JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол непосредственной визуализации метаболической активности в клетках, регулируемых аминокислотами, с помощью микроскопии стимулированного комбинационного рассеяния (DO-SRS) с зондированием оксида дейтерия (тяжелая водаD2O), которая интегрирована с флуоресцентной микроскопией двухфотонного возбуждения (2PEF).

Аннотация

Незаменимые ароматические аминокислоты (АБА) являются строительными блоками для синтеза новой биомассы в клетках и поддержания нормальных биологических функций. Например, обильный запас ААА важен для поддержания быстрого роста и деления раковых клеток. В связи с этим растет спрос на высокоспецифичный, неинвазивный подход к визуализации с минимальной подготовкой образцов для прямой визуализации того, как клетки используют АБА для метаболизма in situ. Здесь мы разрабатываем оптическую платформу визуализации, которая сочетает зондирование оксидом дейтерия (D2O) с вынужденным комбинационным рассеянием (DO-SRS) и интегрирует DO-SRS с двухфотонной флуоресценцией возбуждения (2PEF) в один микроскоп для прямой визуализации метаболической активности клеток HeLa под регуляцией ААА. В совокупности платформа DO-SRS обеспечивает высокое пространственное разрешение и специфичность вновь синтезированных белков и липидов в отдельных клеточных единицах HeLa. Кроме того, модальность 2PEF может обнаруживать сигналы автофлуоресценции никотинамидадениндинуклеотида (NADH) и флавина без меток. Описанная здесь система визуализации совместима как с моделями in vitro , так и с моделями in vivo , что является гибким для различных экспериментов. Общий рабочий процесс этого протокола включает в себя культивирование клеток, приготовление питательных сред, синхронизацию клеток, фиксацию клеток и визуализацию образцов с помощью модальностей DO-SRS и 2PEF.

Введение

Будучи незаменимыми ароматическими аминокислотами (ААА), фенилаланин (Phe) и триптофан (Tryp) могут поглощаться человеческим организмом для синтеза новых молекул для поддержания нормальных биологическихфункций. Фенилаланин необходим для синтеза белков, меланина и тирозина, а трип — для синтеза мелатонина, серотонина и ниацина 2,3. Однако избыточное потребление этих АБА может усиливать регуляцию рапамицинового пути (mTOR) у млекопитающих, ингибировать АМФ-активируемую протеинкиназу и вмешиваться в митохондриальный метаболизм, коллективно изменяя биосинтез макромолекул и приводя к образованию злокачественных предшественников, таких как активные формы кислорода (АФК) в здоровых клетках 4,5,6. Прямая визуализация измененной метаболической динамики при избыточной регуляции ААА имеет важное значение для понимания роли АБА в стимулировании развития рака и росте здоровых клеток 7,8,9.

Традиционные исследования ААА основаны на газовой хроматографии (ГХ)10. Другие методы, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ), имеют ограниченное пространственное разрешение, что затрудняет проведение клеточного и субклеточного анализа биологических образцов11. Недавно была разработана матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) для выяснения роли ААА в синтезе липидов и белков в пролиферации рака с помощью неинвазивных биомаркеров12,13,14. Тем не менее, этот метод по-прежнему страдает от малой глубины изображения, плохого пространственного разрешения и обширной пробоподготовки. На клеточном уровне нетоксичные стабильные изотопы, такие как азот-15 и углерод-13, могут быть прослежены с помощью мультиизотопной визуализации и масс-спектрометрии вторичных ионов наноразмерной степени, чтобы понять их включение в макромолекулы. Однако эти методы губительны для живых биологических образцов15,16. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является еще одним мощным методом, который может визуализировать метаболическуюдинамику. С другой стороны, медленная скорость сканирования во время АСМ может привести к искажению изображения результата из-за теплового дрейфа.

Мы разработали неинвазивную биортогональную модальность визуализации путем объединения микроскопии стимулированного комбинационного рассеяния (DO-SRS) с зондированием оксида дейтерия (D2O)и флуоресцентной микроскопии с двухфотонным возбуждением (2PEF) без меток. Этот метод обеспечивает высокое пространственное разрешение и химическую специфичность при визуализации биологических образцов 18,19,20,21,22,23,24. Этот протокол знакомит с применением DO-SRS и 2PEF для изучения метаболической динамики изменений липидов, белков и окислительно-восстановительных соотношений во время прогрессирования рака. ПосколькуD2Oявляется стабильной изотопной формой воды, клеточные биомолекулы могут быть помечены дейтерием (D) из-за его быстрой компенсации общей водой в клетках, образуя углерод-дейтериевые (C-D) связи посредством ферментативного обмена21. C-D связи во вновь синтезированных макромолекулах, включая липиды, белки, ДНК/РНК и углеводы, могут быть обнаружены в клеточной молчаливой области рамановского спектра 20,21,22,25,26,27. С помощью двух синхронизированных лазерных импульсов C-D связи вновь синтезированных липидов и белков могут быть отображены на отдельных клетках с помощью гиперспектральной визуализации (HSI) без экстракции или маркировки их цитотоксическими агентами. Кроме того, SRS-микроскопия позволяет создавать трехмерные (3D) модели выбранных областей интереса в биологических образцах путем захвата и объединения набора изображений поперечного сечения22,26. С помощью гиперспектральной и объемной 3D-визуализации DO-SRS может получить пространственное распределение вновь синтезированных макромолекул в отдельных клетках, а также тип органелл, которые способствуют процессу стимулирования роста рака в соответствии с правилом AAA22. Кроме того, используя 2PEF, мы можем получить сигналы автофлуоресценции флавина и никотинамидадениндинуклеотида (NADH) с высоким разрешением, большой глубиной проникновения и низким уровнем повреждения в биологических образцах21,23,24. Сигналы автофлуоресценции флавина и NADH были использованы для характеристики окислительно-восстановительного гомеостаза и перекисного окисления липидов в раковых клетках22,26. Таким образом, сопряжение DO-SRS и 2PEF не только обеспечивает субклеточный анализ ААА-регулируемой метаболической динамики в раковых клетках с высоким пространственным распределением, информацией о химической специфичности и минимальной пробоподготовкой, но и снижает потребность в извлечении или маркировке эндогенных молекул токсичными реагентами. В этом протоколе мы сначала представляем процедурыD2Oи аминокислотного препарата, а также культуру раковых клеток. Затем мы покажем протоколы визуализации DO-SRS и 2PEF. Наконец, представлены репрезентативные результаты визуализации SRS и 2PEF, которые демонстрируют ААА-регулируемые метаболические изменения липидов и белков, а также изменения окислительно-восстановительного соотношения в раковых клетках. Подробная иллюстрация процесса приведена на рисунке 1.

протокол

1. Подготовка материала

  1. Приготовьте 10 мл контрольных и избыточных ААА в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco, содержащей 50% D2O.
    1. Для контрольных сред отмерьте и смешайте 10 мг порошка DMEM с 4,7 мл двойной дистиллированной воды (ddH2O) в конической пробирке объемом 15 мл. Порошок DMEM содержит все аминокислоты в стандартных концентрациях. Тщательно перемешайте и переверните трубку, чтобы раствор хорошо перемешался. Добавьте 4,7 млD2O, 0,5 мл фетальной бычьей сыворотки (5% FBS) и 0,1 мл пенициллина/стрептомицина (1%). Тщательно перемешайте и переверните трубку, чтобы раствор хорошо перемешался.
    2. Для 15-кратной среды для обработки фенилаланина отмерьте и смешайте 10 мг порошка DMEM с 4,7 мл ddH2O, 0,5 мл FBS (5%) и 0,1 мл пенициллина/стрептомицина (1%) в конической пробирке объемом 15 мл. Тщательно перемешайте и переверните трубку, чтобы раствор хорошо перемешался. Добавьте в среду избыток порошка фенилаланина в концентрации 924 мг/л. Тщательно перемешайте и переверните трубку, чтобы раствор хорошо перемешался.
    3. Для 15-кратной среды для обработки трипом отмерьте и смешайте 10 мг порошка DMEM с 4,7 мл ddH2O, 0,5 мл FBS (5%) и 0,1 мл пенициллина/стрептомицина (1%) в конической пробирке объемом 15 мл. Тщательно перемешайте и переверните трубку, чтобы раствор хорошо перемешался. Добавьте в среду избыток порошка трипа в концентрации 224 мг/л. Тщательно перемешайте и переверните трубку, чтобы раствор хорошо перемешался.
    4. Добавьте метионин и треонин в дозе 30,0 мг/мл и 95,0 мг/мл соответственно во все конические пробирки предыдущих этапов. Тщательно вмешайте и переверните трубку. Пируват натрия не требуется добавлять в питательные среды.
    5. Фильтруйте контрольную и обрабатывающую среду шприц-фильтром 25 мм с мембранными фильтрами из полиэфирсульфона 0,22 мкм.
    6. Запечатайте все конические пробирки, содержащие среду, парапленкой и храните при температуре 4 °C до 3 недель. Перед обработкой клеток средой нагрейте все среды до 37°C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Порошковые и жидкие реагенты следует измерять и комбинировать в зависимости от общего объема обрабатывающих и контрольных сред.

