Prolongation de la durée de vie des neutrophiles avec CLON-G et un test de mort spontanée in vitro

Résumé

Ce protocole détaille la préparation de CLON-G pour prolonger la durée de vie des neutrophiles à plus de 5 jours et fournit une procédure fiable pour évaluer la mort des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie confocale à fluorescence.

Résumé

La durée de vie moyenne d’un neutrophile est inférieure à 24 h, ce qui limite la recherche fondamentale sur les neutrophiles et l’application des études sur les neutrophiles. Nos recherches antérieures ont indiqué que de multiples voies pourraient intervenir dans la mort spontanée des neutrophiles. Un cocktail a été développé en ciblant simultanément ces voies, les caspases-perméabilisation-inhibition de la nécroptose de la membrane lysosomale et le facteur de stimulation des colonies de granulocytes (CLON-G), qui a prolongé la durée de vie des neutrophiles à plus de 5 jours sans compromettre de manière significative la fonction des neutrophiles. Parallèlement, un protocole fiable et stable pour évaluer la mort des neutrophiles a également été élaboré. Dans ce travail, nous montrons que CLON-G peut prolonger la durée de vie des neutrophiles in vitro à plus de 5 jours, et nous présentons l’allongement de la durée de vie des neutrophiles avec FACS et la microscopie confocale à fluorescence. Ce rapport présente des procédures pour la préparation du CLON-G et présente un essai in vitro de mort spontanée des neutrophiles, qui peut être utilisé pour l’étude des neutrophiles et pour interroger ensuite la mort des neutrophiles, fournissant ainsi une ressource fiable pour la communauté des neutrophiles.

Introduction

Les neutrophiles sont connus pour comprendre un arsenal de granules cytoplasmiques abondants, de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase, d’enzymes antimicrobiennes et de divers organites qui se défendent contre les microbes envahisseurs; De plus, ils sont très mobiles et sont les premières cellules recrutées sur le site de l’inflammation, ce qui signifie que les neutrophiles sont la première ligne de défense du système immunitaire inné ^1,2. La thérapie transfusionnelle de granulocytes est donc devenue un traitement clinique prometteur pour les infections liées à la neutropénie afin de renforcer transitoirement l’immunité des neutrophiles ^3,4,5. Des découvertes récentes ont clairement montré que les neutrophiles fonctionnent également comme effecteurs multifaces dans de nombreux scénarios physiopathologiques⁶. La durée de vie moyenne d’un neutrophile est inférieure à 24 heures et, par conséquent, la recherche fondamentale sur les neutrophiles et l’application d’études sur les neutrophiles sont extrêmement difficiles en raison des limites liées à la manipulation génétique stable et au stockage à long terme 7,8,9,10,11 . Certaines lignées cellulaires peuvent présenter partiellement certaines fonctions neutrophiles, telles que HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 et les cellules souches pluripotentes induites¹². Ces lignées cellulaires peuvent réaliser une édition et une cryoconservation efficaces des gènes; Cependant, ils diffèrent encore énormément des neutrophiles primaires et, par conséquent, ne peuvent pas récapituler fidèlement les fonctions des neutrophiles¹³. Ainsi, la plupart des recherches dans ce domaine reposent encore sur des neutrophiles primaires fraîchement isolés. Le domaine repose toujours sur la génération de souris knock-out conditionnelles coûteuses et chronophages pour étudier des fonctions génétiques spécifiques dans les neutrophiles, mais aucun modèle humain n’existe actuellement.

Après avoir déployé nos efforts pour explorer les processus hétérogènes impliqués dans la mort des neutrophiles et les multiples voies qui régulent ces processus^14,15, un nouveau traitement appelé CLON-G (caspases-perméabilisation de la membrane lysosomale-oxydant-inhibition de la nécroptose plus facteur de stimulation des colonies de granulocytes) a récemment été rapporté ¹⁶. CLON-G se compose de Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-méthylaspartyl-[-2,6-difluorophénoxy]-méthylcétone), Hsp70 (protéine de choc thermique 70), DFO (déféroxamine), NAC (N-acétylcystéine), Nec-1s (nécrostatine-1s) et G-CSF (facteur de stimulation des colonies de granulocytes). La mort spontanée des neutrophiles est médiée par de multiples voies, y compris l’apoptose, la nécroptose et la pyroptose. La Q-VD-oph inhibe l’apoptose des neutrophiles en tant qu’inhibiteur de pan-caspase en ciblant la caspase 1, la caspase 3, la caspase 8 et la caspase 9¹⁷. La nécroptose neutrophile dépend d’une voie de signalisation impliquant la protéine kinase-1 interagissant avec les récepteurs (RIPK1) et la protéine mixte de type domaine kinase de lignée (MLKL)¹⁸. En tant qu’inhibiteur de RIPK1, les Nec-1 inhibent la nécroptose des neutrophiles. Hsp70 et DFO peuvent inhiber la perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP), ce qui pourrait induire l’apoptose des neutrophiles¹⁹ et la pyroptose²⁰. Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle vital dans la mort des neutrophiles en médiant LMP¹⁹ et apoptose²¹ et en inhibant les signaux de survie²². En tant qu’antioxydant pouvant réduire l’accumulation de ROS, la NAC retarde la mort des neutrophiles. En tant que facteur de croissance, le G-CSF active les signaux de survie des neutrophiles et inhibe l’apoptose induite par la calpaïne^23,24. En ciblant simultanément plusieurs voies de mort spontanée des neutrophiles, la durée de vie des neutrophiles peut être prolongée efficacement à plus de 5 jours sans compromettre leur fonction. Le traitement par CLON-G élargit les possibilités de préservation, de transport et de manipulation génétique des neutrophiles, ce qui peut accélérer la recherche dans la communauté des neutrophiles. Pendant ce temps, sur la base de la connaissance de la mort des neutrophiles, les protocoles actuellement approuvés pour les tests de mort cellulaire peuvent causer des dommages inattendus aux neutrophiles¹⁴, de sorte que ces protocoles ont été affinés pour être plus appropriés pour les études sur les neutrophiles. Ce rapport fournit des protocoles détaillés pour la culture des neutrophiles avec CLON-G et un test in vitro de mort cellulaire des neutrophiles de souris utilisant la cytométrie en flux et l’imagerie par fluorescence. CLON-G est efficace sur les neutrophiles de souris et d’humains; Cependant, les échantillons de souris sont présentés ici pour simplifier ce protocole. La concentration de NAC est de 1 mM pour les neutrophiles de souris et de 10 μM pour les neutrophiles humains. Hsp70 est spécifique à l’espèce et, par conséquent, devrait être utilisé en fonction de la source du neutrophile. Pour ce protocole, peu importe que les neutrophiles soient isolés du sang périphérique ou de la moelle osseuse et comment ils sont isolés.

Pour la présente étude, les neutrophiles ont été isolés de la moelle osseuse de souris pour obtenir suffisamment de neutrophiles pour les expériences, car environ 1 x 10 7-1,5 x 10⁷ neutrophiles peuvent être obtenus à partir de la moelle osseuse, tandis que seulement 1 x 10 6 neutrophiles peuvent être isolés du sang périphérique d’une seule souris C57BL/⁶ âgée de 8 à 12 semaines (de l’un ou l’autre sexe). La centrifugation par gradient a été réalisée pour éviter d’éventuels dommages et activations dus à la stimulation mécanique du tri FACS ou du tri MACS.

Protocole

Le comité de soin et d’utilisation des animaux du Boston Children’s Hospital et du State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) a approuvé et surveillé toutes les procédures. La figure 1 illustre un organigramme de la culture des neutrophiles avec CLON-G et le test de mort in vitro .

1. Prolongation de la durée de vie des neutrophiles avec CLON-G

NOTE: Toutes les opérations et le matériel mentionnés doivent être stériles. Assurez-vous que toutes les solutions sont bien mélangées et réparties uniformément.

