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要約

このプロトコルは、好中球の寿命を5日以上に延長するためのCLON-Gの調製を詳述し、フローサイトメトリーと共焦点蛍光顕微鏡で好中球死を評価するための信頼できる手順を提供します。

要約

好中球の平均寿命は24時間未満であり、好中球に関する基礎研究と好中球研究の適用が制限されています。私たちの以前の研究は、複数の経路が好中球の自然死を媒介する可能性があることを示しました。カスパーゼ-リソソーム膜透過-酸化-ネクロトーシス阻害と顆粒球コロニー刺激因子(CLON-G)を同時に標的としたカクテルを開発し、好中球機能を大幅に損なうことなく好中球の寿命を5日以上に延長しました。同時に、好中球死を評価および評価するための信頼性が高く安定したプロトコルも開発されました。本研究では、CLON-Gが in vitro で好中球の寿命を5日以上に延ばすことができることを示し、FACSと共焦点蛍光顕微鏡法を用いて好中球の寿命を延ばすことを示しました。このレポートでは、CLON-Gの調製手順を紹介し、好中球の研究とその後の好中球死の調査に使用できる好中球の in vitro 自然死アッセイを紹介し、好中球コミュニティに信頼できるリソースを提供します。

概要

好中球は、豊富な細胞質顆粒、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)オキシダーゼ、抗菌酵素、および侵入微生物から保護するさまざまな細胞小器官の兵器庫を含むことが知られています。さらに、それらは非常に運動性が高く、炎症部位に動員される最初の細胞であり、好中球が自然免疫系の防御の第一線であることを意味します1,2。したがって、顆粒球輸血療法は、好中球免疫を一過性に高める好中球減少症関連感染症の有望な臨床治療法となっています3,4,5。最近の発見は、好中球が多くの生理病理学的シナリオにおいて多面的なエフェクターとしても機能することを明確に示しています6。好中球の平均寿命は24時間未満であり、したがって、好中球の基礎研究と好中球研究の適用は、安定した遺伝子操作と長期保存に関連する制限のために非常に困難です7,8,9,10,11 .HL-60、PLB-985、NB4、かすみ-1、人工多能性幹細胞など、好中球機能を部分的に示すことができる細胞株がいくつかあります12。これらの細胞株は、効果的な遺伝子編集と凍結保存を達成することができます。しかし、それらは依然として一次好中球とはかなり大きく異なるため、好中球機能を忠実に再現することはできません13。したがって、この分野の研究のほとんどは、依然として新たに単離された一次好中球に依存しています。この分野は、好中球の特定の遺伝子機能を調査するために、高価で時間のかかる条件付きノックアウトマウスの生成に依存していますが、現在、ヒトモデルは存在しません。

好中球死に関与する不均一なプロセスと、これらのプロセスを調節する複数の経路の探索に力を入れた結果14,15、CLON-G(カスパーゼ-リソソーム膜透過処理-酸化-ネクロトーシス阻害と顆粒球コロニー刺激因子)と呼ばれる新しい治療法が最近報告されました16。.CLON-Gは、Q-VD-oph(キノリル-バリル-O-メチルアスパルチル-[-2,6-ジフルオロフェノキシ]-メチルケトン)、Hsp70(ヒートショックタンパク質70)、DFO(デフェロキサミン)、NAC(N-アセチルシステイン)、Nec-1(ネクロスタチン-1)、およびG-CSF(顆粒球コロニー刺激因子)で構成されています。好中球の自然死は、アポトーシス、ネクロプトーシス、パイロトーシスなどの複数の経路によって媒介されます。Q-VD-ophは、カスパーゼ1、カスパーゼ3、カスパーゼ8、およびカスパーゼ9を標的とすることにより、汎カスパーゼ阻害剤としての好中球のアポトーシスを阻害します17。好中球ネクロトーシスは、受容体相互作用タンパク質キナーゼ-1(RIPK1)と混合系統キナーゼドメイン様タンパク質(MLKL)18が関与するシグナル伝達経路に依存しています。RIPK1阻害剤として、Nec-1は好中球のネクロトーシスを阻害します。Hsp70とDFOはリソソーム膜透過処理(LMP)を阻害し、好中球のアポトーシス19とパイロトーシス20を誘導する可能性があります。活性酸素種(ROS)は、LMP19とアポトーシス21を媒介し、生存シグナル22を阻害することにより、好中球の死に重要な役割を果たします。ROSの蓄積を減らすことができる抗酸化物質として、NACは好中球の死を遅らせます。成長因子として、G-CSFは好中球生存シグナルを活性化し、カルパイン誘発アポトーシスを阻害します23,24。複数の好中球の自然死経路を同時に標的とすることにより、好中球の寿命は、その機能を損なうことなく、効果的に5日以上に延長することができます。CLON-G治療は、好中球の保存、輸送、遺伝子操作の可能性を広げ、好中球コミュニティでの研究を加速することができます。一方、好中球死の知識に基づいて、現在承認されている細胞死アッセイのプロトコルは好中球に予期しない損傷を引き起こす可能性があるため14、これらのプロトコルは好中球研究により適したものに改良されています。このレポートは、CLON-Gによる好中球培養の詳細なプロトコルと、フローサイトメトリーと蛍光イメージングを使用したマウス好中球のin vitro細胞死アッセイを提供します。CLON-Gは、マウスとヒトの両方の好中球に有効です。ただし、ここでは、このプロトコルを簡略化するためにマウスのサンプルを示します。NACの濃度は、マウス好中球で1 mM、ヒト好中球で10 μMです。Hsp70は種特異的であるため、好中球の供給源に応じて利用する必要があります。このプロトコルでは、好中球が末梢血または骨髄から単離されているかどうか、およびそれらがどのように単離されるかは関係ありません。

本研究では、骨髄から約1 x 10 7-1.5 x10 7好中球を得ることができるため、マウス骨髄から好中球を単離し、1 x 10 6好中球のみを末梢血から単離することができます8-12週齢のC57BL /6マウス(性別のいずれか)。勾配遠心分離は、FACS選別またはMACS選別の機械的刺激による損傷および活性化の可能性を回避するために実施された。

プロトコル

ボストン小児病院および州立実験血液学重点研究所(SKLEH)動物管理および使用委員会は、すべての手順を承認および監視しました。 図1 は、CLON-Gによる好中球培養および インビトロ 死アッセイのフローチャートを示す。

1. CLON-Gによる好中球寿命延長

注意: 記載されているすべての操作と材料は無菌でなければなりません。すべてのソリューションが適切に混合され、均等に分散されていることを確認してください。

  1. CLON-Gコンポーネントの保存
    1. 973.7 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えて、50 mgのQ-VD-oph( 材料の表を参照)を最終濃度100 mMに溶解し、混合物が透明になるまで液体をピペットで送ります。チューブあたり50 μLを分注し、-20°Cで保存します。
      注意: DMSOは有害な化学液体です。白衣、ゴーグル、マスクを着用して、皮膚への接触、アイコンタクト、吸入を避けてください。
    2. Hsp70( 材料の表を参照)を4°Cで解凍し、バイアル内の内容物をスピンダウンします。氷上でチューブあたり1 μLのHsp70を分注し、-80°Cで保存します。
      注:Hsp70はタンパク質です。安定を保つには超低温保存が必要です。凍結融解サイクルを避けてください。
    3. 1 mgのDFO( 材料の表を参照)を7.61 mL RPMI 1640に溶解し、200 μMのストックを得ます。 チューブあたり500 μLを分注し、-20°Cで保存します。
    4. 0.1 gのNAC( 材料の表を参照)を2.5 mLのRPMI 1640と15 mLの遠沈管に溶解し、NaOHでpHを7〜7.4に調整します。RPMI 1640を最終容量3.06 mLに加え、200 mM NACストックを作成します。0.2μmのろ過ユニットでろ過します。チューブあたり500 μLを分注し、-20°Cで保存します。
      注:この高濃度でNACを溶解することは容易ではなく、ボルテックスはそれを溶解するのに役立ちます。RPMI 1640のフェノールレッドはpHの完全な指標です。NACが溶解したばかりの場合、色は黄色がかっています。ピンクがかった色になるまで調整してください。NACストック溶液は、-20°Cで最大1ヶ月間安定です。
    5. 10 mgのNec-1( 材料の表を参照)を1.8 mLのDMSOで20 mMに溶解し、透明になるまでピペットで固めます。チューブあたり50 μLを分注し、-20°Cで保存します。 光から保護してください。
    6. 250 μgのG-CSF( 材料の表を参照)を1.25 mLのRPMI 1640で200 μg / mLに溶解します。チューブあたり50 μLを分注し、4°Cで保存します。
  2. 2x CLON-G培地の調製
    1. 基本メディアを準備します。39.5 mLのRPMI 1640、10 mLのウシ胎児血清(FBS)、および0.5 mLのペンストレプ(抗生物質)を50 mLチューブに加え、20%FBSおよび1%PSを基本培地とするRPMI 1640を作成します。
      注:この高濃度のFBSは、好中球の長期培養を提供するために使用され、5日を超える場合があります。培養時間が1〜2日であれば、10%〜15%FBSで十分です。
    2. CLON-G成分のすべてのストック溶液を氷上で解凍します。
    3. 606 μLの基本培地を加えて、1 μLのHsp70を20 μMに希釈します。9 μLの基本培地を加えて、1 μLの200 μg/mL G-CSFを20 μg/mLに希釈します。
    4. 976 μLの塩基性培地を15 mLの遠沈管に加えます。1 μLのQ-VD-oph(100 mM)、10 μLのDFO(200 μM)、1 μLのHsp70(20 μM)、10 μLのNAC(200 mM)、1 μLのNec-1s(20 mM)、および1 μLのG-CSF(20 μg/mL)を加えて、1 mLの2x CLON-G培地を作製する。
      注:2x CLON-G培地は、調製後すぐに使用してください。2x CLON-Gを一時的に4°Cで保管することができます。 残った20μM Hsp70は廃棄する必要があります。
  3. 好中球培養
    1. マウス好中球を勾配遠心分離により単離し、前回の報告25に続く。単離したマウス好中球を基本培地(100万細胞/100 μL)に再懸濁します。
      注意: 好中球を穏やかに取り扱うことにより、好中球を活性化することは避けてください。プロセス全体を通して発泡を避けてください。
    2. 24ウェル非組織培養プレート( 材料の表を参照)に500 μLの2x CLON-G培地、400 μLの基本培地、および100 μLの細胞懸濁液を加え、穏やかに3〜4回ピペットで留めます。
      注:2x CLON-G培地中の高濃度の成分は、好中球を損傷する可能性があります。基本メディアなしでそれらを一緒に追加することは避けてください。非組織培養培養プレートは好中球の接着を避けるために必要である。
    3. 培養プレートを37°C、5%CO2 インキュベーターにスムーズに入れます。
      注:7日以内に細胞培地を交換する必要はありません。CLON-G組成物の最終濃度は、50 μM Q-VD-Oph、1 μM DFO、10 pM Hsp70、1 mM NAC、10 μM Nec-1 s、および10 ng/L G-CSFです。
    4. 培養した好中球をライトギムザ化合物染色剤(材料表参照)で染色し、光学顕微鏡で分析します(図2A-D)。あるいは、APC−CD11bおよびPE−Cy7−Ly6G抗体で染色し、前述のようにフローサイトメトリー(図2E−I)で分析する26。

2. 好中球の in vitro 自然死アッセイ

  1. フローサイトメトリー解析
    1. 単離した好中球を基本培地中で100万細胞/mLの密度で37°C、5%CO2で培養します。24穴培養プレートは非組織培養である。ウェルあたり1 mLの細胞培地を追加します。
    2. 1 gのCaCl2 を45 mLの生理食塩水に溶解し、200 mM CaCl2を作ります。0.2μmのろ過ユニットでろ過します。4°Cで保存してください。
    3. 染色ミックスを準備します。サンプルあたり7 μLの生理食塩水を1.5 mLチューブに加え、0.4 mg/mLのFITC-アネキシン-V、0.5 mg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)、および200 mM CaCl2 溶液をサンプルあたりそれぞれ1 μL加えます。よく混ぜる。調製後すぐに溶液を使用してください。
    4. 細胞培地を5〜7回穏やかにピペットでよく混合した後、目的の時点で100 μLをフローサイトメトリーチューブに移します。
      注意: プロセス全体を通して発泡を避けてください。
    5. 渦カウントビーズ( 材料表を参照)をよく混ぜます。よく混合した計数ビーズ10 μLをステップ2.1.4と同じフローサイトメトリーチューブにピペットで入れます。
    6. 調製した染色ミックス(ステップ2.1.3)をフローサイトメトリーチューブに10 μL加えます。光を避けて室温で5分間インキュベートします。
    7. 100 μLの生理食塩水をチューブに加え、よく混合して、カウントビーズとセルが均一に分布するようにします。
    8. 細胞培地のフローサイトメトリー解析を実行します。~400イベント/秒の低速で細胞を収集します。APC-PE-Cy7-細胞をFSC-AおよびSSC-Aにゲートし、培地FSC-AおよびSSC-A位置を有するインタクト細胞をFITCアネキシンVおよびPE-PIにゲートします。アネキシン-V-PI-集団は健康な細胞として分類されます。
      注:次の式は、サンプルあたりの健康な細胞の総数と好中球の生存率を決定します。
      サンプルあたりの健常細胞総数27 = (1,000/カウントビーズ数) × アネキシン-V-PI−集団数 × 10
      好中球の生存率=指示された時間における健康な細胞の総数/時間ゼロにおける健康な細胞の総数
  2. 蛍光画像アッセイ
    1. 単離した好中球を、37°Cの基本培地で100万細胞/mLの密度で、共焦点プレートで5%CO2 をプレートあたり2 mLの細胞培地で培養します。
      注:共焦点蛍光顕微鏡は最高の画質を持っていますが、この実験をサポートするには488/561 / DICチャンネルを備えた蛍光顕微鏡で十分です。
    2. 指定された時点でプレートをそっと取り出します。0.4 mg/mL FITCアネキシン-V、0.5 mg/mL PI、および200 mM CaCl2 をそれぞれ10 μLずつプレートに均等に加えます。室温で5分間染色します。
      注意: プロセス全体を通して揺れを避けてください。染色剤を均一かつ穏やかに追加します。
    3. 20倍の対物レンズを備えた共焦点蛍光顕微鏡を使用して、488(annexin-V)/561(PI)/DICチャネルで蛍光画像をキャプチャします( 材料表を参照)。488チャンネルの露光時間を500ms、561チャンネルの露出時間を200ms、DICチャンネルの露出時間を100msに設定します。プレートごとに5〜10個のランダムな領域を選択します。細胞の種類は、以前に公開されたレポート14で定義されています。

結果

CLON-G処理好中球のライト-ギムザ染色形態(図2A-D)およびFACS表現型(図2E-J)は影響を受けなかった。24時間でのCLON-G処理好中球の生存率は、フローサイトメトリー分析(図3)および蛍光画像アッセイ(図4)に基づいて約90%+でした。生存率の低下は、不適切な保管...

ディスカッション

好中球は自然免疫と適応免疫に重要な役割を果たしており、その恒常性は厳密に制御されています。好中球は、ヒト末梢血中に最も豊富な白血球であり、堅牢で速い代謝回転を有する。健康な成人は骨髄から毎日1 x 109好中球/ kgを放出することができます28。したがって、好中球の死はこの分野の不可解な謎の1つになり、好中球をよりよく理解するために多くの努力...

開示事項

著者らは、この研究は利益相反がない状態で行われたと宣言しています。

謝辞

このプロジェクトは、細胞生態系イノベーション基金の海河研究所(22HHXBSS00036、22HHXBSS00019)、中国医学科学院(CAMS)医学イノベーション基金(2021-I2M-1-040、2022-I2M-JB-015)、中央大学特別研究基金、北京ユニオン医科大学(3332022062)、および四川省科学技術支援プログラム(NO.2021YJ0480)の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm syringe filterPall Corporation4612Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tubeLABSELECTMCT-001-150Lab consumable.
15 mL Centrifuge TubesLABSELECTCT-002-15Lab consumable.
24 well cell culture plateFalcon351147Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge TubesLABSELECTCT-002-50Lab consumable.
BD LSRIIBDInstrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)Sigma AldrichC4901Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscopePerkinelmerUltraVIEW VOXInstrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plateNEST801001-20mmLab consumable for fluorescent image assay.
Counting beadsThermo FisherC36950Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFOSigma AldrichD9533Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)Sigma AldrichD2650Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine SerumGibco10099141CComponent of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-VBD51-65874XAnnexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70Abcamab113187Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NACSigma AldrichA9165Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1sEMD Millipore852391-15-2Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)Gibco15070063Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)BioLegend421301For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-ophSelleck chemS7311Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)Chugai Pharma ChinaGRANOCYTEComponent of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene TubesFalcon100-0102Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640GibcoC11875500BTComponent of neutrophil culture basic medium.
SalineLEAGENER00641Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)FENG CHUAN13-011-00029pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain SolutionSolarbioG1020Neutrophil cytospin staining.

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