2. Подготовка образцов клеток

  1. Поддерживайте клетки рака шейки матки (HeLa) в колбе для культивирования (т.е. T10, T25 и т.д.) с помощью стандартного DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C и 5% углекислого газа (CO2).
  2. Субкультивируйте клетки HeLa в соотношении 1:10 до достижения жизнеспособности клеток 80% или выше.
  3. После того, как клетки достигнут слияния 80% или выше, приступают к посеву 2 x 10 5 клеток на лунку на 24-луночный планшет с использованием DMEM с добавлением0,5 % FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
    1. Перед посевом клеток подготовьте 24-луночную пластину со стерилизованными, покрытыми поли-ди-лизином, покрытыми ламинином, круглыми покровными стеклами диаметром 12 мм. Погрузите покровные стекла в 70% этанол и аккуратно высушите безворсовыми салфетками. Поместите чистые покровные стекла в соответствующие углубления пластины.
    2. После того, как клетки достигнут 80% слияния на этапе 2.2, промойте клетки один раз 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) без ионов магния и кальция.
    3. Добавляют 0,25% трипсина для диссоциации адгезивных клеток из колбы и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение 3 мин.
    4. Добавьте DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина, осторожно пипеткой вверх и вниз и соберите клетки центрифугированием при 300 x g при комнатной температуре (RT) в течение 3 минут.
    5. Ресуспендировать клетки в DMEM с добавлением 0,5% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
    6. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра, светового микроскопа и трипанового синего и засейте плотность 2 x 105 клеток на лунку 24-луночного планшета. В качестве альтернативы для подсчета ячеек можно использовать автоматический счетчик клеток.
    7. Верните клетки в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 и осторожно встряхните пластину, чтобы клетки распределились равномерно.
  4. Через 8 ч замените старую питательную среду 50% D 2 O/избыток Phe или 50% D2O/избыток трип-среды. Верните клетки в инкубатор при температуре 37 °С и 5%СО2 на 36 ч.
  5. Через 36 ч закрепите ячейки на предметных стеклах микроскопа.
    1. Перед фиксацией подготовьте предметные стекла микроскопа с прокладками диаметром 9 мм и поместите 15 мкл 1x PBS с добавлением ионов кальция и магния.
    2. Промойте клетки 1x PBS с добавлением ионов кальция и магния.
    3. Добавьте 0,5 мл 4% раствора параформальдегида (PFA), не содержащего метанола, и оставьте планшет под колпаком биобезопасности примерно на 15 минут.
    4. Отсасывайте раствор PFA и дважды промывайте 1x PBS с добавлением ионов кальция и магния.
    5. Добавьте 1,5 мл 1x PBS с добавлением ионов кальция и магния в каждую лунку.
    6. Используйте стерильный пинцет, чтобы аккуратно вытащить покровные стекла из каждого углубления. Инвертируйте и поместите стороной покровных стекол, содержащую ячейки, на прокладки для визуализации, чтобы контактировать с PBS, подготовленным на шаге 2.5.1. Убедитесь, что сторона, не содержащая клеток, подвергается воздействию воздуха.
    7. Используя прозрачный лак для ногтей, запечатайте внешний слой покровного стекла с помощью прокладки для визуализации.
  6. Храните предметные стекла микроскопа при температуре 4 °C, когда они не визуализируются.

3. Измерение методом спектроскопии комбинационного рассеяния света (рис. 2)

  1. Используйте конфокальный рамановский микроскоп для получения спонтанных спектров комбинационного рассеяния света (рис. 2А).
  2. Включите лазер, повернув ключ в положение ON .
  3. Дважды щелкните значок программного обеспечения LabSpec6 , чтобы открыть программное обеспечение для сбора данных.
  4. Загрузите биологический образец в держатель образца непосредственно под линзой объектива.
  5. В программном обеспечении щелкните значок камеры , чтобы включить видеокамеру.
  6. Отрегулируйте плоскость фокусировки, чтобы определить интересующую область с помощью объектива с 50-кратным увеличением. Перемещайте джойстик, чтобы управлять перемещением рубанка по оси XY, и поворачивайте джойстик, чтобы изменить глубину фокусировки.
  7. После выбора положения для измерения переключитесь на объектив 100x с мощностью возбуждения 40 мВт. Нажмите красный значок «Стоп», чтобы выключить видеокамеру.
  8. Выберите решетку 1800 линий/мм и установите диапазон захвата от 400 см-1 до 3 150 см-1.
  9. Установите Время сбора данных (Acquisition Time ) на 90 с, Накопление (Accumulation ) на 3 и Биннинг (Binning ) на 4 для наименьшего шума и наиболее точного спектра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры визуализации могут быть оптимизированы в соответствии с экспериментом.
  10. Щелкните значок стрелки , чтобы включить отображение в режиме реального времени.
  11. Настройте сдвиг комбинационного рассеяния света (см-1) на выбранное значение, чтобы точно настроить плоскость фокусировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте рамановский лазер был сфокусирован на липидных каплях, которые содержали высокую концентрацию связейCH2 . Поэтому для этой цели был выбран сдвиг комбинационного рассеяния света 2850 см-1 , который соответствовал режимам растяжения связиCH2 .
  12. Отрегулируйте плоскость фокусировки с помощью джойстика, чтобы оптимизировать наилучшее соотношение сигнал/шум.
  13. После выбора плоскости фокусировки щелкните красный значок остановки , чтобы отобразить его в режиме реального времени.
  14. Щелкните значок круга , чтобы начать получение спектра.
  15. После того, как сотовая область будет снята, используйте ту же плоскость фокусировки для измерения фона с помощью PBS. Вычтите фоновый спектр из каждого субклеточного целевого спектра с помощью отдельного компьютерного программного обеспечения, такого как Origin (рис. 1B).

4. Эксперименты по визуализации с 2PEF и SRS

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание лазерной юстировки SRS можно найти в предыдущем отчете28. Этот протокол ориентирован на работу мультимодальной системы визуализации SRS и 2PEF (рис. 2C, D).

  1. Нажмите « Пуск », чтобы разогреть лазер.
  2. Следуйте порядку, чтобы установить основные переключатели блока управления и монитора вкл.: 1) нажать главный выключатель блока управления IX3-CBH в положение On, 2) нажать главный переключатель контроллера сенсорной панели в положение On, 3) нажать главный выключатель адаптера переменного тока источника питания LD OBIS 6 Laser Remote, подключенного к основному лазерному сумматору FV31-SCOMB, в положение Onи 4) нажмите главный выключатель адаптера переменного тока источника питания лазерного пульта LD OBIS 6, подключенного к сублазерному сумматору FV31-SCOMB, в положение On.
  3. Нажмите главные переключатели детектора фотодиодов Si и синхронного усилителя On.
  4. Установите луч Стокса на длину волны 1,031 нм, длительность импульса на 6 пс и частоту повторения на 80 МГц.
  5. Подключившись к микроскопу, установите систему picoEmerald, поставляемую с синхронизированным пучком накачки с настраиваемой длиной волны от 720 до 990 нм, длительностью импульса 5-6 пс и частотой повторения 80 МГц. Средняя мощность возбуждения как насоса, так и Стокса составляет 450 мВт. Оптимизируйте мощность возбуждения, чтобы свести к минимуму фотоповреждение образца.
  6. Используйте масляный конденсатор с высокой числовой апертурой (NA) (т. е. 1,4 NA) для сбора лучей Стокса и накачки, в которых установлен образец, испуская несколько капель на конденсатор.
  7. Установите образец на масло и поместите большую каплю воды на предметное стекло микроскопа, где закреплен образец. Это относится к водопогружному объективу.
  8. Установите синхронный усилитель на 20 МГц. Обработайте изображение с помощью программного модуля сверхвысокого разрешения.
  9. Выберите 512 x 512 пикселей и 80 мкс/пиксель для времени задержки.
  10. После того, как нужная клеточная область будет правильно сфокусирована, получите изображение. С помощью программного обеспечения микроскопа сохраните изображения в виде графического файла Olympus .oir.
  11. Получите фоновое изображение размером 1 900 см-1 и вычтите его из всех ячеистых изображений.
  12. Для выполнения визуализации 2PEF используйте тот же настраиваемый пикосекундный лазер и установите автофлуоресценцию без меток Flavin и NADH на 800 нм и 780 нм соответственно.
  13. Используйте фильтрующий куб 460 нм/515 нм для сбора обратного рассеянного излучения флавина и NADH.
  14. Установите время задержки на 8 мкс/пиксель и размер пикселя на 512 x 512 пикселей. Установите параметр мощности лазерного затвора на 150 мВт.
  15. Для реконструкции 3D-изображения настройте вынужденную комбинационную потерю до 2850 см-1 (797 нм).
  16. После того, как нужные отдельные клетки идентифицированы, зарегистрируйте лазер для сканирования с верхней фокусной плоскости, чтобы обнаружить верхний и нижний слои этих клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-модели генерируются и сохраняются в виде файлов .oir.

