CLON-G 및 In Vitro Spontaneous Death Assay를 통한 호중구 수명 연장

요약

이 프로토콜은 호중구 수명을 5일 이상으로 연장하기 위한 CLON-G의 준비를 자세히 설명하고 유세포 분석 및 공초점 형광 현미경으로 호중구 사멸을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 절차를 제공합니다.

초록

호중구의 평균 수명은 24시간 미만으로 호중구에 대한 기초 연구와 호중구 연구의 적용을 제한합니다. 우리의 이전 연구는 여러 경로가 호중구의 자발적인 죽음을 매개할 수 있음을 나타냅니다. 카스파제-리소좀 막 투과-산화제-괴사 억제와 과립구 집락 자극 인자(CLON-G)와 같은 경로를 동시에 표적으로 삼아 칵테일을 개발하여 호중구 기능을 크게 손상시키지 않으면서 호중구 수명을 5일 이상으로 연장했습니다. 동시에 호중구 사망을 평가하고 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 안정적인 프로토콜도 개발되었습니다. 본 연구에서는 CLON-G가 시험관 내에서 호중구의 수명을 5일 이상으로 연장할 수 있음을 보여주고, FACS 및 공초점 형광현미경을 통해 호중구의 수명을 연장하는 것을 보여줍니다. 이 보고서는 CLON-G 준비 절차를 소개하고 호중구 연구 및 후속 호중구 사멸 조사에 사용할 수 있는 호중구의 시험관 내 자연 사망 분석을 보여줌으로써 호중구 커뮤니티에 신뢰할 수 있는 리소스를 제공합니다.

서문

호중구는 풍부한 세포질 과립, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH) 산화효소, 항균 효소 및 침입하는 미생물을 방어하는 다양한 세포 기관의 무기고를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 또한, 그들은 운동성이 높고 염증 부위에 모집 된 첫 번째 세포이며, 이는 호중구가 선천성 면역계의 첫 번째 방어선임을 의미합니다 ^1,2. 따라서 과립구 수혈 요법은 호중구 면역을 일시적으로 증가시키기 위해 호중구 감소증 관련 감염에 대한 유망한 임상 치료법이 되었다 ^3,4,5. 최근의 발견은 호중구가 많은 생리병리학적 시나리오에서 다면적 효과기로도 기능한다는 것을 분명히 보여주었다⁶. 호중구의 평균 수명은 24시간 미만이며, 따라서 호중구에 대한 기초 연구와 호중구 연구의 적용은 안정적인 유전자 조작 및 장기 저장과 관련된 한계로 인해 매우 어렵습니다 7,8,9,10,11 . HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 및 유도만능줄기세포(¹²)와 같은 일부 호중구 기능을 부분적으로 나타낼 수 있는 세포주가 있다. 이러한 세포주는 효과적인 유전자 편집 및 냉동 보존을 달성할 수 있습니다. 그러나 그것들은 여전히 일차 호중구와 상당히 다르기 때문에 호중구 기능을 충실하게 요약할 수 없다¹³. 따라서 이 분야의 대부분의 연구는 여전히 새로 분리된 1차 호중구에 의존합니다. 이 분야는 여전히 호중구의 특정 유전자 기능을 조사하기 위해 비용과 시간이 많이 소요되는 조건부 녹아웃 마우스를 생성하는 데 의존하지만 현재 인간 모델은 존재하지 않습니다.

호중구 사멸과 관련된 이질적인 과정과 이러한 과정을 조절하는 여러 경로를 탐구하기 위해 노력한 결과,^14,15, CLON-G(카스파제-리소좀 막 투과화-산화제-괴사 억제 및 과립구 집락 자극 인자)라는 새로운 치료법이 최근 보고되었다¹⁶. CLON-G는 Q-VD-oph(퀴놀릴-발릴-O-메틸아스파르틸-[-2,6-디플루오로페녹시]-메틸 케톤), Hsp70(열충격 단백질 70), DFO(데페록사민), NAC(N-아세틸시스테인), Nec-1s(네크로스타틴-1s) 및 G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자). 호중구 자연사는 세포자멸사, 괴사증 및 파이롭토시스를 포함한 여러 경로에 의해 매개됩니다. Q-VD-oph는 카스파아제 1, 카스파아제 3, 카스파아제 8, 카스파아제 9를 표적으로 하여 pan-카스파아제 억제제로서 호중구의 세포자멸사를 억제한다¹⁷. 호중구 괴사는 수용체 상호작용 단백질 키나아제-1(RIPK1) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사 단백질(MLKL)¹⁸을 포함하는 신호 전달 경로에 의존합니다. RIPK1 억제제로서 Nec-1s는 호중구의 괴사를 억제합니다. Hsp70 및 DFO는 리소좀 막 투과화(LMP)를 억제할 수 있으며, 이는 호중구 세포자멸사(hotrophil apoptosis)¹⁹ 및 파이롭토시스(pyroptosis)²⁰를 유도할 수 있다. 활성산소종(ROS)은^LMP19와 세포자멸사를 매개하고 생존 신호(²²)를 억제함으로써 호중구 사멸에 중요한 역할을 한다. ROS 축적을 줄일 수 있는 항산화제인 NAC는 호중구 사멸을 지연시킵니다. 성장 인자로서 G-CSF는 호중구 생존 신호를 활성화하고 칼파인 유도 세포 사멸을 억제합니다^23,24. 여러 호중구 자발적 사망 경로를 동시에 표적으로 삼음으로써 호중구 수명을 기능 저하 없이 5일 이상으로 효과적으로 연장할 수 있습니다. CLON-G 치료는 호중구 보존, 수송 및 유전자 조작의 가능성을 확장하여 호중구 군집에서의 연구를 가속화할 수 있습니다. 한편, 호중구 사멸에 대한 지식에 기초하여, 세포 사멸 분석을 위해 현재 승인된 프로토콜은 호중구(¹⁴)에 예기치 않은 손상을 일으킬 수 있으므로, 이들 프로토콜은 호중구 연구에 더 적합하도록 개선되었다. 이 보고서는 CLON-G를 사용한 호중구 배양과 유세포 분석 및 형광 이미징을 사용한 마우스 호중구의 시험관 내 세포 사멸 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. CLON-G는 마우스와 인간 호중구 모두에 효과적입니다. 그러나 이 프로토콜을 단순화하기 위해 마우스 샘플이 여기에 설명되어 있습니다. NAC의 농도는 마우스 호중구의 경우 1mM이고 인간 호중구의 경우 10μM입니다. Hsp70은 종 특이적이므로 호중구의 공급원에 따라 활용되어야 합니다. 이 프로토콜의 경우 호중구가 말초 혈액 또는 골수에서 분리되는지 여부와 분리 방법은 중요하지 않습니다.

본 연구를 위해, 호중구는 실험을 위한 충분한 호중구를 달성하기 위해 마우스 골수로부터 분리되었는데, 이는 약 1 x 10 7-1.5 x 10⁷ 호중구가 골수로부터 얻어질 수 있는 반면, 단지 1 x 10 6 호중구만이 단일 8-12주령 C57BL/⁶ 마우스(성별 모두)의 말초 혈액으로부터 분리될 수 있기 때문이다. 구배 원심분리는 FACS 분류 또는 MACS 분류의 기계적 자극으로부터 가능한 손상 및 활성화를 피하기 위해 수행되었다.

프로토콜

Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology(SKLEH) 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 절차를 승인하고 모니터링했습니다. 도 1 은 CLON-G를 이용한 호중구 배양 및 시험관 내 사멸 분석의 흐름도를 나타낸 것이다.

1. CLON-G를 이용한 호중구 수명 연장

알림: 언급된 모든 작업 및 재료는 멸균되어야 합니다. 모든 솔루션이 잘 혼합되고 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.

1. CLON-G 구성품 보존
   1. 973.7 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 50 mg의 Q-VD-oph( 재료 표 참조)를 100 mM의 최종 농도로 용해시키고, 혼합물이 투명해질 때까지 액체를 피펫팅한다. 튜브당 50 μL를 분취하고, -20°C에서 보존한다.
      주의 : DMSO는 유해한 약액입니다. 피부 접촉, 눈 접촉 및 흡입을 피하기 위해 실험복, 고글 및 마스크를 착용하십시오.
   2. Hsp70( 재료 표 참조)을 4°C에서 해동하고 바이알의 내용물을 회전시킵니다. 얼음 위의 튜브당 Hsp70 1μL를 분취하고 -80°C에서 보존합니다.
      참고: Hsp70은 단백질입니다. 안정적으로 유지하려면 초저온 보관이 필요합니다. 동결-해동 주기를 피하십시오.
   3. 1mg의 DFO( 재료 표 참조)를 7.61mL RPMI 1640에 용해시켜 튜브당 200μM의 스톡을 얻습니다. 분취량 500μL, -20°C에서 보존합니다.
   4. 0.1 g의 NAC( 재료 표 참조)를 2.5 mL의 RPMI 1640과 함께 15 mL 원심분리기 튜브에 녹이고 NaOH로 pH를 7-7.4로 조정합니다. RPMI 1640을 최종 부피 3.06mL에 추가하여 200mM NAC 스톡을 만듭니다. 0.2μm 필터링 장치로 필터링합니다. 튜브당 분취량 500 μL, -20°C에서 보존.
      참고: 이 고농도에서 NAC를 용해하는 것은 쉽지 않으며 소용돌이가 용해하는 데 도움이 될 수 있습니다. RPMI 1640의 페놀 레드는 pH의 완벽한 표시입니다. NAC가 방금 용해되면 색상이 황색을 띠게 됩니다. 분홍빛이 날 때까지 조정하십시오. NAC 원액은 -20°C에서 최대 1개월 동안 안정적입니다.
   5. 10mg의 Nec-1s( 재료 표 참조)를 1.8mL의 DMSO와 함께 20mM에 용해시키고 투명해질 때까지 혼합물을 피펫팅합니다. 튜브당 50 μL를 분취하고, -20°C에서 보존한다. 빛으로부터 보호하십시오.
   6. 250 μg의 G-CSF( 재료 표 참조)를 1.25 mL의 RPMI 1640과 함께 200 μg/mL로 용해시킵니다. 튜브당 분취액 50 μL를 4°C에서 보존한다.
2. 2x CLON-G 배지의 제조
   1. 기본 매체를 준비하십시오. RPMI 1640 39.5mL, 소 태아 혈청(FBS) 10mL, pen-strep(항생제) 0.5mL를 50mL 튜브에 넣어 20% FBS 및 1% PS를 기본 배지로 사용하여 RPMI 1640을 만듭니다.
      참고: 이 고농도의 FBS는 5일 이상일 수 있는 호중구의 장기간 배양을 제공하는 데 사용됩니다. 배양 시간이 1-2일이면 10%-15% FBS이면 충분합니다.
   2. CLON-G 구성품의 모든 원액을 얼음 위에서 해동합니다.
   3. 염기성 배지 606 μL를 첨가하여 Hsp70 1 μL를 20 μM으로 희석한다. 염기성 배지 9μL를 추가하여 200μg/mL G-CSF 1μL를 20μg/mL로 희석합니다.
   4. 976 μL의 염기성 배지를 15 mL 원심분리기 튜브에 추가합니다. Q-VD-oph (100 mM) 1 μL, DFO (200 μM) 10 μL, Hsp70 (20 μM) 1 μL, NAC (200 mM) 10 μL, Nec-1s (20 mM) 1 μL, G-CSF (20 μg/mL) 1 μL를 넣어 1 mL의 2x CLON-G 배지를 만든다.
      알림: 2x CLON-G 배지는 준비된 직후에 사용해야 합니다. 2x CLON-G를 4°C에서 임시로 보관할 수 있다. 남은 20μM Hsp70은 폐기해야 합니다.
3. 호중구 배양
   1. 이전 보고서²⁵에 따른 구배 원심분리에 의해 마우스 호중구를 분리합니다. 분리된 마우스 호중구를 염기성 배지(100만 세포/100μL)에 재현탁합니다.
      알림: 호중구를 부드럽게 다루어 활성화하지 마십시오. 전체 과정에서 거품이 생기지 않도록 하십시오.
   2. 2x CLON-G 배지 500μL, 염기성 배지 400μL, 세포 현탁액 100μL를 24웰 비조직 배양 배양 플레이트(표 표 참조)에 넣고 3-4회 부드럽게 피펫팅합니다.
      참고: 2x CLON-G 배지의 성분 농도가 높으면 호중구가 손상될 수 있습니다. 기본 매체 없이 함께 추가하지 마십시오. 비조직 배양 배양 플레이트는 호중구 부착을 피하기 위해 필요하다.
   3. 배양 접시를 37°C 및 5%_CO2 배양기에 넣고 원활하게 한다.
      참고: 7일 이내에 세포 배지를 교환할 필요가 없습니다. CLON-G 조성물의 최종 농도는 50μM Q-VD-Oph, 1μM DFO, 10pM Hsp70, 1mM NAC, 10μM Nec-1s 및 10ng/mL G-CSF입니다.
   4. 배양된 호중구를 라이트김사 화합물로 염색하고(표 재료 표 참조), 광학 현미경으로 분석한다(도 2A-D). 대안적으로, APC-CD11b 및 PE-Cy7-Ly6G 항체로 염색하고, 앞서 설명한 바와 같이 유세포 분석기 (도 2E-I)로 분석한다⁽도 26).

2. 호중구의 시험관 내 자발적 사망 분석

1. 유세포 분석
   1. 분리된 호중구를 37°C 및 5%_CO2의 염기성 배지에서 100만 cells/mL의 밀도로 배양했습니다. 24-웰 배양 플레이트는 비-조직 배양된다. 웰 당 1 mL의 세포 배지를 첨가한다.
   2. 1 g의 CaCl2를 45 mL의 식염수와 함께 녹여 200 mM_CaCl2를 만든다. 0.2μm 필터링 장치로 필터링합니다. 4 °C에서 보존.
   3. 염색 혼합물을 준비합니다. 1.5mL 튜브에 시료당 7μL의 식염수를 추가하고 시료당 각각 1μL씩 0.4mg/mL FITC-Annexin-V, 0.5mg/mL 요오드화 프로피듐(PI) 및 200mM_CaCl2 용액을 각각 1μL씩 추가합니다. 잘 섞다. 준비 직후에 용액을 사용하십시오.
   4. 세포 배지를 5 내지 7회 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞은 다음, 원하는 시점에 100 μL를 유세포 분석 튜브에 옮겼다.
      알림: 전체 과정에서 거품이 생기지 않도록 하십시오.
   5. 소용돌이 계산 구슬 ( 재료 표 참조)을 잘 혼합합니다. 잘 혼합된 계수 비드 10 μL를 단계 2.1.4에서와 동일한 유세포 분석 튜브에 피펫팅한다.
   6. 제조된 염색 혼합물(단계 2.1.3)을 유세포 분석 튜브에 10 μL를 첨가한다. 빛을 피해 실온에서 5분간 배양한다.
   7. 100 μL의 식염수를 튜브에 넣고 잘 섞어 계수 비드와 세포의 균일한 분포를 보장합니다.
   8. 세포 배지의 유세포 분석을 수행합니다. ~400 events/s로 낮은 속도로 세포를 수집합니다. APC-PE-Cy7-세포를 FSC-A 및 SSC-A로 게이트하고, 배지 FSC-A 및 SSC-A 위치를 갖는 온전한 세포를 FITC-Annexin-V 및 PE-PI로 게이트하고; Annexin-V⁻PI⁻ 집단은 건강한 세포로 분류됩니다.
      참고: 다음 방정식은 샘플당 건강한 세포의 총 수와 호중구의 생존력을 결정합니다.
      시료당 건강한 세포의 총 수²⁷ = (1,000/계수 비드 수) × Annexin-V⁻PI⁻ 모집단 수 × 10
      호중구의 생존력 = 표시된 시간의 총 건강한 세포 수/시간 0의 총 건강한 세포 수
2. 형광 이미지 분석
   1. 분리된 호중구를 37°C의 염기성 배지에서 100만 cells/mL의 밀도로 배양하고 플레이트당 2mL의 세포 배지를 갖는 공초점 플레이트에서 5%_CO2 로 배양했습니다.
      참고: 컨포칼 형광 현미경은 최상의 이미지 품질을 제공하지만 488/561/DIC 채널이 있는 형광 현미경은 이 실험을 지원하기에 충분합니다.
   2. 표시된 시점에 접시를 부드럽게 꺼냅니다. 0.4mg/mL FITC-Annexin-V, 0.5mg/mL PI 및 200mM_CaCl2 를 각각 10μL씩 플레이트에 골고루 추가합니다. 실온에서 5분간 얼룩지게 한다.
      알림: 전체 과정에서 흔들리지 마십시오. 염색제를 고르고 부드럽게 첨가하십시오.
   3. 20x 대물 렌즈가 장착된 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 488(Annexin-V)/561(PI)/DIC 채널에서 형광 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조). 488 채널의 노출 시간을 500ms로, 561 채널을 200ms로, DIC 채널을 100ms로 설정합니다. 각 플레이트에 대해 5-10개의 무작위 영역을 선택합니다. 세포 유형은 이전에 발표된 보고서¹⁴에 정의되어 있습니다.

결과

CLON-G 처리된 호중구의 Wright-Giemsa-염색 형태(도 2A-D) 및 FACS 표현형(도 2E-J)은 영향을 받지 않았습니다. 24시간에서 CLON-G 처리된 호중구의 생존율은 유세포 분석 분석(그림 3) 및 형광 이미지 분석(그림 4)을 기반으로 약 90%+였습니다. 낮은 생존율은 부적절한 보...

토론

호중구는 선천성 면역과 후천성 면역에 중요한 역할을 하며, 호중구의 항상성은 엄격하게 조절됩니다. 호중구는 인간의 말초 혈액에서 가장 풍부한 백혈구이며 강력하고 빠른 회전율을 가지고 있습니다. 건강한 성인은 매일 1 x 10⁹ 호중구/kg을 골수에서 배출할 수 있다²⁸. 따라서 호중구의 죽음은 이 분야의 수수께끼 같은 수수께끼 중 하나가 되었으며, 호중구를 더 잘 이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.