הקמה ואישור של מודל עכבר עומס יתר על נפח החדר הימני לאחר הלידה

Summary

פרוטוקול זה מציג את ההקמה והאישור של מודל עומס יתר של נפח החדר הימני (VO) לאחר הלידה בעכברים עם פיסטולה עורקית בטנית (AVF), אשר ניתן ליישם כדי לחקור כיצד VO תורם להתפתחות הלב לאחר הלידה.

Abstract

עומס יתר בנפח החדר הימני (RV) שכיח בקרב ילדים עם מחלת לב מולדת. לאור שלבים התפתחותיים ברורים, שריר הלב של RV עשוי להגיב באופן שונה ל- VO אצל ילדים בהשוואה למבוגרים. המחקר הנוכחי נועד לבסס מודל RV VO לאחר הלידה בעכברים המשתמשים בפיסטולה עורקית בטנית שונה. כדי לאשר את יצירת VO ואת השינויים המורפולוגיים וההמודינמיים הבאים של RV, אולטרסאונד בטן, אקוקרדיוגרפיה, צביעה היסטוכימית בוצעו במשך 3 חודשים. כתוצאה מכך, ההליך בעכברות לאחר הלידה הראה שיעור הישרדות והצלחה פיסטולה מקובל. בעכברי VO, חלל הקרוואן הוגדל עם דופן חופשית מעובה, ונפח השבץ הוגדל בכ-30%-40% תוך חודשיים לאחר הניתוח. לאחר מכן, הלחץ הסיסטולי RV גדל, רגורגיטציה של שסתום ריאתי תואם נצפתה, והופיע שיפוץ עורק ריאתי קטן. לסיכום, ניתוח פיסטולה עורקית מותאמת (AVF) אפשרי כדי לבסס את מודל RV VO בעכברים לאחר הלידה. בהתחשב בהסתברות לסגירת פיסטולה והתנגדות מוגברת לעורק הריאתי, יש לבצע אולטרסאונד בטן ואקוקרדיוגרפיה כדי לאשר את מצב המודל לפני היישום.

Introduction

עומס נפח החדר הימני (RV) (VO) שכיח בקרב ילדים עם מחלת לב מולדת (CHD), מה שמוביל לעיצוב מחדש פתולוגי של שריר הלב ופרוגנוזה גרועה לטווח ארוך ^1,2,3. הבנה מעמיקה של שיפוץ קרוואנים והתערבויות מוקדמות מוקדמות הקשורות חיונית לתוצאה טובה אצל ילדים עם CHD. ישנם מספר הבדלים במבנים המולקולריים, בתפקודים הפיזיולוגיים ובתגובות לגירויים בליבם של מבוגרים וילדים^בגילאי 1,4,5,6. לדוגמה, בהשפעת עומס לחץ, התפשטות קרדיומיוציטים היא התגובה העיקרית בלבבות יילודים, ואילו פיברוזיס מתרחשת בלבבות בוגרים ^5,6. בנוסף, לתרופות יעילות רבות לטיפול באי ספיקת לב במבוגרים אין השפעה טיפולית על אי ספיקת לב בילדים, ואף עלולות לגרום לנזק נוסף ^7,8. לכן, מסקנות שהוסקו מבעלי חיים בוגרים אינן יכולות להיות מיושמות ישירות על בעלי חיים צעירים.

מודל הפיסטולה העורקית (AVF) שימש לגרימת VO כרוני בלב ותפקוד לקוי של הלב במשך עשרות שנים בבעלי חיים בוגרים ממינים שונים 9,10,11,12,13. עם זאת, מעט ידוע על המודל בעכברים לאחר הלידה. במחקרים הקודמים שלנו, מודל עכבר VO לאחר הלידה נוצר בהצלחה על ידי יצירת AVF בטן. המסלול ההתפתחותי של הקרוואנים שהשתנו בלב לאחר הלידה הודגם גם הוא^14,15,16,17.

כדי לבחון את התהליך הכירורגי המותאם ואת המאפיינים של המודל הנוכחי, מוצג פרוטוקול מפורט; המודל מוערך במשך 3 חודשים במחקר זה.

Protocol

כל הנהלים המוצגים כאן תאמו את העקרונות המפורטים בהצהרת הלסינקי ואושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים ולימודי אדם במרכז הרפואי לילדים בשנחאי (SCMC-LAWEC-2023-003). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בגורי עכברים C57BL/6 (P7, זכרים, 3-4 גרם). בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). גורי העכברים ואימהותיהם המניקות (גורים:אמהות = 6:1 בכלוב יחיד) הוחזקו בתנאי מעבדה ספציפיים נטולי פתוגנים במחזור אור וחושך של 12 שעות בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס עם גישה חופשית למים ותזונה תזונתית. הגורים חולקו באקראי לשתי קבוצות: קבוצת VO וקבוצת דמה (דמה).

1. הכנת ציוד וכלי ניתוח

הערה: הפרטים המסחריים של כל החומרים/ציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. ודא כי סוגי הציוד הבאים מוכנים ומתפקדים כראוי: שולחן ניתוחים (לוח פלסטיק מוקצף), מכונת הרדמה בשאיפה, מיקרוסקופ עם תאורה אנכית ומצלמה מובנית, מכשיר אולטרסאונד עם מתמר 24 MHz ופלטפורמת חימום תרמוסטטית.
2. לעקר את כלי הניתוח (כלומר, מחזיק מיקרו-מחט, מלקחיים עדינים ומספריים קפיציים Vannas עגולים).
3. להרכיב את החומרים המתכלים הבאים: 11-0 ו 9-0 מחטי תפר כירורגי (נקודת taper) עם חוט, רצועות קלטת, מחטי מזרק 5 מ"ל, משי 2-0 (קיבוע כירורגי), צמר גפן סטרילי, וג'ל אולטרסאונד.
4. ודא שהריאגנטים הבאים קיימים: בטדין, אתנול 70%, מי מלח סטריליים רגילים, איזופלורן, פרצטמול, משחה אופתלמית וקרם להסרת שיער.

2. הליך כירורגי

הערה: הליך ניתוח הפיסטולה שונה בהתאם לשיטה¹¹ שתוארה לעיל. איור 1 מראה תרשים סכמטי של פעולת AVF בעכברות לאחר לידה.

1. הרדמה וריסון
   1. הכניסו את גורי העכברים לקופסת השראת הרדמה המסופקת עם 2% איזופלורן/חמצן למשך 2 דקות כאשר הזרימה מוגדרת ל-1 ליטר/דקה. מתן פרצטמול (0.1 מ"ל PO של 80 מ"ג/2.5 מ"ל) באמצעות מזרק שחפת.
   2. הניחו את הגורים במצב שכיבה על שולחן הניתוחים עם שאיפת אף של 1.5% איזופלורן עם זרימה של 0.8 ליטר/דקה לשמירה על הרדמה. התאימו את מיקום הגור על ידי קשירת הרגליים למחטי המזרק הקבועות. יש למרוח משחה אופתלמית על עיני הגורים כדי למנוע התייבשות הקרנית.
   3. צבטו את זנבו של הגור המורדם כדי לבדוק את תגובתו לכאב; אין תנועות גוף ברורות המעידות על הרדמה מספקת.
2. ניתוח פיסטולה
   1. לחטא את העור עם שלושה קרצוף לסירוגין של betadine ו 70% אתנול, ולאחר מכן לעטוף את האתר כירורגי. חותכים את קיר הבטן ואת הצפק מן הבטן התחתונה אל subxiphoid כדי לחשוף באופן מלא את חלל הצפק, תוך זהירות לא לפגוע באיברי הבטן. טפטוף מלח סטרילי רגיל כדי להרטיב איברים חיצוניים.
   2. משכו בעדינות את מערכת העיכול ושלפוחית השתן הרחק מאתר הניתוח באמצעות צמר גפן כדי לדמיין את אבי העורקים הבטני האנכי (AA) ואת הווריד הנבוב התחתון (IVC) מתחת לרטרופריטונאום. סובב את שולחן הניתוחים ב-90° נגד כיוון השעון וכוונן את הגדלת המיקרוסקופ כדי להמחיש את שני הכלים האופקיים בבירור.
   3. נקבו את הפיסטולה מה- AA לתוך IVC בכיוון אלכסוני 1 ס"מ דיסטלי לעורק הכליה עם מחט תפר 11-0 (קוטר = 0.07 מ"מ). לוודא יצירת פיסטולה מוצלחת על בסיס נפיחות וערבוב של דם ורידי ועורקי IVC.
   4. לאחר מכן, דחסו במהירות את נקודת הדימום באמצעות כוח מתאים המופעל עם צמר גפן יבש במשך 15 שניות. החלף את הקיבה, המעיים ושלפוחית השתן בחלל הבטן בהקדם האפשרי כדי לקדם דחיסה המוסטטית.
   5. תפרו את דופן הבטן והצפק בתפר שמיכה באמצעות חוט תפר 9-0. יש להפסיק את ההרדמה ולספק לגורים 100% חמצן למשך דקה.
3. החייאה בהרדמה
   1. הניחו את הגורים על משטח חימום בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס. לאחר התעוררות מוחלטת עם חיוניות, להחזיר את הגורים לאמם המניקה. ההליך כולו נמשך כרבע שעה.
      הערה: במחקר הנוכחי, קבוצת הדמה עוברת את אותו הליך למעט שלב הניקוב.

3. אישור אולטרסאונד של פיסטולה

הערה: הפעולה הכללית של מכשיר האולטרסאונד הייתה זהה לדיווחים קודמים^18,19.

1. אישור פיסטולה על ידי אולטרסאונד בטן
   1. לאחר השראת הרדמה (שלב 2.1.1), תקן את העכברים עם רצועות סרט במצב שכיבה על הפלטפורמה החמה. לאחר מכן, חבר את העכברים למוניטור אלקטרוקרדיוגרמה (ECG) באמצעות ג'ל אולטרסאונד. יש להרדים באמצעות איזופלורן 1.5% בזרימה של 0.8 ליטר/דקה.
   2. הכינו את עור החזה והבטן באמצעות קרם להסרת שיער. לאחר מספר שניות, הסירו את הקרם עם קצה כותנה חם ספוג מים. מניחים את המתמר (24 מגה הרץ) על קו אמצע הבטן ומסובבים את סמן המתמר לראש העכברים.
   3. הזז את הפלטפורמה למטה לצד שמאל או ימין של העכברים והשתמש במצב B ובמצב דופלר צבע כדי להמחיש את תצוגת הציר הארוך של כלי הדם ואותות הדם^18,19. למדוד את מהירות זרימת הדם של AA, IVC ופיסטולה כדי לאשר פטנט AVF באמצעות מצב דופלר גל פועם.
      הערה: יצירת פיסטולה מוצלחת באולטרסאונד צויינה על-ידי אות זרימה טורבולנטי שנראה בין AA ל-IVC (איור 2C). מהירות זרימת הדם בדופלר באתר AVF הייתה גבוהה משמעותית בהשוואה למהירות סיסטולית נמוכה יחסית ב-AA (איור 2A,C). יתר על כן, בניגוד לדפוסי זרימה נורמליים ב-IVC (איור 2B), צורת הגל הפעימה של זרימת הדם IVC הקרובה ל-AVF גם אישרה את היצירה המוצלחת של הפיסטולה (איור 2D).
2. אישור VO על ידי אקוקרדיוגרפיה
   1. הזיזו את החלק בקצה הזנב של הפלטפורמה כלפי מטה, הניחו את המתמר (24 מגה-הרץ) על החזה וסובבו את סמן המתמר לכתף ימין של העכברים. דמיינו את תצוגת הציר הארוך של עורק הריאה (PA) שהשתנתה באמצעות מצב B ומצב דופלר צבעוני.
   2. באמצעות מצב דופלר גל פועם, מודדים אותות זרימת דם ברשות הפלסטינית, כולל אינטגרל זמן המהירות (PA-VTI), קוטר מסתם הרשות הפלסטינית (PAD), זמן האצת עורקי הריאה (PAT) וזמן פליטת RV (RVET) (איור 2E,F ואיור 3A,B).
   3. מדוד את פרמטרי האולטרסאונד מהממוצע של שלוש מדידות רצופות. חשב את נפח שבץ RV (RVSV, מ"ל) ולחץ סיסטולי RV (RVSP, mmHg) באמצעות הנוסחאות הבאות²⁰:
      RVSV [mL] =1/4 × πD² × VTI_PA
      RVSP [mmHg] = -83.7 × PAT/RVET - אינדקס + 63.7
      הערה: בהתחשב בהטיית מדידת האולטרסאונד, עלייה של >15% ב-RVSV או VTI_PA בעכברי VO בהשוואה לעכברים בקבוצת הדמה נחשבה ל-VO בקרוואן (איור 2E,F).

תוצאות

שיעור הישרדות ופטנט AVF תוך 3 חודשים
30 (75%) עכברים בקבוצת VO ו-19 (95%) עכברים בקבוצת הדמה שרדו את ניתוח AVF (איור 4A). בקבוצת VO, שמונה עכברים מתו תוך יום אחד לאחר הניתוח עקב דימום מוגזם (n = 5) או קניבליזציה (n = 3), בעוד שני עכברים מתו מסיבות לא ידועות בגיל חודש.

מבי?...

Discussion

בעבר, מודל RV VO הקלאסי נוצר באמצעות regurgitation^{שסתום 21}; עם זאת, בהשוואה ל- AVF, ניתוח מסתם לב פתוח עשוי לדרוש טכניקות מתוחכמות יותר ועשוי להיות קשור לתמותה גבוהה משמעותית, במיוחד בעכברים לאחר לידה. מכיוון שמחקרים בבעלי חיים הראו כי אותה השפעה של VO הושגה על ידי AVF²², ניתוח פי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Tiandz,Chia
ACETAMINOPHEN Oral Solution	VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA	NDC 66689-054-01
Anesthesia machine	RWD Life Science,China	R550IP
Anesthesia mask	RWD Life Science,China	68680
C57BL/6 mice	Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China)
Hair removal cream	Veet, France	VT-200
Hematoxylin and eosin Kit	Beyotime biotech	C0105M
Isoflurane	RWD Life Science,China	R510-22-10
Microscope	Yuyan Instruments, China	SM-301
Surgical suture needles	NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China
Thermostatic heating platform	Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China
Ultrasound device	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100	Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode
Ultrasound gel	Parker Laboratories,United States	REF 01-08
Ultrasound transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS 400