5. Анализ спектров и изображений

  1. Спектральный анализ
    1. Используйте программное обеспечение Origin или другие соответствующие приложения для вычитания фонового спектра из всех субклеточных целевых спектров.
    2. Используйте операции математического моделирования MATLAB для обработки спектров комбинационного рассеяния света с помощью встроенных функций программного обеспечения. Python также можно использовать для обработки спектров.
      1. Спектральная предварительная обработка начинается с преобразования файлов в массив. Спектры интерполируются через каждый обратный сантиметр.
      2. Для проверки постройте график необработанных данных. Выполните коррекцию базовой линии на исходных спектрах с помощью встроенной функции msbackadj в MATLAB. Вкратце, встроенная функция оценивает базовые точки на значениях единиц разделения, определенных пользователями, и возвращает расстояние между соседними окнами. От точек базовой линии оцените и нарисуйте линию регрессии. Примените сглаживание , чтобы сгладить линию регрессии, чтобы вычесть базовую линию из каждого отдельного необработанного спектра.
      3. Выполните нормализацию min-max, разделив интенсивность комбинационного рассеяния белка при 2,930 см-1 на интенсивность каждого рамановского сдвига. Сигнал 2930 см-1 , как правило, является самой высокой интенсивностью в спектре комбинационного рассеяния. При такой нормализации максимальное значение преобразуется в 1, а минимальное — в 0. Каждое другое значение преобразуется в десятичную дробь от 0 до 1.
      4. Усредните отдельные спектры одного и того же состояния в единый спектр, чтобы уменьшить шум.
    3. После обработки используйте приложения, такие как Origin, для одновременного отображения всех спектров. Пики, отображаемые в спектрах, представляют собой конкретную химическую связь или функциональную группу.
  2. Анализ 3D-изображений липидных капель
    1. Используйте программное обеспечение FIJI-ImageJ для обработки всех 3D-изображений
    2. Выполните функции Bandpass Filters (Полосовые фильтры ) и Smoothing (Сглаживание ) для стеков 3D-изображений.
    3. Для анализа 3D-изображений присвойте каждой липидной капле сферическую оценку, рассчитанную путем измерения расстояния между ее центром масс и поверхностью. Сравните каждую сферическую оценку со сферической оценкой совершенной сферы на том же евклидовом плане. Отбросьте липидные капли с низкими сферическими баллами и оцените оставшиеся липидные капли по их объему и количеству.
    4. Анализируйте объем и количество липидных капель между различными процедурами для статистической значимости с помощью соответствующего статистического программного обеспечения. Здесь был использован GraphPad Prism.
  3. Анализ гиперспектральных 2D изображений
    1. Используйте программное обеспечение FIJI-ImageJ для обработки всех гиперспектральных 2D-изображений.
    2. Выберите канал 2 930 см-1 , чтобы создать изображение маски, содержащее значения 0 и 1. Присвойте фону значение 0, а области ячейки — значение 1.
    3. Вычтите меченый дейтерием белковый канал (2,175 см-1) в фоновый канал (1,900 см-1), чтобы удалить флуоресцентные эффекты.
    4. Разделите полученный белковый канал, меченный дейтерием, на белковый канал (2,930 см-1), чтобы получить ратиометрические изображения скорости обновления белка.
    5. Затем умножьте изображение маски, полученное на шаге 5.3.2, на ратиометрические изображения, чтобы удалить все оставшиеся фоновые шумы. В результате в каждом ратиометрическом изображении генерируется темный фон.
    6. Используйте инструмент «Произвольное выделение » в FIJI-ImageJ для ручной сегментации и вычисления интенсивности пикселей, отображаемых в отдельных ячейках. Интенсивность пикселей соответствует концентрациям визуализируемой химической связи.
    7. Проанализируйте интенсивность пикселей на предмет статистической значимости в соответствующем статистическом программном приложении. Здесь был использован GraphPad Prism. Повторите этот анализ с оставшимся ратиометрическим анализом.