1. Préservation des composants CLON-G
   1. Dissoudre 50 mg de Q-VD-oph (voir le tableau des matières) jusqu’à une concentration finale de 100 mM en ajoutant 973,7 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et pipeter le liquide jusqu’à ce que le mélange devienne clair. Aliquote 50 μL par tube, et conserver à −20 °C.
      ATTENTION : Le DMSO est un liquide chimique nocif. Portez une blouse de laboratoire, des lunettes de protection et un masque pour éviter le contact avec la peau, le contact oculaire et l’inhalation.
   2. Décongeler Hsp70 (voir le tableau des matières) à 4 °C et faire tourner le contenu dans le flacon. Aliquote 1 μL de Hsp70 par tube sur glace, et conserver à −80 °C.
      REMARQUE: Hsp70 est une protéine; Un stockage ultra-froid est nécessaire pour le maintenir stable. Évitez le cycle gel-dégel.
   3. Dissoudre 1 mg de DFO (voir le tableau des matières) avec 7,61 mL RPMI 1640 pour obtenir un stock de 200 μM. Aliquote 500 μL par tube, et conserver à −20 °C.
   4. Dissoudre 0,1 g de NAC (voir le tableau des matières) avec 2,5 mL de RPMI 1640 dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajuster le pH à 7-7,4 avec NaOH. Ajouter RPMI 1640 à un volume final de 3,06 mL pour obtenir un stock NAC de 200 mM. Filtrez-le avec une unité de filtration de 0,2 μm. Aliquote 500 μL par tube, et conserver à −20 °C.
      REMARQUE: Dissoudre NAC dans cette concentration élevée n’est pas facile, et le vortex peut aider à le dissoudre. Le rouge de phénol dans RPMI 1640 est une indication parfaite du pH; lorsque le NAC vient de se dissoudre, la couleur est jaunâtre; Ajustez-le jusqu’à ce qu’il devienne rosâtre. Les solutions mères NAC sont stables jusqu’à 1 mois à −20 °C.
   5. Dissoudre 10 mg de Nec-1s (voir le tableau des matières) à 20 mM avec 1,8 mL de DMSO, et pipeter le mélange jusqu’à ce qu’il devienne clair. Aliquote 50 μL par tube, et conserver à −20 °C. Protéger de la lumière.
   6. Dissoudre 250 μg de G-CSF (voir le tableau des matières) à 200 μg/mL avec 1,25 mL de RPMI 1640. Aliquote 50 μL par tube, et conserver à 4 °C.
2. Préparation du milieu de culture 2x CLON-G
   1. Préparez le support de base. Ajouter 39,5 mL de RPMI 1640, 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS) et 0,5 mL de stylo-streptocoque (antibiotiques) à un tube de 50 mL pour obtenir RPMI 1640 avec 20% FBS et 1% PS comme milieu de base.
      NOTE: Cette concentration élevée de FBS est utilisée pour assurer la culture prolongée de neutrophiles, qui peut être supérieure à 5 jours. Si le temps de culture est de 1-2 jours, 10%-15% FBS est suffisant.
   2. Décongeler toutes les solutions mères des composants CLON-G sur la glace.
   3. Diluer 1 μL de Hsp70 à 20 μM en ajoutant 606 μL du milieu basique. Diluer 1 μL de 200 μg/mL DE G-CSF à 20 μg/mL en ajoutant 9 μL du milieu basique.
   4. Ajouter 976 μL de milieu basique à un tube à centrifuger de 15 mL. Ajouter 1 μL de Q-VD-oph (100 mM), 10 μL de DFO (200 μM), 1 μL de Hsp70 (20 μM), 10 μL de NAC (200 mM), 1 μL de Nec-1s (20 mM) et 1 μL de G-CSF (20 μg/mL) pour obtenir 1 mL de 2x milieu CLON-G.
      REMARQUE: Le milieu CLON-G 2x doit être utilisé immédiatement après sa préparation. On peut stocker temporairement le 2x CLON-G à 4 °C. Les restes de 20 μM Hsp70 doivent être jetés.
3. Culture de neutrophiles
   1. Isoler les neutrophiles de souris par centrifugation par gradient suite à un précédent rapport²⁵. Resuspendre les neutrophiles isolés de souris dans le milieu basique (1 million de cellules/100 μL).
      REMARQUE: Évitez d’activer les neutrophiles en les manipulant doucement. Évitez la formation de mousse pendant tout le processus.
   2. Ajouter 500 μL de 2x milieu CLON-G, 400 μL du milieu basique et 100 μL de la suspension cellulaire sur des plaques de culture non tissulaires à 24 puits (voir le tableau des matières) et pipeter doucement trois à quatre fois.
      NOTE: Des concentrations élevées des composants dans le milieu CLON-G 2x peuvent endommager les neutrophiles; Évitez de les additionner sans le support de base. La plaque de culture non tissulaire est nécessaire pour éviter l’adhésion des neutrophiles.
   3. Placez la plaque de culture dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ en douceur.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’échanger le support cellulaire dans les 7 jours. Les concentrations finales de la composition de CLON-G sont de 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s et 10 ng/mL G-CSF.
   4. Colorer les neutrophiles cultivés avec une coloration composée Wright Giemsa (voir Tableau des matériaux) et analyser au microscope optique (Figure 2A-D). Alternativement, colorer avec les anticorps APC-CD11b et PE-Cy7-Ly6G, et analyser avec la cytométrie de flux (Figure 2E-I) comme décrit précédemment²⁶.

2. Essai in vitro de mort spontanée des neutrophiles

1. Analyse de cytométrie en flux
   1. La culture a isolé les neutrophiles à une densité de 1 million de cellules/mL dans le milieu basique à 37 °C et 5 % de CO₂. La plaque de culture de 24 puits est non cultivée de tissus. Ajouter 1 mL de milieu cellulaire par puits.
   2. Dissoudre 1 g de CaCl2_avec 45 mL de solution saline pour obtenir 200 mM de CaCl2_. Filtrez-le avec une unité de filtration de 0,2 μm. Conserver à 4 °C.
   3. Préparez le mélange de coloration. Ajouter 7 μL de solution saline par échantillon dans un tube de 1,5 mL et ajouter 0,4 mg/mL de FITC-Annexin-V, 0,5 mg/mL d’iodure de propidium (IP) et 200 mM de solution de CaCl₂ à 1 μL chacun par échantillon. Bien mélanger. Utilisez la solution immédiatement après la préparation.
   4. Pipeter doucement le milieu cellulaire cinq à sept fois pour bien mélanger, puis transférer 100 μL dans un tube de cytométrie en flux aux points de temps souhaités.
      REMARQUE: Évitez de mousser pendant tout le processus.
   5. Perles de comptage de vortex (voir Tableau des matériaux) pour bien les mélanger. Pipeter 10 μL des billes de comptage bien mélangées dans le même tube de cytométrie en flux qu’à l’étape 2.1.4.
   6. Ajouter 10 μL du mélange de coloration préparé (étape 2.1.3) dans le tube de cytométrie en flux. Incuber à température ambiante pendant 5 min à l’abri de la lumière.
   7. Ajouter 100 μL de solution saline dans le tube et bien mélanger pour assurer la répartition uniforme des billes et des cellules de comptage.
   8. Effectuer une analyse cytométrique en flux du milieu cellulaire. Collectez les cellules à un faible taux avec ~400 événements/s. Porter les cellules APC-PE-Cy7- vers FSC-A et SSC-A, et Placer les cellules intactes avec des positions FSC-A et SSC-A moyennes vers les FITC-Annexin-V et PE-PI; la population annexine-V⁻PI⁻ est classée comme cellules saines.
      NOTE: Les équations suivantes déterminent le nombre total de cellules saines par échantillon et la viabilité des neutrophiles:
      Nombre total de cellules saines par échantillon²⁷ = (1 000/nombre de billes de comptage) × nombre de population d’Annexine-V⁻PI⁻ × 10
      Viabilité des neutrophiles = nombre total de cellules saines au moment indiqué/nombre total de cellules saines au temps zéro
2. Essai d’images fluorescentes
   1. La culture a isolé les neutrophiles à une densité de 1 million de cellules/mL dans le milieu basique à 37 °C et 5 % de CO 2 dans une plaque confocale avec₂ mL de milieu cellulaire par plaque.
      REMARQUE: Un microscope confocal à fluorescence a la meilleure qualité d’image, mais tout microscope à fluorescence doté de canaux 488/561 / DIC est suffisant pour soutenir cette expérience.
   2. Retirez doucement l’assiette au point de temps indiqué. Ajouter 10 μL chacun de 0,4 mg/mL de FITC-Annexin-V, 0,5 mg/mL PI et 200 mM de CaCl₂ dans la plaque uniformément. Colorer à température ambiante pendant 5 min.
      REMARQUE: Évitez de trembler pendant tout le processus. Ajouter les agents colorants uniformément et doucement.
   3. Capturez des images de fluorescence à 488 (annexine-V)/561 (PI)/canaux DIC à l’aide d’un microscope confocale à fluorescence avec une lentille d’objectif 20x (voir le tableau des matériaux). Définissez le temps d’exposition du canal 488 sur 500 ms, le canal 561 sur 200 ms et le canal DIC sur 100 ms. Sélectionnez 5 à 10 zones aléatoires pour chaque assiette. Les types de cellules sont définis dans notre rapport¹⁴ publié précédemment.

Résultats

La morphologie colorée Wright-Giemsa (Figure 2A-D) et les phénotypes FACS (Figure 2E-J) des neutrophiles traités par CLON-G n’ont pas été affectés. La viabilité des neutrophiles traités par CLON-G à 24 heures était d’environ 90%+ d’après l’analyse par cytométrie en flux (Figure 3) et les essais par image fluorescente (Figure ...

Discussion

Les neutrophiles jouent un rôle essentiel dans l’immunité innée et adaptative, et leur homéostasie est étroitement réglementée. Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique humain, et ils ont un renouvellement robuste et rapide. Un adulte en bonne santé peut libérer 1 x 10⁹ neutrophiles / kg par jour de la moelle osseuse²⁸. La mort des neutrophiles est donc devenue l’une des énigmes déroutantes de ce domaine, et beaucoup d’efforts ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.