הארכת תוחלת החיים של נויטרופילים עם CLON-G ובדיקת מוות ספונטני במבחנה

Summary

פרוטוקול זה מפרט את הכנת CLON-G להארכת תוחלת החיים של נויטרופילים ליותר מ-5 ימים ומספק הליך אמין להערכת מוות נויטרופילים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי.

Abstract

תוחלת החיים הממוצעת של נויטרופילים היא פחות מ-24 שעות, מה שמגביל את המחקר הבסיסי על נויטרופילים ואת היישום של מחקרי נויטרופילים. המחקר הקודם שלנו הצביע על כך שמסלולים מרובים יכולים לתווך את המוות הספונטני של נויטרופילים. קוקטייל פותח על ידי התמקדות בו זמנית במסלולים אלה, עיכוב קספזות-ליזוזומליות של קרום החדירה-חמצון-נקרופטוזיס בתוספת גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (CLON-G), אשר האריך את תוחלת החיים של הנויטרופילים ליותר מ -5 ימים מבלי לפגוע באופן משמעותי בתפקוד הנויטרופילים. במקביל פותח גם פרוטוקול אמין ויציב להערכה והערכה של מוות נויטרופילים. בעבודה זו, אנו מראים כי CLON-G יכול להאריך את תוחלת החיים של נויטרופילים במבחנה ליותר מ -5 ימים, ואנו מציגים את התארכות תוחלת החיים של נויטרופילים באמצעות FACS ומיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. דו"ח זה מציג נהלים להכנת CLON-G ומציג בדיקת מוות ספונטני במבחנה של נויטרופילים, אשר יכולה לשמש לחקר נויטרופילים ולאחר מכן לחקור מוות נויטרופילים, ובכך לספק משאב אמין לקהילת הנויטרופילים.

Introduction

נויטרופילים ידועים כמרכיבים ארסנל של גרגירים ציטופלזמיים בשפע, ניקוטין-אמיד אדנין די-נוקלאוטיד פוספט (NADPH) אוקסידאז, אנזימים אנטי-מיקרוביאליים ואברונים שונים המגנים מפני חיידקים פולשים; בנוסף, הם תנועתיים מאוד והם התאים הראשונים שגויסו לאתר הדלקת, כלומר נויטרופילים הם קו ההגנה הראשון של מערכת החיסון המולדת ^1,2. טיפול בעירוי גרנולוציטים הפך לפיכך לטיפול קליני מבטיח לזיהומים הקשורים לנויטרופניה כדי להגביר באופן זמני את חסינות הנויטרופילים ^3,4,5. תגליות אחרונות הראו בבירור כי נויטרופילים מתפקדים גם כמשפיעים רב-פנים בתרחישים פיזיולוגיים רבים⁶. תוחלת החיים הממוצעת של נויטרופיל היא פחות מ -24 שעות, ולכן, מחקר בסיסי על נויטרופילים ויישום של מחקרי נויטרופילים הם קשים מאוד בשל המגבלות הקשורות מניפולציה גנטית יציבה ואחסון לטווח ארוך 7,8,9,10,11 . ישנם כמה קווי תאים שיכולים להציג באופן חלקי כמה פונקציות נויטרופילים, כגון HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1, ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים¹². קווי תאים אלה יכולים להשיג עריכה גנטית יעילה ושימור בהקפאה; עם זאת, הם עדיין שונים במידה עצומה מנויטרופילים ראשוניים, ולכן אינם יכולים לשחזר נאמנה פונקציות נויטרופילים¹³. לפיכך, רוב המחקר בתחום זה עדיין מסתמך על נויטרופילים ראשוניים טריים שבודדו. השדה עדיין מסתמך על יצירת עכברים מותנים יקרים וגוזלי זמן כדי לחקור תפקודים גנטיים ספציפיים בנויטרופילים, אך כיום לא קיימים מודלים אנושיים.