Результаты

Добавление избытка ААА в 15-кратной концентрации к 50%-нойО-содержащей клеточной питательной среде приводило к образованию отчетливых C-D рамановских полос вновь синтезированных липидов и белков в клетках HeLa (рис. 2B). Предыдущие эксперименты проводились с различными...

Обсуждение

Визуализация DO-SRS и 2PEF была применена для исследования метаболической динамики в различных моделях ex vivo, включая дрозофилу и ткани человека 21,22,23,24,26,27,33. Ме...

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или иных конфликтов интересов.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Яхуана Ли и Энтони Фанга за их техническую поддержку, а также лабораторию Фрейли за клеточную линию. Мы выражаем признательность за стартовые фонды от UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 и Hellman Fellow Award.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Serological Pipettes Avantor (by VWR)75816-100https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge TubeVWR89039-664https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-freeThermoFisher Scientific28906https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plateFisherbrandFB0112929https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PESFoxx Life Sciences381-2216-OEMhttps://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter CubeOlympusOCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser RemoteOlympusSupply power to the laser
Band-pass FilterKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm Terminator Mini CircuitsSTRM-50
BNC CableThorlabs2249-CCoaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric MirrorThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
Centrifuge
CondenserOlympus
Cover GlassCorning2850-25https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supplyTopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagentmpbio 196055https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium PyruvateMilliporeSigma38210000https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate 
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumCorningMT10027CVhttps://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJImageJVersion 1.53t 24 August 2022https://imagej.net/software/fiji/downloads
Heavy Water (Deuterium Oxide)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.7732-18-5https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela CellsATCCCCL-2https://www.atcc.org/products/ccl-2
HemocymeterMilliporeSigmaZ359629-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass FilterChroma TechnologyET890/220mFilter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)Cytiva SH300880340https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) SolutionCytivaSH30042.02https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser SystemApplied Physics & Electronics, Inc.picoEMERALDpicoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning MicroscopeOlympusFV1200MPE
IX3-CBH Control boxOlympusControl the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror MountThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Low-Profile Hex Adjusters
L-PhenalynineSigmaP5482-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-TryptophanSigmaT8941-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6Horiba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In AmplifierZurich InstrumentsN/Ahttps://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam SplitterSemrockDi02-R980-25x36980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLABMathWorksVersion: R2022bhttps://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope SlidesFisherbrand12-550-003https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging SoftwareOlympusFluoView
MPLN 100x, OlympusOlympusMPLAPONhttps://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, OlympusOlympusMPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil CondenserOlympus 6-U130https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail PolishWet n WildB01EO2G5O4https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
OriginOriginLabOrigin 2022b (9.95)https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
ParafilmFisher ScientificS37440https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)Thermofischer - Gibco14040117https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/StreptomycinThermofischer - Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope AssemblyThorlabsRS99Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald SystemA.P.EN/Ahttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC ConnectorsPomona Electronics2902Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode DetectorHome BuiltN/ADYI series
Silicon Wafer
SpacersGrace Bio-Labs654008https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopyHoriba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering MicroscopyHome BuiltN/A
Touch  Panel ControllerOlympusControl the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) Lonza17-942Ehttps://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
TweezersKaverme - AmazonB07RNVXXV1https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Two Photon Excitation Fluorescence MicroscopyHome BuiltN/A
Weighing Paper VWR12578-165https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich LabOneQ SoftwareZurich InstrumentsControl the Zurich lock-in amplifier

Ссылки

  1. Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
  2. Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837 (2020).
  3. Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
  4. Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
  5. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  6. Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
  7. Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
  8. Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
  9. Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
  10. Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
  11. Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. The potential of metabolic imaging. Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).
  12. Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
  13. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
  14. Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
  15. Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
  16. Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
  17. Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
  18. Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
  19. Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
  20. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  21. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  22. Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
  23. Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
  24. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
  27. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
  28. Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
  29. Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
  30. Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
  31. Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
  32. Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
  33. Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
  34. Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
  35. Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
  36. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging. bioRxiv. , (2022).
  37. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  38. Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
  39. Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены