Увеличение продолжительности жизни нейтрофилов с помощью CLON-G и анализа спонтанной смерти in vitro

Резюме

Этот протокол подробно описывает подготовку CLON-G для продления продолжительности жизни нейтрофилов до более чем 5 дней и обеспечивает надежную процедуру оценки гибели нейтрофилов с помощью проточной цитометрии и конфокальной флуоресцентной микроскопии.

Аннотация

Средняя продолжительность жизни нейтрофила составляет менее 24 ч, что ограничивает фундаментальные исследования нейтрофилов и применение нейтрофильных исследований. Наши предыдущие исследования показали, что несколько путей могут опосредовать спонтанную гибель нейтрофилов. Коктейль был разработан путем одновременного нацеливания на эти пути, каспазы-лизосомальная мембрана, пермеабилизация-оксидант-некроптоз плюс гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (CLON-G), который продлевал продолжительность жизни нейтрофилов до более чем 5 дней без значительного ущерба для функции нейтрофилов. Одновременно был разработан надежный и стабильный протокол оценки и оценки гибели нейтрофилов. В этой работе мы показываем, что CLON-G может продлевать продолжительность жизни нейтрофилов in vitro до более чем 5 дней, и мы демонстрируем удлинение продолжительности жизни нейтрофилов с помощью FACS и конфокальной флуоресцентной микроскопии. В этом отчете представлены процедуры получения CLON-G и продемонстрирован анализ спонтанной смерти нейтрофилов in vitro , который может быть использован для изучения нейтрофилов и для последующего опроса гибели нейтрофилов, тем самым обеспечивая надежный ресурс для сообщества нейтрофилов.

Введение

Известно, что нейтрофилы включают в себя арсенал обильных цитоплазматических гранул, никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) оксидазы, антимикробных ферментов и различных органелл, которые защищают от вторжения микробов; Кроме того, они очень подвижны и являются первыми клетками, привлеченными к месту воспаления, а это означает, что нейтрофилы являются первой линией защиты врожденной иммунной системы ^1,2. Таким образом, гранулоцитарная трансфузионная терапия стала перспективным клиническим методом лечения инфекций, связанных с нейтропенией, для временного повышения иммунитета нейтрофилов ^3,4,5. Недавние открытия ясно показали, что нейтрофилы также функционируют как многогранные эффекторы во многих физиопатологических сценариях⁶. Средняя продолжительность жизни нейтрофила составляет менее 24 часов, и, таким образом, фундаментальные исследования нейтрофилов и применение нейтрофильных исследований чрезвычайно затруднены из-за ограничений, связанных со стабильными генетическими манипуляциями и длительным хранением 7,8,9,10,11 . Есть некоторые клеточные линии, которые могут частично демонстрировать некоторые функции нейтрофилов, такие как HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки¹². Эти клеточные линии могут обеспечить эффективное редактирование генов и криоконсервацию; Тем не менее, они по-прежнему сильно отличаются от первичных нейтрофилов и, таким образом, не могут точно повторять функции нейтрофилов¹³. Таким образом, большая часть исследований в этой области по-прежнему опирается на свежевыделенные первичные нейтрофилы. Эта область по-прежнему полагается на создание дорогостоящих и трудоемких условных нокаутированных мышей для исследования специфических функций генов у нейтрофилов, но в настоящее время не существует человеческих моделей.

Приложив усилия к изучению гетерогенных процессов, связанных с гибелью нейтрофилов, и множественных путей, которые регулируют эти процессы 14,15, недавно сообщалось о новом лечении^, получившем название CLON-G (пермеабилизация каспаз-лизосомальной мембраны-ингибирование окислителя-некроптоза плюс гранулоцитарный колониестимулирующий фактор)¹⁶. CLON-G состоит из Q-VD-oph (хинолил-валил-O-метиласпартил-[-2,6-дифторфенокси]-метилкетона), Hsp70 (белок теплового шока 70), DFO (дефероксамин), NAC (N-ацетилцистеин), Nec-1s (некростатин-1) и G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). Спонтанная гибель нейтрофилов опосредована несколькими путями, включая апоптоз, некроптоз и пироптоз. Q-VD-oph ингибирует апоптоз нейтрофилов в качестве ингибитора панкаспазы, нацеливаясь на каспазу 1, каспазу 3, каспазу 8 и каспазу 9¹⁷. Нейтрофильный некроптоз зависит от сигнального пути, включающего взаимодействующую с рецептором протеинкиназу-1 (RIPK1) и доменоподобный белок киназы смешанной линии (MLKL)¹⁸. В качестве ингибитора RIPK1 Nec-1s ингибируют некроптоз нейтрофилов. Hsp70 и DFO могут ингибировать пермеабилизацию лизосомальной мембраны (LMP), которая может индуцировать апоптоз^{нейтрофилов 19} и пироптоз²⁰. Активные формы кислорода (АФК) играют жизненно важную роль в гибели нейтрофилов, опосредуя LMP¹⁹ и апоптоз²¹ и ингибируя сигналы^{выживания 22}. Как антиоксидант, который может уменьшить накопление АФК, NAC задерживает гибель нейтрофилов. В качестве фактора роста G-CSF активирует сигналы выживания нейтрофилов и ингибирует индуцированный кальпаином апоптоз^23,24. Одновременно нацеливаясь на несколько путей спонтанной гибели нейтрофилов, продолжительность жизни нейтрофилов может быть эффективно увеличена до более чем 5 дней без ущерба для их функции. Лечение CLON-G расширяет возможности сохранения, транспортировки и манипулирования генами нейтрофилов, что может ускорить исследования в сообществе нейтрофилов. Между тем, основываясь на знаниях о гибели нейтрофилов, утвержденные в настоящее время протоколы анализов клеточной смерти могут вызвать неожиданное повреждение нейтрофилов¹⁴, поэтому эти протоколы были усовершенствованы, чтобы быть более подходящими для исследований нейтрофилов. В этом отчете представлены подробные протоколы культивирования нейтрофилов с помощью CLON-G и анализа in vitro на гибель клеток нейтрофилов мыши с использованием проточной цитометрии и флуоресцентной визуализации. CLON-G эффективен как на мышиных, так и на человеческих нейтрофилах; Тем не менее, образцы мышей демонстрируются здесь, чтобы упростить этот протокол. Концентрация NAC составляет 1 мМ для нейтрофилов мыши и 10 мкМ для нейтрофилов человека. Hsp70 является видоспецифичным и, таким образом, должен использоваться в соответствии с источником нейтрофила. Для этого протокола не имеет значения, выделены ли нейтрофилы из периферической крови или костного мозга и как они выделены.

Для настоящего исследования нейтрофилы были выделены из костного мозга мыши, чтобы получить достаточное количество нейтрофилов для экспериментов, так как из костного мозга можно получить около 1 x 10 7-1,5 x 10⁷ нейтрофилов, в то время как только 1 x 10 6 нейтрофилов может быть выделен из периферической крови одной 8-12-недельной мыши C57BL /⁶ (любого пола). Градиентное центрифугирование проводили, чтобы избежать возможных повреждений и активации от механического воздействия сортировки FACS или сортировки MACS.

протокол

Бостонская детская больница и Государственная ключевая лаборатория экспериментальной гематологии (SKLEH) Комитет по уходу за животными и их использованию одобрили и контролировали все процедуры. На рисунке 1 показана блок-схема культивирования нейтрофилов с помощью CLON-G и анализа смерти in vitro .

1. Продление продолжительности жизни нейтрофилов с помощью CLON-G

ПРИМЕЧАНИЕ: Все упомянутые операции и материалы должны быть стерильными. Убедитесь, что все растворы хорошо перемешаны и равномерно распределены.

1. Сохранение компонентов CLON-G
   1. Растворите 50 мг Q-VD-oph (см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 100 мМ, добавив 973,7 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), и запитывайте жидкость пипеткой до тех пор, пока смесь не станет прозрачной. Аликвот 50 мкл на тюбик и хранить при -20 °C.
      ВНИМАНИЕ: ДМСО является вредной химической жидкостью. Наденьте лабораторный халат, защитные очки и маску, чтобы избежать контакта с кожей, попадания в глаза и вдыхания.
   2. Разморозьте Hsp70 (см. Таблицу материалов) при температуре 4 °C и открутите содержимое флакона. Аликвотируйте 1 мкл Hsp70 на тюбик на льду и сохраняйте при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Hsp70 - это белок; Ультрахолодное хранение необходимо для поддержания его стабильности. Избегайте цикла замораживания-оттаивания.
   3. Растворите 1 мг DFO (см. Таблицу материалов) 7,61 мл RPMI 1640 до получения запаса 200 мкМ. Aliquot 500 мкл на пробирку и храните при -20 ° C.
   4. Растворите 0,1 г NAC (см. Таблицу материалов) с 2,5 мл RPMI 1640 в центрифужной пробирке объемом 15 мл и отрегулируйте рН до 7-7,4 с помощью NaOH. Добавьте RPMI 1640 к конечному объему 3,06 мл, чтобы получить запас NAC 200 мМ. Отфильтруйте его с помощью фильтрующего блока 0,2 мкм. Аликвота 500 мкл на тюбик и консервация при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворить NAC в такой высокой концентрации непросто, и вихрь может помочь растворить его. Феноловый красный в RPMI 1640 является идеальным показателем pH; когда NAC только что растворен, цвет желтоватый; Отрегулируйте его, пока он не станет розоватым. Исходные растворы NAC стабильны до 1 месяца при −20 °C.
   5. Растворите 10 мг Nec-1s (см. Таблицу материалов) до 20 мМ с 1,8 мл ДМСО и нанесите смесь пипеткой до тех пор, пока она не станет прозрачной. Аликвот 50 мкл на тюбик и хранить при -20 °C. Беречь от света.
   6. Растворите 250 мкг G-CSF (см. Таблицу материалов) до 200 мкг / мл с 1,25 мл RPMI 1640. Аликвот 50 мкл на тюбик и хранить при 4 °C.
2. Приготовление 2х питательной среды CLON-G
   1. Подготовьте основное средство. Добавьте 39,5 мл RPMI 1640, 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,5 мл ручки-стрептококка (антибиотики) в пробирку объемом 50 мл, чтобы получить RPMI 1640 с 20% FBS и 1% PS в качестве основной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта высокая концентрация FBS используется для обеспечения длительного культивирования нейтрофилов, которое может превышать 5 дней. Если время культивирования составляет 1-2 дня, достаточно 10%-15% FBS.
   2. Разморозьте на льду все стоковые растворы компонентов CLON-G.
   3. Разбавьте 1 мкл Hsp70 до 20 мкМ, добавив 606 мкл основной среды. Разбавьте 1 мкл 200 мкг/мл G-CSF до 20 мкг/мл, добавив 9 мкл основной среды.
   4. Добавьте 976 мкл основной среды в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 1 мкл Q-VD-oph (100 мМ), 10 мкл DFO (200 мкМ), 1 мкл Hsp70 (20 мкМ), 10 мкл NAC (200 мМ), 1 мкл Nec-1s (20 мМ) и 1 мкл G-CSF (20 мкг / мл), чтобы получить 1 мл среды 2x CLON-G.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среду 2x CLON-G следует использовать сразу после ее приготовления. Можно временно хранить 2x CLON-G при температуре 4 °C. Оставшиеся 20 мкМ Hsp70 необходимо выбросить.
3. Посев нейтрофилов
   1. Изолировать нейтрофилы мыши путем градиентного центрифугирования в соответствии с предыдущим докладом²⁵. Ресуспендируют изолированные нейтрофилы мыши в основной среде (1 млн клеток/100 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте активации нейтрофилов, осторожно обращаясь с ними. Избегайте вспенивания в течение всего процесса.
   2. Добавьте 500 мкл 2x среды CLON-G, 400 мкл основной среды и 100 мкл клеточной суспензии в 24-луночные нетканевые культивируемые культуральные планшеты (см. Таблицу материалов) и осторожно пипеткой три-четыре раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие концентрации компонентов в среде 2x CLON-G могут повредить нейтрофилы; Избегайте сложения их вместе без основного носителя. Нетканевая культивируемая культуральная пластина необходима, чтобы избежать адгезии нейтрофилов.
   3. Поместите культуральную тарелку в инкубатор с температурой 37 °C и 5% CO₂ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости менять клеточную среду в течение 7 дней. Конечные концентрации композиции CLON-G составляют 50 мкМ Q-Vd-Oph, 1 мкМ DFO, 10 пМ Hsp70, 1 мМ NAC, 10 мкМ Nec-1 s и 10 нг/мл G-CSF.
   4. Окрашивают культивируемые нейтрофилы составным красителем Райта Гимзы (см. Таблицу материалов) и анализируют с помощью светового микроскопа (рис. 2A-D). В качестве альтернативы окрашивают антителами APC-CD11b и PE-Cy7-Ly6G и анализируют с помощью проточной цитометрии (рис. 2E-I), как описано ранее 26.

2. Анализ спонтанной смерти нейтрофилов in vitro

1. Анализ проточной цитометрии
   1. Культуру выделяют нейтрофилы плотностью 1 млн клеток/мл в основной среде при 37 °С и 5%_СО2. Культуральная пластина с 24 лунками культивируется не в тканях. Добавьте 1 мл клеточной среды на лунку.
   2. Растворите 1 г CaCl₂ 45 мл физиологического раствора, чтобы получить 200 мМ CaCl2_. Отфильтруйте его с помощью фильтрующего блока 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C.
   3. Приготовьте красящую смесь. Добавьте 7 мкл физиологического раствора на образец в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 0,4 мг/мл FITC-Annexin-V, 0,5 мг/мл йодида пропидия (PI) и 200 мМ раствора CaCl₂ по 1 мкл на образец. Хорошо перемешайте. Используйте раствор сразу после приготовления.
   4. Аккуратно пипеткой аккуратно перемешайте клеточную среду пять-семь раз, чтобы хорошо перемешать, а затем переведите 100 мкл в проточную цитометрическую пробирку в желаемые моменты времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вспенивания в течение всего процесса.
   5. Вихревыми счетными бусинами (см. Таблицу материалов), чтобы хорошо их перемешать. Пипетка 10 мкл хорошо перемешанных счетных шариков в ту же проточную цитометрическую пробирку, что и на шаге 2.1.4.
   6. Добавьте 10 мкл подготовленной красящей смеси (этап 2.1.3) в проточную цитометрическую пробирку. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут вдали от света.
   7. Добавьте 100 мкл физиологического раствора в пробирку и хорошо перемешайте, чтобы обеспечить равномерное распределение счетных шариков и клеток.
   8. Выполняют проточный цитометрический анализ клеточной среды. Собирайте ячейки с низкой скоростью ~ 400 событий в секунду. Вентиль APC-PE-Cy7-клеток в FSC-A и SSC-A, а интактные ячейки со средними положениями FSC-A и SSC-A в FITC-Annexin-V и PE-PI; популяция аннексина-V-PI⁻ классифицируется как здоровые клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие уравнения определяют общее количество здоровых клеток в образце и жизнеспособность нейтрофилов:
      Общее количество здоровых клеток в образце²⁷ = (1,000 / количество счетных шариков) × количество популяции Annexin-V-PI^{− ×} 10
      Жизнеспособность нейтрофилов = общее количество здоровых клеток в указанное время / общее количество здоровых клеток в нулевое время
2. Анализ флуоресцентных изображений
   1. Культуру выделяли нейтрофилы плотностью 1 млн клеток/мл в основной среде при 37 °С и 5%_СО2 в конфокальной пластинке с 2 мл клеточной среды на пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальный флуоресцентный микроскоп имеет наилучшее качество изображения, но для проведения этого эксперимента достаточно любого флуоресцентного микроскопа с 488/561/DIC-каналами.
   2. Осторожно выньте тарелку в указанный момент времени. Равномерно добавьте в планшет по 10 мкл по 0,4 мг/мл FITC-Annexin-V, 0,5 мг/мл PI и 200 мМ_CaCl2 . Окрашивать при комнатной температуре в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте встряхивания в течение всего процесса. Равномерно и аккуратно добавляйте красители.
   3. Получение флуоресцентных изображений в каналах 488 (annexin-V)/561 (PI)/DIC с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа с 20-кратным объективом (см. Таблицу материалов). Установите время экспозиции канала 488 как 500 мс, канала 561 как 200 мс и канала DIC как 100 мс. Выберите 5-10 случайных областей для каждой тарелки. Типы клеток определены в нашем ранее опубликованном отчете¹⁴.

Результаты

Морфология нейтрофилов, окрашенных по Райту-Гимзе (рис. 2A-D) и фенотипы FACS (рис. 2E-J) нейтрофилов, обработанных CLON-G, не были затронуты. Жизнеспособность нейтрофилов, обработанных CLON-G, через 24 часа составила около 90%+ на осн...

Обсуждение

Нейтрофилы играют жизненно важную роль во врожденном и адаптивном иммунитете, и их гомеостаз жестко регулируется. Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитами в периферической крови человека, и они имеют прочный и быстрый оборот. Здоровый взрослый человек может выделя?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.