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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.

Zusammenfassung

Essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) sind Bausteine für die Synthese neuer Biomassen in Zellen und die Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen. Zum Beispiel ist ein reichliches Angebot an AAAs für Krebszellen wichtig, um ihr schnelles Wachstum und ihre Teilung aufrechtzuerhalten. Damit steigt die Nachfrage nach einem hochspezifischen, nicht-invasiven Bildgebungsansatz mit minimaler Probenvorbereitung, um direkt zu visualisieren, wie Zellen AAAs für ihren Stoffwechsel in situ nutzen. Hier entwickeln wir eine optische Bildgebungsplattform, die Deuteriumoxid (D2O)-Sondierung mit stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) kombiniert und DO-SRS mit Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (2PEF) in ein einziges Mikroskop integriert, um die Stoffwechselaktivitäten von HeLa-Zellen unter AAA-Regulierung direkt sichtbar zu machen. Insgesamt bietet die DO-SRS-Plattform eine hohe räumliche Auflösung und Spezifität von neu synthetisierten Proteinen und Lipiden in einzelnen HeLa-Zelleinheiten. Darüber hinaus kann die 2PEF-Modalität Autofluoreszenzsignale von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) und Flavin markierungsfrei detektieren. Das hier beschriebene Bildgebungssystem ist sowohl mit In-vitro- als auch mit In-vivo-Modellen kompatibel, was für verschiedene Experimente flexibel ist. Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Protokolls umfasst Zellkultur, Nährmedienvorbereitung, Zellsynchronisation, Zellfixierung und Probenbildgebung mit DO-SRS- und 2PEF-Modalitäten.

Einleitung

Als essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) können Phenylalanin (Phe) und Tryptophan (Tryp) vom menschlichen Körper aufgenommen werden, um neue Moleküle zur Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen zu synthetisieren1. Phe wird für die Synthese von Proteinen, Melanin und Tyrosin benötigt, während Tryp für die Synthese von Melatonin, Serotonin und Niacinbenötigt wird 2,3. Ein übermäßiger Konsum dieser AAAs kann jedoch das Säugetierziel des Rapamycin-Signalwegs (mTOR) hochregulieren, die AMP-aktivierte Proteinkinase hemmen und in den mitochondrialen Stoffwechsel eingreifen, wodurch die Biosynthese von Makromolekülen kollektiv verändert und zur Produktion von bösartigen Vorläufern wie reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in gesunden Zellen geführt wird 4,5,6. Die direkte Visualisierung einer veränderten Stoffwechseldynamik unter übermäßiger AAA-Regulation ist unerlässlich, um die Rolle von AAAs bei der Förderung der Krebsentstehung und des Wachstums gesunder Zellen zu verstehen 7,8,9.

Herkömmliche AAA-Studien stützen sich auf die Gaschromatographie (GC)10. Andere Methoden, wie z. B. die Magnetresonanztomographie (MRT), haben eine begrenzte räumliche Auflösung, was die Durchführung zellulärer und subzellulärer Analysen biologischer Proben erschwert11. Kürzlich wurde die matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) entwickelt, um die Rolle von AAAs bei der Lipid- und Proteinsynthese bei der Krebsproliferation mit nicht-invasiven Biomarkernaufzuklären 12,13,14. Diese Technik leidet jedoch immer noch unter geringen Abbildungstiefen, schlechter räumlicher Auflösung und umfangreicher Probenvorbereitung. Auf zellulärer Ebene können ungiftige stabile Isotope wie Stickstoff-15 und Kohlenstoff-13 mit Multi-Isotopen-Bildgebung und nanoskaliger Sekundärionen-Massenspektrometrie aufgespürt werden, um ihren Einbau in Makromoleküle zu verstehen. Diese Methoden sind jedoch zerstörerisch für lebende biologische Proben15,16. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine weitere leistungsstarke Technik, mit der die Stoffwechseldynamik sichtbar gemacht werden kann17. Die langsame Abtastrate während der AFM-Bildgebung kann hingegen zu einer Bildverzerrung des Ergebnisses durch thermische Drift führen.

Wir haben eine nicht-invasive biorthogonale Bildgebungsmodalität entwickelt, indem wir Deuteriumoxid (D2O)-Sonden-stimulierte Raman-Streumikroskopie (DO-SRS) und markierungsfreie Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) gekoppelt haben. Diese Modalität erreicht eine hohe räumliche Auflösung und chemische Spezifität bei der Abbildung biologischer Proben 18,19,20,21,22,23,24. Dieses Protokoll stellt die Anwendungen von DO-SRS und 2PEF vor, um die metabolische Dynamik von Änderungen des Lipid-, Protein- und Redoxverhältnisses während des Fortschreitens von Krebs zu untersuchen. Da es sich beiD2Oum eine stabile Isotopenform von Wasser handelt, können zelluläre Biomoleküle mit Deuterium (D) markiert werden, da es schnell mit dem gesamten Körperwasser in den Zellen kompensiert wird und Kohlenstoff-Deuterium (C-D)-Bindungen (C-D) durch enzymatischen Austausch bildet21. Die C-D-Bindungen in neu synthetisierten Makromolekülen, einschließlich Lipiden, Proteinen, DNA/RNA und Kohlenhydraten, können in der stillen zellulären Region des Raman-Spektrumsnachgewiesen werden 20,21,22,25,26,27. Mit zwei synchronisierten Laserpulsen können C-D-Bindungen von neu synthetisierten Lipiden und Proteinen mittels hyperspektraler Bildgebung (HSI) auf einzelnen Zellen dargestellt werden, ohne dass sie extrahiert oder mit zytotoxischen Wirkstoffen markiert werden müssen. Darüber hinaus ist die SRS-Mikroskopie in der Lage, dreidimensionale (3D) Modelle ausgewählter Regionen von Interesse in biologischen Proben zu erstellen, indem eine Reihe von Querschnittsbildern aufgenommen und kombiniert wird22,26. Mit hyperspektraler und volumetrischer 3D-Bildgebung kann DO-SRS räumliche Verteilungen von neu synthetisierten Makromolekülen in einzelnen Zellen erhalten, zusammen mit der Art von Organellen, die den Prozess der Förderung des Krebswachstums gemäß AAA-Regulation22 erleichtern. Darüber hinaus können wir mit 2PEF Autofluoreszenzsignale von Flavin und Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) mit hoher Auflösung, tiefer Eindringtiefe und geringer Schädigung in biologischen Proben erhalten21,23,24. Flavin- und NADH-Autofluoreszenzsignale wurden verwendet, um die Redoxhomöostase und Lipidperoxidation in Krebszellen zu charakterisieren22,26. Die Kopplung von DO-SRS und 2PEF ermöglicht somit nicht nur eine subzelluläre Analyse der AAA-regulierten Stoffwechseldynamik in Krebszellen mit hoher räumlicher Verteilung, chemischen Spezifitätsinformationen und minimaler Probenvorbereitung, sondern reduziert auch die Notwendigkeit, endogene Moleküle mit toxischen Reagenzien zu extrahieren oder zu markieren. In diesem Protokoll stellen wir zunächst die Verfahren derD2O- und Aminosäurepräparation sowie der Krebszellkultur vor. Anschließend zeigen wir die Protokolle der DO-SRS-Bildgebung und der 2PEF-Bildgebung. Abschließend präsentieren wir die repräsentativen Ergebnisse der SRS- und 2PEF-Bildgebung, die AAA-regulierte metabolische Veränderungen von Lipiden und Proteinen sowie Änderungen des Redoxverhältnisses in Krebszellen zeigen. Eine detaillierte Darstellung des Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

1. Medienaufbereitung

  1. Bereiten Sie 10 ml Kontroll- und überschüssige AAAs in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 50 %D2Ovor.
    1. Für die Kontrollmedien werden 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) in einem konischen 15-ml-Röhrchen gemessen und gemischt. Das DMEM-Pulver enthält alle Aminosäuren in Standardkonzentrationen. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Fügen Sie 4,7 mlD2O, 0,5 ml fötales Kälberserum (5 % FBS) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) hinzu. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist.
    2. Für das 15x Phe-Behandlungsmedium werden 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5 %) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) in einem konischen 15-ml-Röhrchen abgemessen und gemischt. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Überschüssiges Phe-Pulver in einer Konzentration von 924 mg/L in das Medium geben. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist.
    3. Für das 15x Tryp Behandlungsmedium 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5 %) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) in einem konischen 15-ml-Röhrchen abmessen und mischen. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Überschüssiges Tryp-Pulver in einer Konzentration von 224 mg/L in das Medium geben. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist.
    4. Methionin und Threonin in einer Konzentration von 30,0 mg/ml bzw. 95,0 mg/ml werden zu allen konischen Röhrchen der vorherigen Schritte zugegeben. Wirbeln Sie das Rohr gründlich vor und drehen Sie es um. Natriumpyruvat muss den Nährmedien nicht zugesetzt werden.
    5. Filtern Sie die Kontroll- und Behandlungsmedien mit einem 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit 0,22 μm Polyethersulfon-Membranfiltern.
    6. Versiegeln Sie alle konischen Röhrchen mit Parafolie und lagern Sie sie bei 4 °C bis zu 3 Wochen. Bevor Sie die Zellen mit Medien behandeln, erwärmen Sie alle Medien auf 37 °C.
      HINWEIS: Die pulverförmigen und flüssigen Reagenzien sollten auf der Grundlage des Gesamtvolumens der Behandlungs- und Kontrollmedien gemessen und kombiniert werden.

2. Vorbereitung der Zellprobe

  1. Halten Sie Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa-Zellen) in einem Kulturkolben (d. h. T10, T25 usw.) unter Verwendung von Standard-DMEM, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO2) ergänzt wird.
  2. Subkultur der HeLa-Zellen in einem Split-Verhältnis von 1:10, bis die Zelllebensfähigkeit von 80 % oder höher erreicht ist.
  3. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % oder mehr erreicht haben, werden 2 x 10 5 Zellen pro Well auf eine 24-Well-Platte gesät, wobei DMEM mit0,5 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt wird.
    1. Bereiten Sie vor der Zellaussaat eine 24-Well-Platte mit sterilisierten, lamininbeschichteten, runden Deckgläsern aus Poly-D-Lysin mit einem Durchmesser von 12 mm vor. Tauchen Sie die Deckgläser in 70%iges Ethanol und trocknen Sie sie vorsichtig mit fusselfreien Tüchern. Legen Sie die sauberen Deckgläser in die entsprechenden Vertiefungen der Platte.
    2. Sobald die Zellen in Schritt 2.2 eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Magnesium- und Kalziumionen.
    3. Man fügt 0,25 % Trypsin hinzu, um die adhärenten Zellen aus dem Kolben zu dissoziieren, und inkubiert bei 37 °C und 5 %CO2 für 3 min.
    4. Fügen Sie DMEM hinzu, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt ist, pipettieren Sie vorsichtig auf und ab und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g bei Raumtemperatur (RT) für 3 Minuten.
    5. Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM, ergänzt mit 0,5 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin.
    6. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, einem Lichtmikroskop und Trypanblau und säen Sie eine Dichte von 2 x 105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Alternativ kann ein automatisierter Zellzähler verwendet werden, um die Zellen zu zählen.
    7. Die Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator zurückgelegt und die Platte vorsichtig geschüttelt, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
  4. Ersetzen Sie nach 8 Stunden das alte Nährmedium durch 50 % D2O/überschüssiges Phe oder 50 %D2O/überschüssiges Tryp-Medium. Die Zellen werden 36 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator zurückgelegt.
  5. Nach 36 h fixieren Sie die Zellen auf Objektträgern.
    1. Bereiten Sie vor der Fixierung Objektträger mit Abstandshaltern mit einem Durchmesser von 9 mm vor und geben Sie 15 μl 1x PBS mit Kalzium- und Magnesiumionen anreichern.
    2. Spülen Sie die Zellen mit 1x PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen.
    3. Geben Sie 0,5 ml 4%ige methanolfreie Paraformaldehyd-Lösung (PFA) hinzu und lassen Sie die Platte ca. 15 Minuten lang unter der Biosicherheitshaube.
    4. Saugen Sie die PFA-Lösung an und spülen Sie zweimal mit 1x PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen.
    5. Geben Sie 1,5 ml 1x PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen, in jede Vertiefung.
    6. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig aus jeder Vertiefung zu ziehen. Invertieren Sie die zellhaltige Seite der Deckgläser und legen Sie sie auf die Abstandshalter für die Bildgebung, um das in Schritt 2.5.1 vorbereitete PBS zu kontaktieren. Stellen Sie sicher, dass die nicht zellhaltige Seite mit Luft in Berührung kommt.
    7. Versiegeln Sie die äußere Schicht des Deckglases mit transparentem Nagellack mit dem Abstandshalter.
  6. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C, wenn Sie nicht bebildern.

3. Spontane Raman-Spektroskopie-Messung (Abbildung 2)

  1. Verwenden Sie ein konfokales Raman-Mikroskop, um spontane Raman-Spektren zu erhalten (Abbildung 2A).
  2. Schalten Sie den Laser ein, indem Sie den Schlüssel in die Position ON drehen.
  3. Doppelklicken Sie auf das LabSpec6-Softwaresymbol , um die Erfassungssoftware zu öffnen.
  4. Legen Sie die biologische Probe auf den Probenhalter direkt unter der Objektivlinse.
  5. Klicken Sie in der Software auf das Kamerasymbol , um die Videokamera einzuschalten.
  6. Passen Sie die Fokusebene an, um einen Interessenbereich mit dem 50-fach-Objektiv zu identifizieren. Bewegen Sie den Joystick, um die Hobelverschiebung des XY-Tisches zu steuern, und drehen Sie den Joystick, um die Schärfentiefe zu ändern.
  7. Nachdem Sie die Position für die Messung gewählt haben, wechseln Sie zum 100-fach-Objektiv mit 40 mW Anregungsleistung. Klicken Sie auf das rote Stopp-Symbol , um die Videokamera auszuschalten.
  8. Wählen Sie ein Gitter von 1800 Linien/mm und stellen Sie den Erfassungsbereich von 400 cm-1 bis 3.150 cm-1 ein.
  9. Stellen Sie die Erfassungszeit auf 90 s, die Akkumulation auf 3 und das Binning auf 4 ein, um das geringste Rauschen und das genaueste Spektrum zu erzielen.
    HINWEIS: Diese Bildgebungsparameter können für das Experiment optimiert werden.
  10. Klicken Sie auf das Pfeilsymbol , um die Echtzeitanzeige einzuschalten.
  11. Stellen Sie die Raman-Verschiebung (cm-1) auf einen Wert Ihrer Wahl ein, um die Fokusebene fein abzustimmen.
    ANMERKUNG: In diesem Experiment wurde der Raman-Laser auf die Lipidtröpfchen fokussiert, die eine hohe Konzentration anCH2-Bindungen enthielten. Zu diesem Zweck wurde daher eine Raman-Verschiebung von 2.850 cm-1 gewählt, die den Streckmoden derCH2-Bindung entsprach.
  12. Stellen Sie die Fokusebene mit dem Joystick ein, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren.
  13. Nachdem Sie die Fokusebene ausgewählt haben, klicken Sie auf das rote Stopp-Symbol , um eine Echtzeitanzeige anzuzeigen.
  14. Wählen Sie das Kreissymbol aus, um die Spektrumerfassung zu starten.
  15. Sobald die Zellregion aufgenommen wurde, verwenden Sie dieselbe Fokusebene, um den Hintergrund mit PBS zu messen. Subtrahieren Sie das Hintergrundspektrum von jedem subzellulären Zielspektrum mit einer separaten Computersoftwareanwendung, z. B. Origin (Abbildung 1B).

4. Bildgebende Experimente mit 2PEF und SRS

HINWEIS: Detaillierte Beschreibungen der SRS-Laserausrichtung finden Sie in einem früheren Bericht28. Dieses Protokoll konzentriert sich auf den Betrieb eines multimodalen SRS- und 2PEF-Bildgebungssystems (Abbildung 2C, D).

  1. Klicken Sie auf Start , um den Laser aufzuwärmen.
  2. Befolgen Sie die Reihenfolge, um die Hauptschalter des Steuergeräts und des Monitors einzuschalten: 1) Drücken Sie den Hauptschalter der Steuereinheit IX3-CBH auf Ein, 2) Drücken Sie den Hauptschalter des Touchpanel-Controllers auf Ein, 3) Drücken Sie den Hauptschalter des Netzteils des Netzteils für LD OBIS 6 Laser Remote, das mit dem Hauptlaserkombinator FV31-SCOMB verbunden ist, auf Einund 4) Drücken Sie den Hauptschalter des Netzteils des Netzteils für LD OBIS 6 Laser Remote, das mit dem Sub-Laser-Combiner FV31-SCOMB verbunden ist, auf Ein.
  3. Drücken Sie die Hauptschalter des Si-Fotodiodendetektors und des Lock-in-Verstärkers auf Ein.
  4. Stellen Sie den Stokes-Strahl auf 1.031 nm, die Pulsbreite auf 6 ps und die Wiederholrate auf 80 MHz ein.
  5. Gekoppelt mit dem Mikroskop stellen Sie das picoEmerald-System ein, das mit dem synchronisierten Pumpstrahl mit einer abstimmbaren Wellenlänge von 720-990 nm, einer Pulsbreite von 5-6 ps und einer Wiederholrate von 80 MHz geliefert wird. Die durchschnittliche Erregerleistung sowohl der Pumpe als auch der Stokes beträgt 450 mW. Optimieren Sie die Anregungsleistung, um Lichtschäden für die Probe zu minimieren.
  6. Verwenden Sie einen Ölkondensator mit hoher numerischer Apertur (NA) (d. h. 1,4 NA), um die Stokes- und Pumpbalken zu sammeln, an denen die Probe montiert ist, indem einige Tropfen auf den Kondensator abgegeben werden.
  7. Montieren Sie die Probe auf das Öl und platzieren Sie einen großen Wassertropfen auf dem Objektträger, an dem die Probe befestigt ist. Dies gilt für das Wasserimmersionsobjektiv.
  8. Stellen Sie den Lock-in-Verstärker auf 20 MHz ein. Bearbeiten Sie das Bild nun mit dem Super-Resolution-Softwaremodul.
  9. Wählen Sie 512 Pixel x 512 Pixel und 80 μs/Pixel für die Verweilzeit.
  10. Sobald die gewünschte Zellregion richtig fokussiert ist, nehmen Sie das Bild auf. Speichern Sie die Bilder mit der Erfassungssoftware des Mikroskops als .oir-Grafikdatei von Olympus.
  11. Erfassen Sie ein Hintergrundbild bei 1.900 cm-1 und subtrahieren Sie es von allen zellulären Bildern.
  12. Um eine 2PEF-Bildgebung durchzuführen, verwenden Sie denselben abstimmbaren Pikosekundenlaser und stellen Sie die markierungsfreie Autofluoreszenz von Flavin und NADH auf 800 nm bzw. 780 nm ein.
  13. Verwenden Sie einen 460 nm/515 nm Filterwürfel, um die rückgestreute Flavin- und NADH-Autofluoreszenzemission zu sammeln.
  14. Stellen Sie die Verweilzeit auf 8 μs/Pixel und die Pixelgröße auf 512 Pixel x 512 Pixel ein. Stellen Sie den Parameter für die Laserverschlussleistung auf 150 mW ein.
  15. Für die 3D-Bildrekonstruktion stellen Sie den stimulierten Raman-Verlust auf 2.850 cm-1 (797 nm) ein.
  16. Sobald die gewünschten Einzelzellen identifiziert wurden, registrieren Sie den Laser, um von der oberen Fokusebene aus zu scannen, um die oberen und unteren Schichten dieser Zellen zu erkennen.
    HINWEIS: 3D-Modelle werden als OIR-Dateien generiert und gespeichert.

5. Spektren und Bildanalyse

  1. Spektrenanalyse
    1. Verwenden Sie die Origin-Software oder andere relevante Anwendungen, um das Hintergrundspektrum von allen subzellulären Zielspektren zu subtrahieren.
    2. Verwenden Sie die mathematischen Modellierungsoperationen von MATLAB, um die Raman-Spektren mit den integrierten Funktionen der Software zu verarbeiten. Python kann auch für die Spektrenverarbeitung verwendet werden.
      1. Die spektrale Vorverarbeitung beginnt mit der Konvertierung der Dateien in ein Array. Die Spektren werden auf jedem reziproken Zentimeter interpoliert.
      2. Stellen Sie zur Validierung die Rohdaten grafisch dar. Führen Sie die Basislinienkorrektur für die Rohspektren mit der integrierten Funktion msbackadj in MATLAB durch. Kurz gesagt, die integrierte Funktion schätzt Basislinienpunkte anhand von Trennungseinheitenwerten, die von Benutzern identifiziert wurden, und gibt den Abstand zwischen benachbarten Fenstern zurück. Schätzen und zeichnen Sie anhand der Basislinienpunkte eine Regressionsgerade. Wenden Sie Glättung an, um die Regressionsgerade zu glätten und die Basislinie von jedem einzelnen Rohspektrum zu subtrahieren.
      3. Führen Sie eine Min-Max-Normalisierung durch, indem Sie die Raman-Intensität des Proteins bei 2.930 cm-1 durch die Intensität jeder Raman-Verschiebung dividieren. Das 2.930 cm-1-Signal ist typischerweise die höchste Intensität im Raman-Spektrum . Bei dieser Normalisierung wird der Maximalwert in eine 1 umgewandelt, während der Minimalwert in eine 0 umgewandelt wird. Jeder zweite Wert wird in eine Dezimalzahl zwischen 0 und 1 umgewandelt.
      4. Mitteln Sie die einzelnen Spektren desselben Zustands zu einem einzigen Spektrum, um das Rauschen zu reduzieren.
    3. Verwenden Sie nach der Verarbeitung Anwendungen wie Origin, um alle Spektren gleichzeitig anzuzeigen. Die in den Spektren dargestellten Peaks stellen eine bestimmte chemische Bindung oder funktionelle Gruppe dar.
  2. 3D-Bildanalyse von Lipidtröpfchen
    1. Verwenden Sie die FIJI-ImageJ-Software, um alle 3D-Bilder zu verarbeiten
    2. Führen Sie die Funktionen Bandpassfilter und Glättung für die 3D-Bildstapel aus.
    3. Für die 3D-Bildanalyse weisen Sie jedem Lipidtröpfchen einen sphärischen Score zu, der durch Messung des Abstands zwischen seinem Massenschwerpunkt und der Oberfläche berechnet wird. Vergleichen Sie jede sphärische Partitur mit einer sphärischen Partitur einer perfekten Kugel auf derselben euklidischen Ebene. Verwerfen Sie Lipidtröpfchen mit niedrigen sphärischen Werten und bewerten Sie die verbleibenden Lipidtröpfchen auf ihr Volumen und ihre Anzahl.
    4. Analysieren Sie das Volumen und die Anzahl der Lipidtröpfchen zwischen verschiedenen Behandlungen auf statistische Signifikanz in einer geeigneten statistischen Softwareanwendung. Hier kam GraphPad Prism zum Einsatz.
  3. Hyperspektrale 2D-Bildanalyse
    1. Verwenden Sie die FIJI-ImageJ-Software, um alle hyperspektralen 2D-Bilder zu verarbeiten.
    2. Wählen Sie den Kanal 2.930 cm-1 aus, um ein Maskenbild mit den Werten 0 und 1 zu erstellen. Weisen Sie den Hintergrund 0 und den Zellbereich 1 zu.
    3. Subtrahieren Sie den Deuterium-markierten Proteinkanal (2.175 cm-1) vom Hintergrundkanal (1.900 cm-1), um die Fluoreszenzeffekte zu entfernen.
    4. Dividieren Sie den resultierenden Deuterium-markierten Proteinkanal durch den Proteinkanal (2.930 cm-1), um ratiometrische Bilder der Proteinumsatzrate zu erhalten.
    5. Multiplizieren Sie dann das in Schritt 5.3.2 erstellte Maskenbild mit den ratiometrischen Bildern, um alle verbleibenden Hintergrundgeräusche zu entfernen. Dadurch wird in jedem ratiometrischen Bild ein dunkler Hintergrund erzeugt.
    6. Verwenden Sie das Freihandauswahl-Werkzeug in FIJI-ImageJ, um die in einzelnen Zellen angezeigten Pixelintensitäten manuell zu segmentieren und zu berechnen. Die Pixelintensitäten entsprechen den Konzentrationen der chemischen Bindung, die visualisiert wird.
    7. Analysieren Sie die Pixelintensitäten auf statistische Signifikanz in einer geeigneten Statistiksoftwareanwendung. Hier kam GraphPad Prism zum Einsatz. Wiederholen Sie diese Analyse mit der verbleibenden ratiometrischen Analyse.

Ergebnisse

Die Zugabe von überschüssigen AAAs in 15-facher Konzentration zu den 50%D2O-haltigenZellkulturmedien führte zu deutlichen C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine in HeLa-Zellen (Abbildung 2B). Frühere Experimente wurden mit unterschiedlichen Konzentrationsniveaus durchgeführt, z. B. 2x und 5x, und obwohl die Daten nicht präsentiert werden, erzeugte die 15-fache Konzentration die deutlichsten C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine. Insbesond...

Diskussion

DO-SRS- und 2PEF-Bildgebung wurden eingesetzt, um die Stoffwechseldynamik in verschiedenen Ex-vivo-Modellen zu untersuchen, darunter Drosophila und menschliches Gewebe 21,22,23,24,26,27,33. Die in dieser Studie verwendete Bildgebungsmodalität integriert DO-SRS und 2PEF-Mikroskopie,...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Dr. Yajuan Li und Anthony Fung für ihre technische Unterstützung und dem Fraley-Labor für die Zelllinie. Wir bedanken uns für die Anschubfinanzierung von UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 und Hellman Fellow Award.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Serological Pipettes Avantor (by VWR)75816-100https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge TubeVWR89039-664https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-freeThermoFisher Scientific28906https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plateFisherbrandFB0112929https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PESFoxx Life Sciences381-2216-OEMhttps://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter CubeOlympusOCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser RemoteOlympusSupply power to the laser
Band-pass FilterKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm Terminator Mini CircuitsSTRM-50
BNC CableThorlabs2249-CCoaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric MirrorThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
Centrifuge
CondenserOlympus
Cover GlassCorning2850-25https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supplyTopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagentmpbio 196055https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium PyruvateMilliporeSigma38210000https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate 
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumCorningMT10027CVhttps://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJImageJVersion 1.53t 24 August 2022https://imagej.net/software/fiji/downloads
Heavy Water (Deuterium Oxide)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.7732-18-5https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela CellsATCCCCL-2https://www.atcc.org/products/ccl-2
HemocymeterMilliporeSigmaZ359629-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass FilterChroma TechnologyET890/220mFilter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)Cytiva SH300880340https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) SolutionCytivaSH30042.02https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser SystemApplied Physics & Electronics, Inc.picoEMERALDpicoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning MicroscopeOlympusFV1200MPE
IX3-CBH Control boxOlympusControl the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror MountThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Low-Profile Hex Adjusters
L-PhenalynineSigmaP5482-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-TryptophanSigmaT8941-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6Horiba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In AmplifierZurich InstrumentsN/Ahttps://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam SplitterSemrockDi02-R980-25x36980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLABMathWorksVersion: R2022bhttps://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope SlidesFisherbrand12-550-003https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging SoftwareOlympusFluoView
MPLN 100x, OlympusOlympusMPLAPONhttps://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, OlympusOlympusMPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil CondenserOlympus 6-U130https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail PolishWet n WildB01EO2G5O4https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
OriginOriginLabOrigin 2022b (9.95)https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
ParafilmFisher ScientificS37440https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)Thermofischer - Gibco14040117https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/StreptomycinThermofischer - Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope AssemblyThorlabsRS99Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald SystemA.P.EN/Ahttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC ConnectorsPomona Electronics2902Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode DetectorHome BuiltN/ADYI series
Silicon Wafer
SpacersGrace Bio-Labs654008https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopyHoriba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering MicroscopyHome BuiltN/A
Touch  Panel ControllerOlympusControl the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) Lonza17-942Ehttps://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
TweezersKaverme - AmazonB07RNVXXV1https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Two Photon Excitation Fluorescence MicroscopyHome BuiltN/A
Weighing Paper VWR12578-165https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich LabOneQ SoftwareZurich InstrumentsControl the Zurich lock-in amplifier

Referenzen

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