לאחר שהשקענו את מאמצינו לחקור את התהליכים ההטרוגניים המעורבים במוות של נויטרופילים ואת המסלולים המרובים המווסתים תהליכים אלה^14,15, דווח לאחרונה על טיפול חדש המכונה CLON-G (caspases-lysosomal membrane permebilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating-stimulating factor) ¹⁶. CLON-G מורכב מ-Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorophenoxy]-methyl ketone), Hsp70 (חלבון הלם חום 70), DFO (דפרוקסאמין), NAC (N-אצטיל-ציסטאין), Nec-1s (נקרוסטטין-1s) ו-G-CSF (גורם מגרה מושבת גרנולוציטים). מוות ספונטני של נויטרופילים מתווך על ידי מסלולים מרובים, כולל אפופטוזיס, נקרופטוזיס ופירופטוזיס. Q-VD-oph מעכב אפופטוזיס של נויטרופילים כמעכב פאן-קספז על ידי התמקדות בקספז 1, קספז 3, קספז 8 וקספז 9¹⁷. נקרופטוזיס נויטרופיל תלוי במסלול איתות הכולל חלבון קינאז-1 (RIPK1) וחלבון דמוי תחום קינאז שושלת מעורבת (MLKL)¹⁸. כמעכב RIPK1, Nec-1s מעכב את הנקרופטוזיס של נויטרופילים. Hsp70 ו-DFO יכולים לעכב חדירות קרום ליזוזומלי (LMP), מה שעלול לגרום לאפופטוזיס^{נויטרופילים 19} ולפירופטוזיס²⁰. מיני חמצן תגובתי (ROS) ממלאים תפקידים חיוניים במוות של נויטרופילים על ידי תיווך LMP¹⁹ ואפופטוזיס²¹ ועל ידי עיכוב אותות הישרדות²². כנוגד חמצון שיכול להפחית הצטברות ROS, NAC מעכב מוות של נויטרופילים. כגורם גדילה, G-CSF מפעיל אותות הישרדות נויטרופילים ומעכב אפופטוזיס^23,24 המושרה על ידי calpain. על ידי התמקדות בו זמנית במסלולי מוות ספונטניים מרובים של נויטרופילים, ניתן להאריך ביעילות את תוחלת החיים של הנויטרופילים ליותר מ-5 ימים מבלי לפגוע בתפקודם. טיפול CLON-G מרחיב את האפשרויות של שימור נויטרופילים, שינוע ומניפולציה גנטית, אשר יכולים להאיץ את המחקר בקהילת הנויטרופילים. בינתיים, בהתבסס על הידע על מוות נויטרופילים, הפרוטוקולים המאושרים כיום לבדיקות מוות תאי יכולים לגרום נזק בלתי צפוי לנויטרופילים¹⁴, ולכן פרוטוקולים אלה שוכללו כך שיתאימו יותר למחקרי נויטרופילים. דו"ח זה מספק פרוטוקולים מפורטים לתרבית נויטרופילים עם CLON-G ובדיקת מוות תאי במבחנה של נויטרופילים בעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה והדמיית פלואורסצנטיות. CLON-G יעיל הן על עכברים והן על נויטרופילים אנושיים; עם זאת, דגימות העכבר מודגמות כאן כדי לפשט פרוטוקול זה. הריכוז של NAC הוא 1 מילימטר עבור נויטרופילים של עכברים ו-10 מיקרומטר עבור נויטרופילים אנושיים. Hsp70 הוא ספציפי למין, ולכן יש להשתמש בו בהתאם למקור הנויטרופיל. עבור פרוטוקול זה, אין זה משנה אם נויטרופילים מבודדים מדם היקפי או מח עצם וכיצד הם מבודדים.

במחקר הנוכחי, נויטרופילים בודדו ממח עצם של עכבר כדי להשיג מספיק נויטרופילים לניסויים, שכן ניתן להשיג כ 1 x 10 7-1.5 x 10⁷ נויטרופילים ממח העצם, בעוד שרק 1 x 10 6 נויטרופילים ניתן לבודד מהדם ההיקפי של עכבר יחיד בן 8-12 שבועות C57BL/⁶ (משני המינים). צנטריפוגה הדרגתית בוצעה כדי למנוע נזק והפעלה אפשריים מהגירוי המכני של מיון FACS או מיון MACS.

Protocol

בית החולים לילדים בבוסטון ומעבדת המפתח הממלכתית להמטולוגיה ניסויית (SKLEH) הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרו ופיקחו על כל הנהלים. איור 1 מתאר תרשים זרימה של תרבית נויטרופילים עם CLON-G ומבחן המוות במבחנה .

1. הארכת תוחלת החיים של נויטרופילים עם CLON-G

הערה: כל הפעולות והחומרים שהוזכרו חייבים להיות סטריליים. ודא שכל הפתרונות מעורבבים היטב ומפוזרים באופן שווה.

1. שימור רכיבי CLON-G
   1. יש להמיס 50 מ"ג של Q-VD-oph (ראו טבלת חומרים) לריכוז סופי של 100 מילימטר על ידי הוספת 973.7 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO), ולקפט את הנוזל עד שהתערובת מתבהרת. Aliquot 50 μL לכל צינור, ולשמר ב -20 ° C.
      אזהרה: DMSO הוא נוזל כימי מזיק. יש ללבוש חלוק מעבדה, משקפי מגן ומסכה כדי למנוע מגע עורי, מגע עין ושאיפה.
   2. הפשירו את Hsp70 (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C, וסובבו כלפי מטה את התוכן בבקבוקון. Aliquot 1 μL של Hsp70 לכל צינור על קרח, ולשמר ב -80 ° C.
      הערה: Hsp70 הוא חלבון; אחסון קר במיוחד נחוץ כדי לשמור על יציבותו. הימנעו ממחזור ההקפאה-הפשרה.
   3. יש להמיס 1 מ"ג DFO (ראה טבלת חומרים) עם 7.61 מ"ל סל"ד 1640 לקבלת מלאי של 200 מיקרומטר. Aliquot 500 μL לכל צינור, ולשמור ב -20 ° C.
   4. יש להמיס 0.1 גרם של NAC (ראו טבלת חומרים) עם 2.5 מ"ל של סל"ד 1640 בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ולהתאים את רמת החומציות ל-7-7.4 עם NaOH. הוסף את RPMI 1640 לנפח סופי של 3.06 מ"ל כדי ליצור מלאי NAC של 200 mM. סנן אותו עם יחידת סינון של 0.2 מיקרומטר. Aliquot 500 μL לכל צינור, ולשמר ב -20 ° C.
      הערה: לא קל להמיס NAC בריכוז הגבוה הזה, ומערבולות יכולות לעזור להמיס אותו. פנול אדום בסל"ד 1640 הוא אינדיקציה מושלמת ל- pH; כאשר NAC רק מומס, הצבע צהבהב; התאימו אותו עד שהוא הופך ורדרד. תמיסות NAC יציבות למשך עד חודש אחד בטמפרטורה של -20°C.
   5. יש להמיס 10 מ"ג של Nec-1s (ראו טבלת חומרים) ל-20 מ"ל עם 1.8 מ"ל DMSO, ולפיפטה את התערובת עד שהיא מתבהרת. Aliquot 50 μL לכל צינור, ולשמר ב -20 ° C. יש להגן מפני אור.
   6. יש להמיס 250 מיקרוגרם של G-CSF (ראה טבלת חומרים) ל-200 מיקרוגרם/מ"ל עם 1.25 מ"ל של סל"ד 1640. Aliquot 50 μL לכל צינור, ולשמר ב 4 °C.
2. הכנת 2x מדיום תרבית CLON-G
   1. הכינו את המדיום הבסיסי. הוסף 39.5 מ"ל של RPMI 1640, 10 מ"ל של נסיוב בקר עוברי (FBS), ו 0.5 מ"ל pen-strep (אנטיביוטיקה) לצינור 50 מ"ל כדי להפוך RPMI 1640 עם 20% FBS ו 1% PS כמדיום בסיסי.
      הערה: ריכוז גבוה זה של FBS משמש כדי לספק תרבית ממושכת של נויטרופילים, אשר עשוי להיות גדול מ 5 ימים. אם זמן הטיפוח הוא 1-2 ימים, 10%-15% FBS מספיק.
   2. הפשירו את כל פתרונות המלאי של רכיבי CLON-G על קרח.
   3. לדלל 1 μL של Hsp70 עד 20 μM על ידי הוספת 606 μL של המדיום הבסיסי. לדלל 1 μL של 200 μg / mL G-CSF ל 20 מיקרוגרם / מ"ל על ידי הוספת 9 μL של המדיום הבסיסי.
   4. הוסף 976 μL של מדיום בסיסי לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. הוסף 1 μL של Q-VD-oph (100 mM), 10 μL של DFO (200 μM), 1 μL של Hsp70 (20 μM), 10 μL של NAC (200 mM), 1 μL של Nec-1s (20 mM), ו 1 μL של G-CSF (20 μg / mL) כדי ליצור 1 מ"ל של 2x CLON-G בינוני.
      הערה: יש להשתמש בתווך CLON-G 2x מיד לאחר הכנתו. ניתן לאחסן את 2x CLON-G באופן זמני בטמפרטורה של 4°C. יש להשליך שאריות של 20 מיקרומטר Hsp70.
3. תרבות נויטרופילים
   1. בידוד נויטרופילים של עכברים על ידי צנטריפוגה הדרגתית בעקבות דו"ח קודם²⁵. השהה מחדש את הנויטרופילים המבודדים של העכבר בתווך הבסיסי (1 מיליון תאים / 100 מיקרוליטר).
      הערה: הימנע מהפעלת הנויטרופילים על ידי טיפול עדין בהם. יש להימנע מהקצפה במהלך כל התהליך.
   2. הוסף 500 μL של 2x CLON-G בינוני, 400 μL של התווך הבסיסי, ו 100 μL של תרחיף התא ללוחות תרבית 24 באר שאינם רקמות תרבית (ראה טבלה של חומרים), ופיפטה עדינה שלוש עד ארבע פעמים.
      הערה: ריכוזים גבוהים של הרכיבים בתווך CLON-G 2x עלולים לפגוע בנויטרופילים; הימנע מלהוסיף אותם יחד ללא המדיום הבסיסי. צלחת התרבית שאינה רקמה נחוצה כדי למנוע הידבקות נויטרופילים.
   3. מניחים את צלחת התרבית בחממה של 37°C ו-5% CO₂ בצורה חלקה.
      הערה: אין צורך להחליף את התווך התא תוך 7 ימים. הריכוזים הסופיים של הרכב CLON-G הם 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s ו-10 ng/mL G-CSF.
   4. צבעו את הנויטרופילים המתורבתים בכתם תרכובת רייט גימסה (ראו טבלת חומרים), ונתחו בעזרת מיקרוסקופ אור (איור 2A-D). לחלופין, יש להכתים באמצעות נוגדנים APC-CD11b ו-PE-Cy7-Ly6G, ולנתח באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2E-I) כפי שתואר קודם לכן²⁶.

2. בדיקת מוות ספונטנית במבחנה של נויטרופילים

1. ניתוח ציטומטריית זרימה
   1. תרבית בודדה נויטרופילים בצפיפות של 1 מיליון תאים/מ"ל בתווך הבסיסי ב-37°C ו-5% CO₂. צלחת התרבית בת 24 הבארות אינה תרבית רקמות. מוסיפים 1 מ"ל של תא בינוני לכל באר.
   2. להמיס 1 גרם של CaCl 2 עם 45 מ"ל של מלוחים כדי להפוך 200 mM CaCl₂. סנן אותו עם יחידת סינון של 0.2 מיקרומטר. יש לשמר בטמפרטורה של 4°C.
   3. מכינים את תערובת הצביעה. הוסף 7 מיקרוליטר מלח לדגימה לצינור של 1.5 מ"ל, והוסף 0.4 מ"ג/מ"ל FITC-Annexin-V, 0.5 מ"ג/מ"ל פרופידיום יודיד (PI) ותמיסת CaCl₂ של 200 מ"מ ב-1 מיקרוליטר כל דגימה. מערבבים היטב. השתמש בפתרון מיד לאחר ההכנה.
   4. פיפטה התא תווך בעדינות חמש עד שבע פעמים כדי לערבב היטב, ולאחר מכן להעביר 100 μL לצינור ציטומטריה זרימה בנקודות הזמן הרצויות.
      הערה: יש להימנע מהקצפה במהלך כל התהליך.
   5. מערבולת ספירת חרוזים (ראה טבלת חומרים) כדי לערבב אותם היטב. פיפטה 10 μL של חרוזי ספירה מעורבים היטב לאותו ציטומטריה זרימה כמו בשלב 2.1.4.
   6. הוסף 10 μL את תערובת הצביעה המוכנה (שלב 2.1.3) לצינור ציטומטריית הזרימה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות הרחק מהאור.
   7. מוסיפים 100 μL של מלוחים לצינור, ומערבבים היטב כדי להבטיח פיזור אחיד של חרוזי ספירה ותאים.
   8. לבצע ניתוח ציטומטריה זרימה של תווך התא. אסוף את התאים בקצב נמוך עם ~400 אירועים לשנייה. שער תאי APC-PE-Cy7- ל- FSC-A ו- SSC-A, ושער התאים השלמים עם עמדות FSC-A ו- SSC-A בינוניות ל- FITC-Annexin-V ו- PE-PI; אוכלוסיית Annexin-V⁻PI⁻ מסווגת כתאים בריאים.
      הערה: המשוואות הבאות קובעות את המספר הכולל של תאים בריאים בכל דגימה ואת יכולת הקיום של הנויטרופילים:
      המספר הכולל של תאים בריאים לדגימה²⁷ = (1,000/מספר ספירת חרוזים) × מספר אוכלוסיית Annexin-V⁻PI^{− ×} 10
      כדאיות של נויטרופילים = המספר הכולל של תאים בריאים בזמן המצוין / המספר הכולל של תאים בריאים בזמן אפס
2. בדיקת תמונה פלואורסצנטית
   1. תרבית בודדה נויטרופילים בצפיפות של 1 מיליון תאים/מ"ל בתווך הבסיסי ב-37°C ו-5%_CO2 בלוח קונפוקלי עם 2 מ"ל של תווך התא לכל צלחת.
      הערה: למיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי יש את איכות התמונה הטובה ביותר, אך כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל תעלות 488/561/DIC מספיק כדי לתמוך בניסוי זה.
   2. הוציאו את הצלחת בעדינות בנקודת הזמן שצוינה. הוסף 10 μL כל אחד של 0.4 מ"ג / מ"ל FITC-Annexin-V, 0.5 מ"ג / מ"ל PI, ו 200 mM CaCl₂ לצלחת באופן שווה. מכתימים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      הערה: יש להימנע מרעד במהלך כל התהליך. מוסיפים את חומרי הכתמים באופן אחיד ועדין.
   3. צלם תמונות פלואורסצנטיות בתעלות 488 (annexin-V)/561 (PI)/DIC באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי עם עדשה אובייקטיבית של 20x (ראה טבלת חומרים). הגדר את זמן החשיפה של ערוץ 488 כ- 500 אלפיות השנייה, ערוץ 561 כ- 200 אלפיות השנייה וערוץ ה- DIC כ- 100 אלפיות השנייה. בחר 5-10 אזורים אקראיים עבור כל לוחית. סוגי התאים מוגדרים בדוח¹⁴ שפורסם בעבר.

תוצאות

המורפולוגיה המוכתמת של רייט-גימסה (איור 2A-D) ופנוטיפים של FACS (איור 2E-J) של הנויטרופילים שטופלו ב-CLON-G לא הושפעו. הכדאיות של נויטרופילים שטופלו ב-CLON-G תוך 24 שעות הייתה בערך 90%+ בהתבסס על ניתוח ציטומטריית זרימה (איור ...

Discussion

נויטרופילים ממלאים תפקידים חיוניים בחסינות מולדת ונרכשת, וההומאוסטזיס שלהם מוסדר היטב. נויטרופילים הם הלויקוציטים הנפוצים ביותר בדם ההיקפי האנושי, ויש להם מחזור חזק ומהיר. מבוגר בריא יכול לשחרר 1 x 10⁹ נויטרופילים / ק"ג מדי יום ממח העצם²⁸. מותם של נויטרופילים הפך אפוא לאחת ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.