במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.
זרימת האלקטרונים בשרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה (ETC) תומכת בפונקציות ביו-סינתטיות, ביו-אנרגטיות ואיתות רב-פנים בתאי יונקים. מכיוון שחמצן (O 2) הוא מקבל האלקטרונים הסופניים הנפוץ ביותר עבור יונקים ETC, קצב צריכת O2 משמש לעתים קרובות כפרוקסי לתפקוד המיטוכונדריה. עם זאת, מחקרים חדשים מראים כי פרמטר זה אינו תמיד מעיד על תפקוד מיטוכונדריאלי, שכן ניתן להשתמש בפומרט כמקבל אלקטרונים חלופי כדי לקיים תפקודים מיטוכונדריאליים בהיפוקסיה. מאמר זה אוסף סדרה של פרוטוקולים המאפשרים לחוקרים למדוד את תפקוד המיטוכונדריה ללא תלות בקצב הצריכה של O2. בדיקות אלה שימושיות במיוחד כאשר חוקרים תפקוד מיטוכונדריאלי בסביבות היפוקסיות. באופן ספציפי, אנו מתארים שיטות למדידת ייצור ATP מיטוכונדריאלי, ביוסינתזה של דה נובו פירימידין, חמצון NADH על ידי קומפלקס I, וייצור סופראוקסיד. בשילוב עם ניסויי רספירומטריה קלאסיים, בדיקות אורתוגונליות וחסכוניות אלה יספקו לחוקרים הערכה מקיפה יותר של תפקוד המיטוכונדריה במערכת העניין שלהם.
תפקוד המיטוכונדריה הוא מדד קריטי לבריאות התאים, שכן הוא מקיים פונקציות ביו-סינתטיות, ביו-אנרגטיות ואיתות מרכזיות בתאי יונקים1. הרוב המכריע של תפקודי המיטוכונדריה דורשים זרימת אלקטרונים דרך שרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), ושיבושים בזרימת האלקטרונים ב-ETC גורמים למחלה מיטוכונדריאלית חמורה2. ה-ETC מורכב מסדרה של תגובות חיזור וחמצון (חמצון-חיזור) המוטבעות בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי, ותגובות העברת אלקטרונים אלה משחררות אנרגיה חופשית שניתן לרתום לתמיכה בסינתזה של ATP, תהליכים פיזיולוגיים כגון תרמוגנזה, מסלולים ביוסינתטיים כגון ביוסינתזה של פירימידין דה נובו, ואיזון מצב החיזור של קו-פקטורים כגון NADH. קומפלקס ETC I ו- III מייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS)3,4,5, אשר, בתורם, מווסתים מסלולי איתות מרכזיים כגון HIF, PI3K, NRF2, NFκB ו- MAPK 6. כתוצאה מכך, מדדים של זרימת אלקטרונים ב-ETC משמשים באופן קלאסי כפרוקסי לתפקוד מיטוכונדריאלי בתאי יונקים.
ניסויי רספירומטריה משמשים לעתים קרובות למדידת תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים. מכיוון ש-O2 הוא מקבל האלקטרונים הסופיים הנפוץ ביותר עבור היונקים ETC, ההפחתה שלו משמשת כפרוקסי לתפקוד המיטוכונדריה. עם זאת, ראיות חדשות מראות כי מיטוכונדריה של יונקים יכולים להשתמש בפומרט כמקבל אלקטרונים כדי לקיים תפקודים מיטוכונדריאליים התלויים ב-ETC, כולל ביוסינתזה של דה נובו פירימידין 7, חמצון NADH7 וניקוי רעלים של מימן גופרתי 8. לכן, בהקשרים מסוימים, במיוחד בסביבות היפוקסיות, מדידות של שיעור צריכת O2 (OCR) אינן מספקות אינדיקציה מדויקת או מדויקת לתפקוד המיטוכונדריה.
כאן, אנו מתארים סדרה של בדיקות שניתן להשתמש בהן כדי למדוד את תפקוד המיטוכונדריה ללא תלות ב- OCR. אנו מספקים בדיקות למדידה ישירה של חמצון NADH מורכב בתיווך I, ביוסינתזה של דיהידרורוט דהידרוגנאז בתיווך דה נובו פירימידין, סינתזת ATP מורכבת תלוית V, כיווניות נטו של קומפלקס סוקצינאט דהידרוגנאז (SDH) ו-ROS שמקורו במיטוכונדריה. בדיקות אלה נועדו להתבצע על תאי יונקים בתרבית, אם כי רבים מהם יכולים להיות מותאמים לחקר תפקודים מיטוכונדריאליים in vivo. יש לציין כי הבדיקות המתוארות בפרוטוקול זה הן מדידות ישירות יותר של תפקודי מיטוכונדריה מאשר OCR. יתר על כן, הם מאפשרים מדידה של תפקוד מיטוכונדריאלי בהיפוקסיה, הקשר שבו OCR אינו מדידה אינדיקטיבית. יחד, בדיקות אלה, בשילוב עם ניסויי רספירומטריה קלאסיים, יספקו לחוקרים הערכה מקיפה יותר של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים.
1. מבחני התפשטות למדידת הפעילות של קומפלקס I, דיהידרורוט דהידרוגנאז (DHODH) ופעילויות V מורכבות
2. 13C 4-Aspartate מעקב איזוטופים יציבים וניתוח LC-MS למדידת פעילות DHODH
3. 13C 5-גלוטמין מעקב איזוטופים יציבים למדידת פעילות SDH
4. בדיקת פעילות I מורכבת ישירה
הערה: DCPIP הוא קולט אלקטרונים מלאכותי; הוא משתנה לצורתו המופחתת בעת קבלת אלקטרונים מיוביקווינול. בבדיקה זו, יוביקינון מופחת ליוביקינול באמצעות חמצון מורכב בתיווך I של NADH ל-NAD+. לפיכך, מדידת התחלופה של DCPIP מחומצן בבדיקה נטולת תאים זו היא פרוקסי לפעילות I מורכבת 7,18.
5. בדיקה מבוססת LC-MS למדידת רמות הסופראוקסיד
הערה: התכונות הפלואורסצנטיות של MitoSox Red יכולות להשתנות ללא תלות בתגובה שלו עם סופראוקסיד23. בדיקה מבוססת LC-MS זו מודדת ישירות את המוצר מסופראוקסיד המגיב עם MitoSox Red. הבדיקה הבאה שונה מעט משיאו ואחרים 24. 2-הידרוקסי-מיטואתידיום (2-OH MitoE2+) הוא תוצר של תגובת סופראוקסיד (איור 5). קו התאים Caki1 נוצל לבדיקה זו, אך ניתן להתאים את הפרוטוקול לכל תא בתרבית.
ניתן להעריך את הפעילויות של DHODH, קומפלקס I ו- V מורכב באמצעות מבחני התפשטות. עם מניעת אורידין ממדיום התרבית, התאים הופכים תלויים יותר במסלול דה נובו לביוסינתזה של פירימידין. לכן, כאשר תאים אותגרו להתרבות בתווך נטול אורידין, הם היו רגישים יותר לעיכוב פעילות DHODH על-ידי ברקינר מאשר תאים שגודלו בתווך המכיל אורידין (איור 6A). באופן דומה, שלילת פירובט ממדיום התרבית הופכת את התאים לתלויים יותר בפעילות I מורכבת לצורך התפשטות. לכן, כאשר תאים אותגרו להתרבות בתווך נטול פירובט, הם היו רגישים יותר לעיכוב של פעילות קומפלקס I על-ידי רוטנון מאשר תאים שגודלו בתרבית בתווך המכיל פירובט (איור 6B). ניתן להעריך את פעילות קומפלקס V על ידי אתגר תאים להתרבות בתווך המכיל גלקטוז במקום גלוקוז. מכיוון שגלקטוז מניב אפס ATP נטו בגליקוליזה, תאים הגדלים בדלק זה מסתמכים יותר על סינתזת ATP מיטוכונדריאלית באמצעות פעילות V מורכבת. לפיכך, תאים שהתרבו בתווך המכיל גלקטוז היו רגישים יותר לעיכוב V מורכב על-ידי אוליגומיצין מאשר תאים שהתרבו בתווך המכיל גלוקוז (איור 6C).
ניתן למדוד את פעילות SDH באמצעות מעקב 13C 5-גלוטמין ועל ידי ניטור שילובו באיזוטופולוגים fumarate ו- succinate. בתנאים שטופלו ברכב, קומפלקס SDH העדיף את הפעילות קדימה, והשילוב של 13 C 4-succinate לתוך 13 C4-fumarate היה גבוה יותר מאשר שילוב של 13 C 3-fumarate לתוך 13C 3-succinate (איור 7). בתנאים שטופלו באנטימיצין, קומפלקס SDH העדיף את הפעילות ההפוכה, והשילוב של 13 C 3-fumarate לתוך 13 C3-succinate היה גדול יותר מאשר שילוב של 13 C 4-succinate לתוך 13C 4-fumarate (איור 7).
ניתן למדוד את ייצור הסופראוקסיד בתוך המיטוכונדריה באמצעות כתב הפלואורסצנטי MitoSox, אשר מייצר 2-הידרוקסי-מיטואתידיום בתגובה עם סופראוקסידיום. במחקר זה, תאים שטופלו במיטוסוקס בנוכחות טרטבוטיל מי חמצן היו רמות גבוהות יותר של 2-הידרוקסי-מיטואתידיום באופן שדוכא על-ידי תוספת של NAC, נוגד חמצון שמרווה ROS תאי (איור 8).
איור 1: הבסיס המכניסטי לבדיקת התפשטות V המרוכבת. חמצון גלוקוז וגלקטוז באמצעות גליקוליזה. גלוקוז מניב נטו שני ATP מגליקוליזה, בעוד שגלקטוז מניב אפס ATP נטו מכיוון שסינתזת UTP נדרשת עבור UDP-גלקטוז. לפיכך, תאים הגדלים בגלקטוז תלויים יותר בסינתזה של ATP מיטוכונדריאלי בשל מחסור ב- ATP המיוצר מגליקוליזה. קיצורים: GALK = galactokinase; GALT = גלקטוז-1-פוספט uridylyltransferase; PGM1 = phosphoglucomutase 1; GPI = גלוקוז-6-פוספט איזומראז, UGP = UDP-גלוקוז pyrophosphorylase; GALE = UDP-גלקטוז-4-אפימראז; NDK = נוקלאוטיד דיפוספט קינאז; UMPK = אורידין מונופוספט קינאז; HK = hexokinase; PFK = phosphofructokinase; ALDO = aldolase; TPI = איזומראז טריוזפוספט; GAPDH = גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז; PGK = פוספוגליצראט קינאז; PGM = phosphoglucomutase; ENO = אנולאז; PK = פירובט קינאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הבסיס המכניסטי לבדיקת ההתפשטות המורכבת I. סכמטי של המסלולים המטבוליים המשתנים עם עיכוב פעילות I מורכבת. במדיה עתירת פירובט, מעכב קומפלקס I נעקף באמצעות חמצון NADH בתיווך LDH. במדיה עם מעט פירובט, הסתגלות זו פחות אפשרית, מה שהופך את התאים לתלויים יותר בפעילות I מורכבת כדי לחמצן מחדש NADH. קיצורים: LDH = dehydrogenase לקטט; מחזור TCA = מחזור חומצה טריקרבוקסילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סכמטיות של תגובת DHODH במעקב 13C 4-aspartate. Brequinar מעכב חמצון dihydroorotate כדי orotate, ובכך מונע את הסינתזה במורד הזרם של UMP. 13C 4-aspartate משולב לתוך 13C3-UMP באמצעות פעילות DHODH. קיצורים: OMM = קרום מיטוכונדריאלי חיצוני; IMM = קרום מיטוכונדריאלי פנימי; DHODH = dihydroorotate dehydrogenase. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מדידת פעילות מורכבת II קדימה ואחורה באמצעות מעקב 13C 5-גלוטמין. כדי למדוד קדימה פעילות מורכבת II (משמאל), שילוב של 13 C 5-גלוטמין לתוך 13 C 4-succinate ו 13C 4-fumarate מנוטר. כדי למדוד פעילות II מורכבת הפוכה (מימין), מנוטר שילוב של 13 C 5-גלוטמין לתוך 13 C 3-succinate ו- 13C 3-fumarate. קיצורים: SDH = succinate dehydrogenase; CytC = cytochrome C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תגובת MitoSox Red עם סופראוקסיד. התגובה של MitoSox עם סופראוקסידים מיטוכונדריאליים ליצירת 2-OH-MitoE2+. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: בדיקות מבוססות התפשטות למדידת תפקוד מיטוכונדריאלי (A) התפשטות של תאי אוסטאוסרקומה 143B שטופלו בברקינר 5 uM, מעכב DHODH, בתווך עם ±100 מ"ג/מ"ל אורידין. הנתונים הם ± SEM; N = 3 לכל תנאי. (B) התפשטות של תאי אוסטאוסרקומה 143B שטופלו ברוטנון 2 uM, מעכב קומפלקס I, בתווך עם פירובט של ±5 מילימטר. הנתונים הם ± SEM; N = 3 לכל תנאי. (C) התפשטות של תאי אוסטאוסרקומה 143B שטופלו באוליגומיצין 5 uM, מעכב V מורכב, בתווך עם גלוקוז של 10 מילימטר או גלקטוז של 10 מילימטר כמקור הפחמן המרכזי היחיד. הנתונים הם ± SEM; N = 3 לכל תנאי. * מציין p < 0.05 באמצעות בדיקת ANOVA חד-כיוונית בפריזמת Graphpad. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מעקב אחר 13C 5-גלוטמין למדידת פעילות II מורכבת. חמצון סוקצינאט והפחתת פומרט (SDH הפוך) ב-DMSO ובתאי Caki1 ו-DLD1 שטופלו באנטימיצין ב-A ב-500 ננומטר. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM; N = 3 לכל תנאי. מציין p < 0.05 באמצעות מבחן t לא מזווג ב- GraphPad Prism. קיצורים: SDH = חמצון סוקצינאט; SDH הפוך = הפחתת fumarate. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: בדיקת MitoSox מבוססת LCMS לזיהוי סופראוקסיד. כרומטוגרמת יונים מחולצת של 2-OH-Mito E2+ שבודדה מתאי Caki1 שטופלו ב-MitoSox במשך 30 דקות בנוכחות tBuOOH ±-NAC. קיצורים: LCMS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה; NAC = N-אצטיל ציסטאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: הרכב ריאגנטים, מאגרים ומדיה המשמשים בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
מכיוון שמחקרים חדשים מראים כי מיטוכונדריה של יונקים יכולים לתפקד מבלי לצרוך חמצן מולקולרי, יש חשיבות עליונה לחוקרים להשתמש בבדיקות אורתוגונליות, מעבר למדידות OCR, כדי לכמת במדויק את תפקוד המיטוכונדריה. כאן, ריכזנו סדרה של בדיקות שניתן להשתמש בהן כדי להעריך ישירות את הפעילויות של קומפלקס I, קומפלקס II, קומפלקס V ו- DHODH על ידי מדידת מאזן NAD+/NADH במיטוכונדריה, ניצול של קולטי אלקטרונים טרמינליים אדפטיביים, ייצור ATP, ביוסינתזה של דה נובו פירימידין ו-ROS שמקורו במיטוכונדריה. יש לציין כי בדיקות אלה מודדות באופן ישיר יותר את תפקוד המיטוכונדריה מאשר מדידות של זיהוי תווים אופטי (OCR). יתר על כן, בדיקות אלה מספקות לחוקרים דרכים פזיזות לכמת את תפקוד המיטוכונדריה במהלך היפוקסיה, שעבורן מדידות OCR אינן רלוונטיות במידה רבה בשל השימוש בפומרט כמקבל האלקטרונים הסופי המועדף. לבסוף, השיטות מבוססות ההתרבות המתוארות כאן חסכוניות יותר מניסויי רספירומטריה קלאסיים, ובכך מספקות דרך נגישה באופן נרחב לחקר תפקוד המיטוכונדריה במערכות יונקים.
ישנם שיקולים מרכזיים בעת שימוש בבדיקות אלה למדידת תפקוד המיטוכונדריה בתאים בתרבית. לגבי מבחני ההתפשטות, חשוב להתאים את מספר התאים שנזרעו לקצב ההכפלה של כל קו תא. התאים צריכים להיות נזרעים לפחות 10% מפגש עם מספיק מקום כדי לאפשר שלוש עד ארבע הכפלות כך שניתן יהיה לכמת את ההבדלים בהתפשטות. שיקול נוסף עבור כל בדיקה הוא ריכוז המולקולות הקטנות המשמשות כבקרות לפעילות של כל קומפלקס ETC. מכיוון שקווי תאים שונים עשויים להפגין רגישויות שונות למעכבים אלה, חיוני לבדוק את המינון של מולקולות קטנות אלה כדי לזהות את הריכוז האופטימלי.
מגבלה אוניברסלית של בדיקות החוקרות את תפקוד המיטוכונדריה במבחנה, כולל מדידות OCR וכל הבדיקות המתוארות כאן, היא ההרכב המטבולי של מדיום התרבית. מדיום תרביות תאים סטנדרטי נוטה להטות מערכות לרמות גבוהות באופן שטחי של תפקוד מיטוכונדריאלי. לדוגמה, רמות גלוטמין על-פיזיולוגיות מגבירות את האנפלרוזיס של מחזורTCA 25, אשר מזין סינתזת NADH מיטוכונדריאלית, וכתוצאה מכך, מגביר זרחן חמצוני. באופן דומה, הלחץ החלקי של חמצן נע בין 3 מ"מ כספית ל-100 מ"מ כספית (כ-0.1%-13% O2) ברקמות יונקים, אך הוא אטמוספרי (140 מ"מ כספית, כ-21%) במבחנה26,27. עודף O2 זה ממקסם את יכולת הנשימה המיטוכונדריאלית ואת ייצור הסופראוקסיד28. לאחרונה נעשו מאמצים לעצב את מדיית התרבות כך שתהיה פיזיולוגית יותר29,30. יש לציין כי תרבית תאים במדיה דמוית פלזמה אנושית מפחיתה את הנשימה המיטוכונדריאלית בחלק משורות התאים הסרטניים30, ROS מיטוכונדריאלי בתאי T31, והסתגלות מיטוכונדריאלית לטיפולים בסרטן32. לכן, זה קריטי להיות מודעים להרכב של מדיה תרבותית בשימוש ולהבין איך זה עשוי להשפיע על תפקוד המיטוכונדריה.
מגבלה חשובה ואוניברסלית נוספת בפענוח תפקוד המיטוכונדריה היא הפוטנציאל להבדלים במספר המיטוכונדריה. לכן, חיוני למדוד את תכולת המיטוכונדריה באמצעות כימות של mtDNA33, מדידת המסה המיטוכונדריאלית עם צבעים רגישים לפוטנציאל הממברנה34, או כתמים מערביים של סמנים מיטוכונדריאליים. זוהי בקרה קריטית כדי שלא יטעו לחשוב שירידה במספר המיטוכונדריה היא ירידה בתפקוד המיטוכונדריה.
קיימות גם מגבלות ספציפיות ופתרון בעיות החלות על הבדיקות המתוארות כאן. ראשית, בהתחשב בכך שתאים ממוינים אינם מתרבים, הבדיקות מבוססות ההתרבות לא יהיו שימושיות להערכת תפקוד המיטוכונדריה בהקשר זה. מגבלה מרכזית של פרוטוקול מעקב 13C 4-aspartate למדידת פעילות DHODH היא שספיגת אספרטט בתאים יכולה להיות מאוד לא יעילה35. כדי להתגבר על מגבלה פוטנציאלית זו, החוקרים יכולים לבטא יתר על המידה את טרנספורטר האספרטט, SLC1A3, כדי להקל על ספיגה של 13C 4-aspartate35.
מגבלה של הפרוטוקול המשתמש במעקב 13C 5-גלוטמין למדידת פעילות SDH היא שבדיקה זו דורשת מתאים לנצל את מסלול הקרבוקסילציה הרדוקטיבי כדי להעשיר את איזוטופולוגים M+3 על מנת למדוד את הפעילות ההפוכה. קווי תאים מסוימים אינם מסוגלים לשטף קרבוקסילציה רדוקטיבי עקב ביטוי ATP ציטראט ליאז נמוך36, ייצוב HIF לא מספיק 37, או יחס α-KG:ציטראט נמוך מדי38. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להשתמש במעקב 13C 4-aspartate כדי למדוד את פעילויות SDH קדימה ואחורה7. בבדיקה זו, ניתן למדוד את הפעילות קדימה של SDH על ידי היחס של fumarate M+2:succinate M+2 ואת התגובה ההפוכה על ידי succinate M+4:fumarate M+4. יש לציין כי מעקב זה עוקף את רוב האנזימים במסלול הקרבוקסילציה הרדוקטיבי.
מגבלה של בדיקת פעילות I מורכבת באמצעות הפחתת DCPIP כקריאה היא שהמיטוכונדריה אינם שלמים מבחינה מבנית. תהליך ההפשרה בהקפאה של המיטוכונדריה כדי לאפשר ספיגת NADH שלהם לבדיקה יכול בהחלט להכתים את השלמות המבנית של קרום המיטוכונדריה39. בדיקה זו צריכה להתבצע במקביל לבדיקות כגון בדיקת התפשטות I מורכבת כדי להבטיח שהשינויים בפעילות I מורכבת שנצפתה נכונים גם עם תאים שלמים.
במחקרים עתידיים, חלק מהטכניקות הללו יכולות להיות מותאמות למדידת תפקודים מיטוכונדריאליים in vivo באמצעות אורגניזמים מודל כגון עכברים ו- Caenorhabditis elegans. השיטות הנוכחיות המשמשות למדידת תפקוד המיטוכונדריה in vivo מתמקדות בזיהוי תווים אופטי (OCR) ברמת האורגניזם, במיוחד בקצב החליפין של דרכי הנשימה בעת שימוש במודלים של עכברים. מגבלה ברורה של שיטה זו היא שהחמצן משמש פונקציות ביוכימיות ואיתות רבות מעבר לתפקידו כקולט אלקטרונים טרמינליים הנמצאים בכל מקום במיטוכונדריה וכו'. לדוגמה, חמצן "נצרך" על ידי הפעילות הקטליטית של אנזימים ממשפחת הדיאוקסיגנאז. למרות שאנזימים אלה תורמים לקצב צריכת החמצן בתאים, הם אינם משתתפים, מווסתים או משקפים את תפקוד המיטוכונדריה. ניסויי רספירומטריה קלאסיים במבחנה בדרך כלל שולטים ב"OCR לא מיטוכונדריאלי", בעוד שניסויי יחס חילופי נשימה אורגניזם (RER) אינם יכולים לשלוט בכך, ומגבילים את הפרשנות של RER כמדד לתפקוד מיטוכונדריאלי in vivo. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקולים למדידת פעילות DHODH באמצעות מעקב 13 C 4-aspartate, פעילות מורכבת II באמצעות מעקב 13C5-גלוטמין, פעילות I מורכבת על מיטוכונדריה מטוהרת מרקמות, ו-ROS מיטוכונדריאלי באמצעות תרכובות ידידותיות LC-MS כגון MitoB על מנת למדוד את תפקוד המיטוכונדריה in vivo . בדיקות ישירות אלה לחקירת תפקודי מיטוכונדריה, בשילוב עם ניסויי רספירומטריה קלאסיים, מספקים לחוקרים הערכה מקיפה ומדויקת יותר של תפקוד המיטוכונדריה בתאים וברקמות של יונקים.
למחברים אין ניגודי עניינים לדווח עליהם.
האיורים המופיעים בכתב יד זה נוצרו BioRender.com. אנו אסירי תודה לאיימי ווקר על מתן משוב על מאמר זה. J.B.S. נתמך על ידי קרן וורצ'סטר למחקר ביו-רפואי Grant.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
ReCO2ver Incubator | Baker | ||
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved