Estensione della durata della vita dei neutrofili con CLON-G e un saggio di morte spontanea in vitro

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione di CLON-G per estendere la durata della vita dei neutrofili a più di 5 giorni e fornisce una procedura affidabile per valutare la morte dei neutrofili con citometria a flusso e microscopia a fluorescenza confocale.

Abstract

La durata media della vita di un neutrofilo è inferiore a 24 ore, il che limita la ricerca di base sui neutrofili e l'applicazione degli studi sui neutrofili. La nostra ricerca precedente ha indicato che percorsi multipli potrebbero mediare la morte spontanea dei neutrofili. È stato sviluppato un cocktail mirando simultaneamente a queste vie, l'inibizione della permeabilizzazione della membrana licasi-ossidante-necroptosi delle caspasi-lisosomiali più il fattore stimolante le colonie di granulociti (CLON-G), che ha prolungato la durata della vita dei neutrofili a più di 5 giorni senza compromettere significativamente la funzione dei neutrofili. Contemporaneamente, è stato sviluppato anche un protocollo affidabile e stabile per valutare e valutare la morte dei neutrofili. In questo lavoro, dimostriamo che CLON-G può prolungare la durata della vita dei neutrofili in vitro a più di 5 giorni e mostriamo l'allungamento della durata della vita dei neutrofili con FACS e microscopia a fluorescenza confocale. Questo rapporto introduce procedure per la preparazione di CLON-G e presenta un saggio di morte spontanea in vitro dei neutrofili, che può essere utilizzato per lo studio dei neutrofili e per interrogare successivamente la morte dei neutrofili, fornendo così una risorsa affidabile per la comunità dei neutrofili.

Introduzione

I neutrofili sono noti per comprendere un arsenale di abbondanti granuli citoplasmatici, nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi, enzimi antimicrobici e vari organelli che difendono dai microbi invasori; Inoltre, sono altamente mobili e sono le prime cellule reclutate nel sito di infiammazione, il che significa che i neutrofili sono la prima linea di difesa del sistema immunitario innato ^1,2. La terapia trasfusionale con granulociti è quindi diventata un trattamento clinico promettente per le infezioni correlate alla neutropenia per aumentare transitoriamente l'immunità dei neutrofili ^3,4,5. Recenti scoperte hanno chiaramente dimostrato che i neutrofili funzionano anche come effettori multifacciali in molti scenari fisiopatologici⁶. La vita media di un neutrofilo è inferiore a 24 ore e, quindi, la ricerca di base sui neutrofili e l'applicazione degli studi sui neutrofili sono tremendamente difficili a causa delle limitazioni legate alla manipolazione genetica stabile e alla conservazione a lungo termine 7,8,9,10,11 . Ci sono alcune linee cellulari che possono parzialmente mostrare alcune funzioni dei neutrofili, come HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 e cellule staminali pluripotenti indotte¹². Queste linee cellulari possono ottenere un efficace editing genico e crioconservazione; Tuttavia, differiscono ancora immensamente dai neutrofili primari e, quindi, non possono ricapitolare fedelmente le funzioni dei neutrofili¹³. Pertanto, la maggior parte della ricerca in questo campo si basa ancora su neutrofili primari appena isolati. Il campo si basa ancora sulla generazione di topi knock-out condizionali costosi e dispendiosi in termini di tempo per studiare specifiche funzioni geniche nei neutrofili, ma attualmente non esistono modelli umani.

Dopo aver messo il nostro impegno nell'esplorare i processi eterogenei coinvolti nella morte dei neutrofili e le molteplici vie che regolano questi processi^14,15, è stato recentemente riportato un nuovo trattamento denominato CLON-G (permeabilizzazione della membrana caspasica-lisosomiale - inibizione dell'ossidante-necroptosi più fattore stimolante le colonie di granulociti) ¹⁶. CLON-G è costituito da Q-VD-oph (chinolil-valil-O-metilaspartil-[-2,6-difluorofenossi]-metil chetone), Hsp70 (proteina da shock termico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteina), Nec-1s (necrostatina-1) e G-CSF (fattore stimolante le colonie di granulociti). La morte spontanea dei neutrofili è mediata da molteplici vie, tra cui apoptosi, necroptosi e piroptosi. Q-VD-oph inibisce l'apoptosi dei neutrofili come inibitore della pan-caspasi prendendo di mira la caspasi 1, la caspasi 3, la caspasi 8 e la caspasi 9¹⁷. La necroptosi dei neutrofili dipende da una via di segnalazione che coinvolge la proteina chinasi-1 che interagisce con il recettore (RIPK1) e la proteina mista della chinasi chinasi (MLKL)¹⁸. Come inibitore di RIPK1, i Nec-1 inibiscono la necroptosi dei neutrofili. Hsp70 e DFO possono inibire la permeabilizzazione lisosomiale della membrana (LMP), che potrebbe indurre l'apoptosi¹⁹ dei neutrofili e la piroptosi²⁰. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo vitale nella morte dei neutrofili mediando LMP¹⁹ e apoptosi²¹ e inibendo i segnali di sopravvivenza²². Come antiossidante che può ridurre l'accumulo di ROS, NAC ritarda la morte dei neutrofili. Come fattore di crescita, il G-CSF attiva i segnali di sopravvivenza dei neutrofili e inibisce l'apoptosi indotta dalla calpaina^23,24. Prendendo di mira simultaneamente più vie di morte spontanea dei neutrofili, la durata della vita dei neutrofili può essere efficacemente estesa a più di 5 giorni senza comprometterne la funzione. Il trattamento con CLON-G espande le possibilità di conservazione, trasporto e manipolazione genica dei neutrofili, che possono accelerare la ricerca nella comunità dei neutrofili. Nel frattempo, sulla base della conoscenza della morte dei neutrofili, i protocolli attualmente approvati per i test di morte cellulare possono causare danni imprevisti ai neutrofili¹⁴, quindi questi protocolli sono stati perfezionati per essere più appropriati per gli studi sui neutrofili. Questo rapporto fornisce protocolli dettagliati per la coltura di neutrofili con CLON-G e un saggio di morte cellulare in vitro di neutrofili di topo utilizzando citometria a flusso e imaging a fluorescenza. CLON-G è efficace sia sui neutrofili murini che umani; Tuttavia, i campioni di mouse sono dimostrati qui per semplificare questo protocollo. La concentrazione di NAC è di 1 mM per i neutrofili di topo e di 10 μM per i neutrofili umani. Hsp70 è specie-specifico e, quindi, dovrebbe essere utilizzato in base alla fonte del neutrofilo. Per questo protocollo, non importa se i neutrofili sono isolati dal sangue periferico o dal midollo osseo e come sono isolati.

Per il presente studio, i neutrofili sono stati isolati dal midollo osseo di topo per ottenere abbastanza neutrofili per gli esperimenti, poiché circa 1 x 10 7-1,5 x 10⁷ neutrofili possono essere ottenuti dal midollo osseo, mentre solo 1 x 10 6 neutrofili possono essere isolati dal sangue periferico di un singolo topo C57BL /⁶ di 8-12 settimane (di entrambi i sessi). La centrifugazione a gradiente è stata condotta per evitare possibili danni e l'attivazione dalla stimolazione meccanica della selezione FACS o MACS.

Protocollo

Il Boston Children's Hospital e lo State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee hanno approvato e monitorato tutte le procedure. La figura 1 mostra un diagramma di flusso della coltura di neutrofili con CLON-G e il saggio di morte in vitro .

1. Estensione della durata della vita dei neutrofili con CLON-G

NOTA: Tutte le operazioni e i materiali menzionati devono essere sterili. Assicurati che tutte le soluzioni siano ben miscelate e distribuite uniformemente.

