya diğer ilgili uygulamaları kullanın.
    2. Yazılımın yerleşik işlevleriyle Raman spektrumlarını işlemek için MATLAB'ın matematiksel modelleme işlemlerini kullanın. Python, spektrum işleme için de kullanılabilir.
      1. Spektral ön işleme, dosyaların bir diziye dönüştürülmesiyle başlar. Spektrumlar her karşılıklı santimetrede enterpolasyonludur.
      2. Doğrulama için ham verilerin grafiğini oluşturun. MATLAB'daki yerleşik msbackadj işlevini kullanarak ham spektrumlar üzerinde taban çizgisi düzeltmesini gerçekleştirin. Kısaca, yerleşik işlev, kullanıcılar tarafından tanımlanan ayırma birimi değerlerinde temel noktaları tahmin eder ve bitişik pencereler arasındaki mesafeyi döndürür. Taban çizgisi noktalarından bir regresyon çizgisi tahmin edin ve çizin. Taban çizgisini her bir ham spektrumdan çıkarmak için regresyon çizgisini yumuşatmak için Yumuşatma uygulayın.
      3. Proteinin 2.930 cm'deki Raman yoğunluğunu bölerek min-maks normalizasyonu gerçekleştirin.-1 her Raman kaymasının yoğunluğuna. 2.930 cm-1 sinyali tipik olarak Raman spektrumundaki en yüksek yoğunluktur. Bu normalleştirme ile maksimum değer 1'e, minimum değer ise 0'a dönüştürülür. Diğer tüm değerler 0 ile 1 arasında bir ondalık sayıya dönüştürülür.
      4. Gürültüyü azaltmak için aynı koşulun bireysel spektrumlarını tek bir spektrumda ortalamasını alın.
    3. İşlendikten sonra, tüm spektrumları aynı anda görüntülemek için Origin gibi uygulamaları kullanın. Spektrumlarda görüntülenen tepe noktaları, belirli bir kimyasal bağı veya fonksiyonel grubu temsil eder.
  2. Lipid damlacıklarının 3D görüntü analizi
    1. Tüm 3D görüntüleri işlemek için FIJI-ImageJ yazılımını kullanın
    2. 3D görüntü yığınları için Bant Geçiren Filtreler ve Yumuşatma işlevlerini gerçekleştirin.
    3. 3D görüntü analizi için, her bir lipit damlacığını, kütle merkezi ile yüzey arasındaki mesafeyi ölçerek hesaplanan küresel bir puana atayın. Her küresel puanı, aynı Öklid planındaki mükemmel bir kürenin küresel puanıyla karşılaştırın. Düşük küresel puanlara sahip lipid damlacıklarını atın ve kalan lipid damlacıklarını hacimleri ve sayıları açısından değerlendirin.
    4. Uygun bir istatistiksel yazılım uygulamasında istatistiksel anlamlılık için farklı tedaviler arasındaki lipit damlacıklarının hacmini ve sayısını analiz edin. Burada GraphPad Prism kullanılmıştır.
  3. 2D hiperspektral görüntü analizi
    1. Tüm 2D hiperspektral görüntüleri işlemek için FIJI-ImageJ yazılımını kullanın.
    2. 0 ve 1 değerlerini içeren bir maske görüntüsü oluşturmak için 2.930 cm-1 kanalını seçin. Arka planı 0'a ve hücresel bölgeyi 1'e atayın.
    3. Floresan etkilerini ortadan kaldırmak için döteryum etiketli protein kanalını (2,175 cm-1) arka plan kanalına (1,900 cm-1) çıkarın.
    4. Elde edilen döteryum etiketli protein kanalını protein kanalına (2,930 cm-1) bölün ve protein devir hızı oranı metrik görüntüleri elde edin.
    5. Ardından, kalan arka plan seslerini gidermek için adım 5.3.2'de yapılan maske görüntüsünü oran görüntüleriyle çarpın. Sonuç olarak, her oran görüntüsünde koyu bir arka plan oluşturulur.
    6. Tek hücrelerde görüntülenen piksel yoğunluklarını manuel olarak segmentlere ayırmak ve hesaplamak için FIJI-ImageJ'deki Serbest El Seçimi aracını kullanın. Piksel yoğunlukları, görselleştirilen kimyasal bağın konsantrasyonlarına karşılık gelir.
    7. Uygun bir istatistiksel yazılım uygulamasında istatistiksel anlamlılık için piksel yoğunluklarını analiz edin. Burada GraphPad Prism kullanılmıştır. Bu analizi kalan oran analizi ile tekrarlayın.

Sonuçlar

%50D2O içeren hücre kültürü ortamına 15x konsantrasyonda fazla AAA'ların eklenmesi, HeLa hücrelerinde yeni sentezlenen lipitlerin ve proteinlerin farklı C-D Raman bantlarını üretti (Şekil 2B). Önceki deneyler, 2x ve 5x gibi farklı konsantrasyon seviyelerinde gerçekleştirildi ve veriler sunulmamasına rağmen, 15x konsantrasyonu, yeni sentezlenen lipitlerin ve proteinlerin en belirgin C-D Raman bantlarını üretti. Spesifik olarak, lipid damlacıklarını (LD'ler)...

Tartışmalar

DO-SRS ve 2PEF görüntüleme, Drosophila ve insan dokuları 21,22,23,24,26,27,33 dahil olmak üzere çeşitli ex vivo modellerde metabolik dinamikleri araştırmak için uygulanmıştır. Bu çalışmada kullanılan görüntüleme yöntemi, molekül ekstraksiyonu veya sitotoksik re...

Açıklamalar

Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Teknik destekleri için Dr. Yajuan Li ve Anthony Fung'a ve hücre hattı için Fraley laboratuvarına teşekkür ederiz. UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 ve Hellman Fellow Award'dan gelen başlangıç fonlarını kabul ediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Serological Pipettes Avantor (by VWR)75816-100https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge TubeVWR89039-664https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-freeThermoFisher Scientific28906https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plateFisherbrandFB0112929https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PESFoxx Life Sciences381-2216-OEMhttps://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter CubeOlympusOCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser RemoteOlympusSupply power to the laser
Band-pass FilterKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm Terminator Mini CircuitsSTRM-50
BNC CableThorlabs2249-CCoaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric MirrorThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
Centrifuge
CondenserOlympus
Cover GlassCorning2850-25https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supplyTopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagentmpbio 196055https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium PyruvateMilliporeSigma38210000https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate 
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumCorningMT10027CVhttps://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJImageJVersion 1.53t 24 August 2022https://imagej.net/software/fiji/downloads
Heavy Water (Deuterium Oxide)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.7732-18-5https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela CellsATCCCCL-2https://www.atcc.org/products/ccl-2
HemocymeterMilliporeSigmaZ359629-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass FilterChroma TechnologyET890/220mFilter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)Cytiva SH300880340https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) SolutionCytivaSH30042.02https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser SystemApplied Physics & Electronics, Inc.picoEMERALDpicoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning MicroscopeOlympusFV1200MPE
IX3-CBH Control boxOlympusControl the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror MountThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Low-Profile Hex Adjusters
L-PhenalynineSigmaP5482-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-TryptophanSigmaT8941-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6Horiba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In AmplifierZurich InstrumentsN/Ahttps://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam SplitterSemrockDi02-R980-25x36980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLABMathWorksVersion: R2022bhttps://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope SlidesFisherbrand12-550-003https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging SoftwareOlympusFluoView
MPLN 100x, OlympusOlympusMPLAPONhttps://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, OlympusOlympusMPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil CondenserOlympus 6-U130https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail PolishWet n WildB01EO2G5O4https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
OriginOriginLabOrigin 2022b (9.95)https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
ParafilmFisher ScientificS37440https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)Thermofischer - Gibco14040117https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/StreptomycinThermofischer - Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope AssemblyThorlabsRS99Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald SystemA.P.EN/Ahttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC ConnectorsPomona Electronics2902Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode DetectorHome BuiltN/ADYI series
Silicon Wafer
SpacersGrace Bio-Labs654008https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopyHoriba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering MicroscopyHome BuiltN/A
Touch  Panel ControllerOlympusControl the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) Lonza17-942Ehttps://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
TweezersKaverme - AmazonB07RNVXXV1https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Two Photon Excitation Fluorescence MicroscopyHome BuiltN/A
Weighing Paper VWR12578-165https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich LabOneQ SoftwareZurich InstrumentsControl the Zurich lock-in amplifier

Referanslar

  1. Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
  2. Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837 (2020).
  3. Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
  4. Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
  5. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  6. Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
  7. Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
  8. Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
  9. Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
  10. Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
  11. Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. The potential of metabolic imaging. Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).
  12. Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
  13. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
  14. Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
  15. Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
  16. Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
  17. Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
  18. Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
  19. Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
  20. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  21. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  22. Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
  23. Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
  24. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
  27. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
  28. Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
  29. Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
  30. Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
  31. Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
  32. Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
  33. Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
  34. Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
  35. Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
  36. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging. bioRxiv. , (2022).
  37. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  38. Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
  39. Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023)

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır