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摘要

我们提出了一种协议，使用氧化氘（重水D2O）探测的受激拉曼散射（DO-SRS）显微镜直接可视化由氨基酸调节的细胞中的代谢活动，该显微镜与双光子激发荧光显微镜（2PEF）集成。

摘要

必需芳香族氨基酸（AAA）是在细胞中合成新生物质和维持正常生物功能的基石。例如，充足的AAAs供应对于癌细胞维持其快速生长和分裂很重要。因此，对高度特异性、无创成像方法的需求不断增长，该方法具有最少的样品制备，以直接可视化细胞如何利用 AAA 进行 原位代谢。在这里，我们开发了一种光学成像平台，该平台将氧化氘（D2O）探测与受激拉曼散射（DO-SRS）相结合，并将DO-SRS与双光子激发荧光（2PEF）集成到单个显微镜中，以直接可视化AAA调节下HeLa细胞的代谢活动。总的来说，DO-SRS平台为单个HeLa细胞单元中新合成的蛋白质和脂质提供了高空间分辨率和特异性。此外，2PEF模式可以无标记方式检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素的自发荧光信号。这里描述的成像系统与 体外 和 体内 模型兼容，对于各种实验都是灵活的。该协议的一般工作流程包括细胞培养、培养基制备、细胞同步、细胞固定以及使用 DO-SRS 和 2PEF 模式进行样品成像。

引言

苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Tryp）是必需的芳香族氨基酸（AAA），可以被人体吸收，合成维持正常生物学功能的新分子1。Phe是合成蛋白质，黑色素和酪氨酸所必需的，而Tryp是合成褪黑激素，血清素和烟酸2,3所必需的。然而，过量食用这些AAA可以上调雷帕霉素（mTOR）途径的哺乳动物靶标，抑制AMP活化的蛋白激酶，并干扰线粒体代谢，共同改变大分子生物合成并导致恶性前体的产生，例如健康细胞中的活性氧（ROS）4,5,6.在过量的AAA调节下直接可视化改变的代谢动力学对于了解AAA在促进癌症发展和健康细胞生长中的作用至关重要7,8,9。

传统的AAA研究依赖于气相色谱（GC）10。其他方法，如磁共振成像（MRI），空间分辨率有限，因此难以对生物样品进行细胞和亚细胞分析11。最近，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）已被开发出来，以阐明AAA在脂质和蛋白质合成中的作用，使用非侵入性生物标志物12,13,14在癌症增殖中的作用。然而，这种技术仍然存在成像深度浅、空间分辨率差和样品制备量大等问题。在细胞水平上，无毒稳定同位素，如氮-15和碳-13，可以通过多同位素成像和纳米级二次离子质谱法进行追踪，以了解它们掺入大分子中。然而，这些方法对活的生物样品15,16具有破坏性。原子力显微镜（AFM）是另一种强大的技术，可以可视化代谢动力学17。另一方面，AFM成像期间的缓慢扫描速率可能会导致热漂移导致结果的图像失真。

我们通过耦合氧化氘（D2O）探测的受激拉曼散射（DO-SRS）显微镜和无标记双光子激发荧光显微镜（2PEF）来开发一种无创双正交成像模式。这种模式在对生物样品18,19,20,21,22,23,24进行成像时实现了高空间分辨率和化学特异性。该协议介绍了DO-SRS和2PEF的应用，以检查癌症进展过程中脂质，蛋白质和氧化还原比率变化的代谢动力学。由于D2O是水的稳定同位素形式，细胞生物分子可以用氘（D）标记，因为它可以快速补偿细胞中的全身水分，通过酶交换形成碳 - 氘（C-D）键21。新合成的大分子（包括脂质、蛋白质、DNA/RNA 和碳水化合物）中的 C-D 键可以在拉曼光谱20、21、22、25、26、27 的细胞静默区域中检测到。通过两个同步激光脉冲，新合成的脂质和蛋白质的C-D键可以通过高光谱成像（HSI）显示在单个细胞上，而无需用细胞毒性剂提取或标记它们。此外，SRS显微镜能够通过捕获和组合一组横截面图像来构建生物样品中选定感兴趣区域的三维（3D）模型22,26。通过高光谱和3D体积成像，DO-SRS可以获得单细胞中新合成的大分子的空间分布，以及根据AAA法规22促进癌症生长过程的细胞器类型。此外，使用2PEF，我们可以获得黄素和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的自发荧光信号，具有高分辨率，深度穿透深度和生物样品中的低水平损伤21,23,24。黄素和NADH自发荧光信号已被用于表征癌细胞中的氧化还原稳态和脂质过氧化22,26。因此，DO-SRS和2PEF的偶联不仅提供了癌细胞中AAA调节代谢动力学的亚细胞分析，具有高空间分布，化学特异性信息和最少的样品制备，而且该方法还减少了用有毒试剂提取或标记内源性分子的需要。在该协议中，我们首先介绍了D2O和氨基酸制备以及癌细胞培养的程序。然后，我们展示了DO-SRS成像和2PEF成像的协议。最后，我们介绍了SRS和2PEF成像的代表性结果，证明了AAA调节的脂质和蛋白质代谢变化以及癌细胞中的氧化还原比例变化。图 1 突出显示了该过程的详细图示。

研究方案

1. 培养基制备

  1. 在含有 50% D2O 的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中制备 10 mL 对照和过量 AAA。
    1. 对于对照介质，在 15 mL 锥形管中测量 10 mg DMEM 粉末与 4.7 mL 双蒸水 （ddH2O） 并混合。DMEM粉末含有标准浓度的所有氨基酸。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。加入 4.7 mL D2O、0.5 mL 胎牛血清 （5% FBS） 和 0.1 mL 青霉素/链霉素 （1%）。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。
    2. 对于 15x Phe 处理培养基，在 15 mL 锥形管中测量 10 mg DMEM 粉末与 4.7 mL ddH2O、0.5 mL FBS （5%） 和 0.1 mL 青霉素/链霉素 （1%） 混合。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。向培养基中加入浓度为924mg / L的过量Phe粉末。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。
    3. 对于 15x Tryp 处理培养基，在 15 mL 锥形管中测量 10 mg DMEM 粉末与 4.7 mL ddH2O、0.5 mL FBS （5%） 和 0.1 mL 青霉素/链霉素 （1%） 混合。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。向培养基中加入浓度为 224 mg/L 的过量 Tryp 粉末。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。
    4. 将蛋氨酸和苏氨酸分别以30.0mg / mL和95.0mg / mL添加到前面步骤的所有锥形管中。彻底涡旋并倒置管子。不需要将丙酮酸钠添加到培养基中。
    5. 用25 mm注射器过滤器和0.22μm聚醚砜膜过滤器过滤控制和处理介质。
    6. 用封口膜密封所有含有介质的锥形管，并在4°C下储存长达3周。在用培养基处理细胞之前，将所有培养基加热至37°C。
      注意:粉末和液体试剂应根据处理和控制介质的总体积进行测量和组合。

2. 细胞样品制备

  1. 使用补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的标准DMEM在37°C和5%二氧化碳（CO2）下将宫颈癌（HeLa）细胞维持在培养瓶（即T10，T25等）中。
  2. 以1:10的分裂比例传代培养HeLa细胞，直到达到80%或更高的细胞活力。
  3. 一旦细胞达到80%或更高的汇合度，使用补充有0.5%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM将每孔2 x 105 个细胞接种到24孔板上。
    1. 在细胞接种之前，用灭菌的聚-d-溶酶，层粘连蛋白包被的圆形盖玻片制备24孔板，直径为12 mm。将盖玻片浸入 70% 乙醇中，然后使用不起毛的湿巾轻轻干燥。将干净的盖玻片放入板的适当孔中。
    2. 一旦细胞在步骤2.2中达到80%汇合度，用不含镁和钙离子的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞一次。
    3. 加入0.25%胰蛋白酶以将贴壁细胞从烧瓶中解离，并在37°C和5%CO2 下孵育3分钟。
    4. 加入补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM，轻轻上下移液，并在室温（RT）下以300× g 离心3分钟收集细胞。
    5. 将细胞重悬于补充有0.5%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中。
    6. 使用血细胞计数器、光学显微镜和台盼蓝计数细胞，并在 24 孔板中接种密度为 2 x 105 个细胞。或者，可以使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
    7. 将细胞在37°C和5%CO2下返回培养箱中，轻轻摇动板以使细胞均匀分布。
  4. 8小时后，用50%D 2 O /过量Phe或50%D2O /过量Tryp培养基替换旧培养基。将细胞在37°C和5%CO2下返回培养箱36小时。
  5. 36小时后，将细胞固定在显微镜载玻片上。
    1. 在固定之前，准备带有直径为9 mm的成像垫片的显微镜载玻片，并放置15μL补充有钙和镁离子的1x PBS。
    2. 用补充有钙和镁离子的1x PBS冲洗细胞。
    3. 加入 0.5 mL 的 4% 无甲醇多聚甲醛 （PFA） 溶液，将板放在生物安全罩下约 15 分钟。
    4. 吸出PFA溶液，并用补充有钙和镁离子的1x PBS冲洗两次。
    5. 在每个孔中加入 1.5 mL 补充有钙和镁离子的 1x PBS。
    6. 使用无菌镊子轻轻地从每个孔中取出盖玻片。倒置并将盖玻片的包含细胞的一面放在成像垫片上，以接触步骤2.5.1中制备的PBS。确保不含电池的一面暴露在空气中。
    7. 使用透明指甲油，用成像垫片密封盖玻片的外层。
  6. 不成像时将显微镜载玻片储存在4°C。

3. 自发拉曼光谱测量（图2）

  1. 使用共聚焦拉曼显微镜获得自发拉曼光谱（图2A）。
  2. 通过将钥匙转到 ON 位置来打开激光器。
  3. 双击 LabSpec6 软件图标以打开采集软件。
  4. 将生物样品装载到物镜正下方的样品架上。
  5. 在软件上，单击 相机 图标 打开摄像机。
  6. 调整焦平面以使用50倍物镜识别感兴趣区域。移动操纵杆以控制XY载物台的刨床平移，并旋转操纵杆以改变焦深。
  7. 选择测量位置后，切换到激发功率为40 mW的100倍物镜。单击红色的 停止 图标以关闭摄像机。
  8. 选择1800线/mm的光栅，并将采集范围设置为400 cm-1至3,150 cm-1。
  9. 将采集时间设置为 90 s，将累积时间设置为 3，将合并设置为 4，以获得最小的噪声和最准确的频谱。
    注意:这些成像参数可以优化以适应实验。
  10. 单击 箭头 图标以打开实时显示。
  11. 将拉曼频移 （cm-1） 调整到所选值以微调焦点平面。
    注意:在该实验中，拉曼激光聚焦到含有高浓度CH2键的脂滴上。因此，为此选择了与CH 2键的拉伸模式相匹配的2,850 cm-1拉曼位移。
  12. 使用操纵杆调整对焦平面以优化最佳信噪比。
  13. 选择对焦平面后，单击红色的 停止 图标进行实时显示。
  14. 选择 圆圈 图标以开始频谱采集。
  15. 拍摄细胞区域后，使用相同的焦点平面用PBS测量背景。使用单独的计算机软件应用程序（例如Origin）从每个亚细胞目标光谱中减去背景光谱（图1B）。

4. 2PEF和SRS成像实验

注意:SRS激光对准的详细说明可以在以前的报告28中找到。该协议侧重于多模态SRS和2PEF成像系统的操作（图2C，D）。

  1. 单击 "开始" 以预热激光器。
  2. 按照顺序将控制单元和显示器的主开关设置为打开:1） 将控制盒 IX3-CBH 的主开关按开，2） 将触摸面板控制器的主开关按开，3） 按下连接到主激光组合器 FV31-SCOMB 的 LD OBIS 6 激光遥控器电源交流适配器的主开关开，以及 4） 将连接到子激光组合器 FV31-SCOMB 的 LD OBIS 6 激光遥控器电源的交流适配器的主开关按开。
  3. 按下 Si 光电二极管检测器和锁相放大器的主开关 On。
  4. 将 斯托克斯光束 设置为 1,031 nm， 脉冲宽度 设置为 6 ps， 重复频率 设置为 80 MHz。
  5. 耦合到显微镜中，设置与同步泵浦光束一起提供的picoEmerald系统，可调 波长 为720-990 nm， 脉冲宽度 为5-6 ps， 重复率为 80 MHz。泵和斯托克斯的平均激励功率均为450 mW。优化激发功率，以最大程度地减少样品的光损伤。
  6. 使用高数值孔径 （NA） 油冷凝器（即 1.4 NA）通过在冷凝器上发射几滴来收集安装样品的斯托克斯和泵浦光束。
  7. 将样品安装在油上，并在固定样品的显微镜载玻片顶部放置一个大水滴。这是用于水浸物镜的。
  8. 将锁相放大器设置为 20 MHz。 现在使用超分辨率软件模块处理图像。
  9. 选择 512 像素 x 512 像素和 80 μs/像素作为停留时间。
  10. 一旦所需的细胞区域正确聚焦，获取图像。使用显微镜的采集软件，将图像保存为奥林巴斯.oir图形文件。
  11. 获取1,900 cm-1 的背景图像，并从所有细胞图像中减去它。
  12. 要进行2PEF成像，请使用相同的可调谐皮秒激光器，并将黄素和NADH的无标记自发荧光分别设置为800 nm和780 nm。
  13. 使用 460 nm/515 nm 滤光片立方体收集黄素和 NADH 自发荧光背散射发射。
  14. 将停留时间调整为 8 μs/像素，将像素大小调整为 512 像素 x 512 像素。将激光快门功率参数设置为 150 mW。
  15. 对于 3D 图像重建，将受激拉曼损失调整为 2,850 cm-1 （797 nm）。
  16. 一旦确定了所需的单个细胞，就将激光注册为从顶部焦点平面扫描，以检测这些细胞的顶层和底层。
    注意:3D 模型生成并保存为 .oir 文件。

5. 光谱和图像分析

  1. 光谱分析
    1. 使用Origin软件或其他相关应用程序从所有亚细胞靶光谱中减去背景光谱。
    2. 使用 MATLAB 的数学建模操作，通过软件的内置函数处理拉曼光谱。Python也可用于光谱处理。
      1. 光谱预处理从将文件转换为数组开始。光谱以每倒数厘米插值。
      2. 为了进行验证，请绘制原始数据。使用 MATLAB 中的内置函数 msbackadj 对原始光谱执行基线校正。简而言之，内置函数估计用户标识的分离单元值的基线点，并返回相邻窗口之间的距离。从基线点开始，估计并绘制一条回归线。应用平滑以 平滑 回归线，以从每个单独的原始光谱中减去基线。
      3. 通过将蛋白质在 2,930 cm-1 处的拉曼强度除以每个拉曼位移的强度来执行最小-最大归一化。2,930 cm-1 信号通常是拉曼光谱中强度最高的信号。通过此规范化，最大值将转换为 1，而最小值将转换为 0。每隔一个值都会转换为介于 0 和 1 之间的小数。
      4. 将相同条件的单个光谱平均为单个光谱以降低噪声。
    3. 处理后，使用应用程序（如 Origin）同时显示所有光谱。光谱中显示的峰代表特定的化学键或官能团。
  2. 脂滴的 3D 图像分析
    1. 使用FIJI-ImageJ软件处理所有3D图像
    2. 执行3D图像堆栈的 带通滤镜 和 平滑 功能。
    3. 对于 3D 图像分析，将每个脂滴分配给通过测量其质心到表面之间的距离计算的球形评分。将每个球面分数与同一欧几里得平面上完美球体的球面分数进行比较。丢弃球形评分低的脂滴，并评估剩余的脂滴的体积和计数。
    4. 在适当的统计软件应用程序上分析不同处理之间脂滴的体积和计数，以确定统计显着性。在这里，使用了GraphPad Prism。
  3. 二维高光谱图像分析
    1. 使用FIJI-ImageJ软件处理所有2D高光谱图像。
    2. 选择 2,930 cm-1 通道以创建包含 0 和 1 值的蒙版图像。将背景分配给 0，将蜂窝区域分配给 1。
    3. 将氘标记的蛋白质通道（2,175 cm-1）减去到背景通道（1,900 cm-1）以消除荧光效应。
    4. 将所得的氘标记蛋白质通道除以蛋白质通道（2,930 cm-1）以获得蛋白质周转率比率图像。
    5. 然后，将步骤5.3.2中制作的掩模图像乘以比例图像以去除任何剩余的背景噪声。结果，在每个比率图像中都会生成深色背景。
    6. 使用FIJI-ImageJ中的 手绘选择 工具手动分割和计算单个单元格上显示的像素强度。像素强度对应于正在可视化的化学键的浓度。
    7. 在适当的统计软件应用程序上分析像素强度的统计显著性。在这里，使用了GraphPad Prism。对剩余的比率分析重复此分析。

结果

将浓度为 15x 的过量 AAA 添加到含 50% D2O 的细胞培养基中，在 HeLa 细胞中产生了新合成的脂质和蛋白质的不同 C-D 拉曼带（图 2B）。以前的实验是用不同的浓度水平进行的，例如2x和5x，虽然没有提供数据，但15x浓度产生了新合成的脂质和蛋白质的最明显的C-D拉曼带。具体来说，通过研究脂滴（LDs），我们注意到15x Phe和15x Tryp分别在2,143 cm-1和2,172 cm-1处诱导新合...

讨论

DO-SRS和2PEF成像已被应用于研究各种离体模型中的代谢动力学，包括果蝇和人体组织21,22,23,24,26,27,33。本研究中使用的成像方式集成了DO-SRS和2PEF显微镜，无需使用细胞毒性试剂进行分子提取或标记，并且需要最少的样...

披露声明

作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。

致谢

我们感谢李亚娟博士和冯安东尼博士的技术支持，以及Fraley实验室的细胞系。我们感谢UCSD，NIH U54CA132378，NIH 5R01NS111039，NIH R21NS125395，NIHU54DK134301，NIHU54 HL165443和Hellman Fellow奖的启动资金。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Serological Pipettes Avantor (by VWR)75816-100https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge TubeVWR89039-664https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-freeThermoFisher Scientific28906https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plateFisherbrandFB0112929https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PESFoxx Life Sciences381-2216-OEMhttps://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter CubeOlympusOCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser RemoteOlympusSupply power to the laser
Band-pass FilterKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm Terminator Mini CircuitsSTRM-50
BNC CableThorlabs2249-CCoaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric MirrorThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
Centrifuge
CondenserOlympus
Cover GlassCorning2850-25https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supplyTopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagentmpbio 196055https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium PyruvateMilliporeSigma38210000https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate 
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumCorningMT10027CVhttps://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJImageJVersion 1.53t 24 August 2022https://imagej.net/software/fiji/downloads
Heavy Water (Deuterium Oxide)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.7732-18-5https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela CellsATCCCCL-2https://www.atcc.org/products/ccl-2
HemocymeterMilliporeSigmaZ359629-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass FilterChroma TechnologyET890/220mFilter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)Cytiva SH300880340https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) SolutionCytivaSH30042.02https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser SystemApplied Physics & Electronics, Inc.picoEMERALDpicoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning MicroscopeOlympusFV1200MPE
IX3-CBH Control boxOlympusControl the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror MountThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Low-Profile Hex Adjusters
L-PhenalynineSigmaP5482-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-TryptophanSigmaT8941-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6Horiba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In AmplifierZurich InstrumentsN/Ahttps://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam SplitterSemrockDi02-R980-25x36980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLABMathWorksVersion: R2022bhttps://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope SlidesFisherbrand12-550-003https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging SoftwareOlympusFluoView
MPLN 100x, OlympusOlympusMPLAPONhttps://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, OlympusOlympusMPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil CondenserOlympus 6-U130https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail PolishWet n WildB01EO2G5O4https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
OriginOriginLabOrigin 2022b (9.95)https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
ParafilmFisher ScientificS37440https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)Thermofischer - Gibco14040117https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/StreptomycinThermofischer - Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope AssemblyThorlabsRS99Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald SystemA.P.EN/Ahttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC ConnectorsPomona Electronics2902Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode DetectorHome BuiltN/ADYI series
Silicon Wafer
SpacersGrace Bio-Labs654008https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopyHoriba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering MicroscopyHome BuiltN/A
Touch  Panel ControllerOlympusControl the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) Lonza17-942Ehttps://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
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参考文献

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