1. Conservazione dei componenti CLON-G
   1. Sciogliere 50 mg di Q-VD-oph (vedere Tabella dei materiali) fino a una concentrazione finale di 100 mM aggiungendo 973,7 μL di dimetilsolfossido (DMSO) e pipettare il liquido fino a quando la miscela diventa limpida. Aliquot 50 μL per provetta e conservare a -20 °C.
      ATTENZIONE: DMSO è un liquido chimico dannoso. Indossare un camice da laboratorio, occhiali e una maschera per evitare il contatto con la pelle, il contatto visivo e l'inalazione.
   2. Scongelare Hsp70 (vedere Tabella dei materiali) a 4 °C e ruotare verso il basso il contenuto del flaconcino. Aliquot 1 μL di Hsp70 per tubo su ghiaccio, e conservare a -80 °C.
      NOTA: Hsp70 è una proteina; La conservazione ultra-fredda è necessaria per mantenerla stabile. Evitare il ciclo gelo-disgelo.
   3. Sciogliere 1 mg di DFO (vedere tabella dei materiali) con 7,61 mL RPMI 1640 per ottenere una riserva di 200 μM. Aliquot 500 μL per provetta e conservare a -20 °C.
   4. Sciogliere 0,1 g di NAC (vedere Tabella dei materiali) con 2,5 ml di RPMI 1640 in una provetta da centrifuga da 15 mL e regolare il pH a 7-7,4 con NaOH. Aggiungi RPMI 1640 a un volume finale di 3,06 mL per creare uno stock NAC da 200 mM. Filtrarlo con un'unità filtrante da 0,2 μm. Aliquot 500 μL per provetta, e conservare a -20 °C.
      NOTA: Sciogliere NAC in questa alta concentrazione non è facile, e vortice può aiutare a dissolverlo. Il rosso fenolo in RPMI 1640 è una perfetta indicazione del pH; quando il NAC è appena sciolto, il colore è giallastro; Regolalo fino a quando non diventa rosato. Le soluzioni madre di NAC sono stabili fino a 1 mese a -20 °C.
   5. Sciogliere 10 mg di Nec-1 (vedere Tabella dei materiali) a 20 mM con 1,8 mL di DMSO e pipettare la miscela fino a quando non diventa limpida. Aliquot 50 μL per provetta e conservare a -20 °C. Proteggere dalla luce.
   6. Sciogliere 250 μg di G-CSF (vedere Tabella dei materiali) a 200 μg/mL con 1,25 mL di RPMI 1640. Aliquot 50 μL per tubo, e conservare a 4 °C.
2. Preparazione di 2x terreno di coltura CLON-G
   1. Preparare il mezzo di base. Aggiungere 39,5 ml di RPMI 1640, 10 ml di siero bovino fetale (FBS) e 0,5 mL di pen-streptococco (antibiotici) a un tubo da 50 mL per ottenere RPMI 1640 con 20% FBS e 1% PS come terreno di base.
      NOTA: Questa alta concentrazione di FBS viene utilizzata per fornire la coltura prolungata di neutrofili, che potrebbe essere superiore a 5 giorni. Se il tempo di coltura è di 1-2 giorni, è sufficiente il 10% -15% di FBS.
   2. Scongelare tutte le soluzioni stock dei componenti CLON-G sul ghiaccio.
   3. Diluire 1 μL di Hsp70 a 20 μM aggiungendo 606 μL del mezzo di base. Diluire 1 μL di 200 μg/mL G-CSF a 20 μg/mL aggiungendo 9 μL del terreno di base.
   4. Aggiungere 976 μL di terreno di base in una provetta da centrifuga da 15 ml. Aggiungere 1 μL di Q-VD-oph (100 mM), 10 μL di DFO (200 μM), 1 μL di Hsp70 (20 μM), 10 μL di NAC (200 mM), 1 μL di Nec-1s (20 mM) e 1 μL di G-CSF (20 μg / mL) per ottenere 1 mL di mezzo 2x CLON-G.
      NOTA: il mezzo 2x CLON-G deve essere utilizzato immediatamente dopo la preparazione. Si può conservare temporaneamente il 2x CLON-G a 4 °C. Gli avanzi di 20 μM Hsp70 devono essere eliminati.
3. Coltura di neutrofili
   1. Isolare i neutrofili di topo mediante centrifugazione a gradiente seguendo una precedente relazione²⁵. Risospendere i neutrofili di topo isolati nel mezzo di base (1 milione di cellule/100 μL).
      NOTA: Evitare di attivare i neutrofili maneggiandoli delicatamente. Evitare la formazione di schiuma durante l'intero processo.
   2. Aggiungere 500 μL di 2x terreno CLON-G, 400 μL del terreno di base e 100 μL della sospensione cellulare in piastre di coltura non tissutale a 24 pozzetti (vedere Tabella dei materiali) e pipettare delicatamente tre o quattro volte.
      NOTA: Alte concentrazioni dei componenti nel mezzo 2x CLON-G potrebbero danneggiare i neutrofili; Evita di sommarli insieme senza il supporto di base. La piastra di coltura non coltivata in tessuto è necessaria per evitare l'adesione dei neutrofili.
   3. Posizionare agevolmente la piastra di coltura in un'incubatrice a 37 °C e al 5 % di CO₂ .
      NOTA: non è necessario sostituire il supporto cellulare entro 7 giorni. Le concentrazioni finali della composizione di CLON-G sono 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s e 10 ng/mL G-CSF.
   4. Colorare i neutrofili in coltura con la colorazione composta di Wright Giemsa (vedi Tabella dei materiali) e analizzarli al microscopio ottico (Figura 2A-D). In alternativa, colorare con anticorpi APC-CD11b e PE-Cy7-Ly6G e analizzare con citometria a flusso (Figura 2E-I) come descritto in precedenza²⁶.

2. Saggio di morte spontanea in vitro dei neutrofili

1. Analisi citometrica a flusso
   1. Neutrofili isolati in coltura ad una densità di 1 milione di cellule/ml nel mezzo di base a 37 °C e 5% di CO₂. La piastra di coltura a 24 pozzetti non è coltivata in tessuto. Aggiungere 1 mL di terreno cellulare per pozzetto.
   2. Sciogliere 1 g di CaCl 2 con 45 mL di soluzione salina per ottenere 200 mM di CaCl₂. Filtrarlo con un'unità filtrante da 0,2 μm. Conservare a 4 °C.
   3. Preparare la miscela di colorazione. Aggiungere 7 μL di soluzione salina per campione in una provetta da 1,5 mL e aggiungere 0,4 mg/mL di FITC-Annexin-V, 0,5 mg/mL di ioduro di propidio (PI) e 200 mM di soluzione di CaCl₂ a 1 μL ciascuno per campione. Mescolare bene. Utilizzare la soluzione immediatamente dopo la preparazione.
   4. Pipettare delicatamente il mezzo cellulare da cinque a sette volte per miscelare bene, quindi trasferire 100 μL in un tubo di citometria a flusso nei punti temporali desiderati.
      NOTA: Evitare la formazione di schiuma durante l'intero processo.
   5. Perle di conteggio dei vortici (vedi Tabella dei materiali) per mescolarle bene. Pipettare 10 μL delle sfere di conteggio ben miscelate nello stesso tubo citometrico a flusso del punto 2.1.4.
   6. Aggiungere 10 μL della miscela colorante preparata (fase 2.1.3) al tubo citometrico a flusso. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti lontano dalla luce.
   7. Aggiungere 100 μL di soluzione salina al tubo e mescolare bene per garantire la distribuzione uniforme delle perle e delle celle di conteggio.
   8. Eseguire l'analisi della citometria a flusso del mezzo cellulare. Raccogli le celle a una velocità bassa con ~ 400 eventi / s. Collegare le celle APC-PE-Cy7- a FSC-A e SSC-A e collegare le celle intatte con posizioni medie FSC-A e SSC-A alle FITC-Annexin-V e PE-PI; la popolazione Annexin-V^−PI− è classificata come cellule sane.
      NOTA: Le seguenti equazioni determinano il numero totale di cellule sane per campione e la vitalità dei neutrofili:
      Numero totale di cellule sane per campione²⁷ = (1.000/numero di perline di conteggio) × numero di popolazione di Annexin-V^−PI− × 10
      Vitalità dei neutrofili = numero totale di cellule sane al momento indicato/numero totale di cellule sane al tempo zero
2. Saggio di immagini fluorescenti
   1. Neutrofili isolati in coltura ad una densità di 1 milione di cellule/ml nel terreno di base a 37 °C e al 5% di CO 2 in una piastra confocale con₂ mL di terreno cellulare per piastra.
      NOTA: Un microscopio a fluorescenza confocale ha la migliore qualità dell'immagine, ma qualsiasi microscopio a fluorescenza con canali 488/561/DIC è sufficiente per supportare questo esperimento.
   2. Estrarre delicatamente il piatto nel punto temporale indicato. Aggiungere uniformemente alla piastra 10 μL ciascuno di 0,4 mg/mL FITC-Annexin-V, 0,5 mg/mL PI e 200 mM CaCl₂ . Colorare a temperatura ambiente per 5 min.
      NOTA: Evitare di agitare durante l'intero processo. Aggiungere gli agenti coloranti in modo uniforme e delicato.
   3. Acquisire immagini a fluorescenza a 488 (annessina-V)/561 (PI)/canali DIC utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale con una lente obiettiva 20x (vedere Tabella dei materiali). Impostare il tempo di esposizione del canale 488 su 500 ms, il canale 561 su 200 ms e il canale DIC su 100 ms. Seleziona 5-10 aree casuali per ogni piatto. I tipi di cellule sono definiti nel nostro rapporto¹⁴ pubblicato in precedenza.

Risultati

La morfologia colorata con Wright-Giemsa (Figura 2A-D) e i fenotipi FACS (Figura 2E-J) dei neutrofili trattati con CLON-G non sono stati influenzati. La vitalità dei neutrofili trattati con CLON-G a 24 ore era di circa il 90%+ sulla base dell'analisi della citometria a flusso (Figura 3) e dei saggi di immagini fluorescenti (Figura 4). ...

Discussione

I neutrofili svolgono ruoli vitali nell'immunità innata e adattativa e la loro omeostasi è strettamente regolata. I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue periferico umano e hanno un turnover robusto e veloce. Un adulto sano può rilasciare 1 x 10⁹ neutrofili / kg al giorno dal midollo osseo²⁸. La morte dei neutrofili è quindi diventata uno degli enigmi sconcertanti di questo campo, e molti sforzi sono stati dedicati a comprenderli meglio. Caspasi 29,30,31,32, LMP 33,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.