JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מדווח על שיטה ייחודית של שימוש בציטומטר זורם ונוגדנים מרובים להערכה בו-זמנית של פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאלים מרובים, כולל שינויים בנפח המיטוכונדריה, כמויות של תת-יחידות מורכבות של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) ושכפול DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA).

Abstract

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא תורם ראשוני או משני שכיח לסוגים רבים של ניוון עצבי, ושינויים במסה המיטוכונדריאלית, קומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) ומספר עותק ה-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) מופיעים לעתים קרובות בתהליכים אלה. אורגנואידים של מוח אנושי שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) מסכמים את הסידור הציטו-ארכיטקטוני התלת-ממדי של המוח ומציעים אפשרות לחקור מנגנוני מחלה ולסנן טיפולים חדשים במערכת אנושית מורכבת. כאן, אנו מדווחים על גישה ייחודית המבוססת על ציטומטריית זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים באורגנואידים קליפת המוח שמקורם ב-iPSC. דוח זה מפרט פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במוח בקליפת המוח מ-iPSCs, דיסוציאציה של תא בודד של אורגנואידים שנוצרו, קיבוע, צביעה וניתוח זרימה ציטומטרי לאחר מכן כדי להעריך פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים. צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד תת-היחידה של קומפלקס MRC NADH: Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B10 (NDUFB10) או גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM) יחד עם ערוץ אניונים סלקטיבי תלוי מתח 1 (VDAC 1) מאפשר הערכה של כמות החלבונים הללו למיטוכונדריון. מכיוון שכמות ה-TFAM תואמת את כמות ה-mtDNA, היא מספקת הערכה עקיפה של מספר עותקי ה-mtDNA לכל תוכן מיטוכונדריאלי. ניתן להשלים את כל ההליך הזה תוך 2-3 שעות. באופן מכריע, הוא מאפשר כימות בו-זמני של פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים, כולל רמות כוללות וספציפיות ביחס למסה המיטוכונדריאלית.

Introduction

מיטוכונדריה הם אברונים תאיים חיוניים והאתר העיקרי של ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP). מעבר לאספקת אנרגיה לתאים, המיטוכונדריה גם משתתפת בתהליכים תאיים מרובים, כולל העברת מידע תאי, התמיינות תאים ואפופטוזיס, ויש לה את היכולת לווסת את צמיחת התאים ואת מחזור התאים. זוהו שינויים בתפקוד המיטוכונדריה במחלות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD)1,2, מחלת אלצהיימר (AD)3 וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS)4. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ממלא תפקיד בתהליך ההזדקנות, מצטבר מוטציות mtDNA סומטיות וירידה בתפקוד שרשרת הנשימה5.

סוגים שונים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מתרחשים בניוון עצבי, והיכולת למדוד שינויים כאלה שימושית ביותר בעת חקר מנגנוני מחלה ובדיקת טיפולים פוטנציאליים. יתר על כן, הקמת מערכות מתאימות למודל מבחנה המסכמות מחלות בתאי מוח אנושיים חיונית להבנה טובה יותר של מנגנוני המחלה ולפיתוח טיפולים חדשים. iPSCs מחולים עם מחלות נוירודגנרטיביות שימשו ליצירת תאי מוח מגוונים המבטאים נזק מיטוכונדריאלי 6,7,8,9. הפיתוח של אורגנואידים תלת-ממדיים במוח שמקורם ב-iPSCs הוא צעד מרכזי במודלים של מחלות. אורגנואידים מוחיים אלה שמקורם ב-iPSC מספקים מורכבות ומכילים את הרקע הגנטי של המטופל עצמו, ובכך מספקים מודל מחלה המשקף בצורה מדויקת יותר את הפתולוגיה במוחו של המטופל.

אמנם נערכו מחקרים מסוימים במיטוכונדריה על אורגנואידים במוחשמקורם ב-iPSC 10,11,12, אבל הטכניקות הנוחות והאמינות לקביעת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאלים מרובים באורגנואידים במוח שמקורם ב-iPSC עדיין מוגבלות. ציטומטריית זרימה מספקת כלי רב עוצמה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים ברמת התא הבודד, כפי שהדגמנו בעבר13. מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנואידים בקליפת המוח מ-iPSCs, בשילוב עם גישה חדשה מבוססת זרימה ציטומטרית למדידה בו-זמנית של פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים, כולל מסה מיטוכונדריאלית, תת-יחידות מורכבות של שרשרת נשימה ומספר עותק mtDNA (איור 1). חשוב לציין, על ידי שימוש במסה המיטוכונדריאלית כמכנה, פרוטוקולים אלה מאפשרים למדוד הן את הרמות הכוללות והן את הרמות הספציפיות ליחידה מיטוכונדריאלית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. התמיינות של iPSCs לאורגנואידים בקליפת המוח

  1. הכנת צלחות מצופות מטריצה
    1. הפשירו את הבקבוקון של מטריצת קרום הבסיס הזמינה מסחרית על קרח למשך הלילה. יש לדלל ל-1:100 בקור Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/F12 DMEM/F12 של חזיר (ריכוז סופי של 1%). הכינו מינוסים ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים).
    2. מפשירים את תמיסת מטריצת הממברנה ב-4 מעלות צלזיוס (שומרים על קור) ומצפים את מספר הבארות הנדרש (1 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות). יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. קח את הצלחת מהחממה ותן לה להגיע לטמפרטורת החדר (RT) (השאירו אותה למשך שעה).
      הערה: ניתן לאחסן את הצלחות עד שבועיים במקרר (זכרו להוציא אותן ולחמם את הבארות המצופות הנדרשות לאותו יום ב-RT עד שהוא כבר לא קריר למגע לפני השימוש). מומלץ להשתמש בצלחות תוך 3 ימים. לאחסון לאורך זמן, הוסף 1 מ"ל של Essential 8 Medium (ראה טבלת חומרים) לצלחת המצופה כדי למנוע התייבשות של הג'ל.

2. הכנה חיונית 8 (E8) מדיום לתרבית iPSC

  1. בסביבה סטרילית, הכן את E8 Medium על ידי שילוב של E8 בסיסי עם תוסף E8 (ראה טבלת חומרים). ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
    הערה: יש להפשיר תוסף E8 קפוא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני הכנת המדיום המלא. לא מומלץ להפשיר את התוסף הקפוא ב-37 מעלות צלזיוס; יש להשתמש ב-E8 Medium למשך שבועיים. לפני השימוש, נדרש לחמם E8 Medium לאותו יום ב-RT עד שהוא כבר לא קריר למגע.

3. תת-תרבות של iPSCs

  1. מחממים מראש צלחות מצופות מטריצה ב-RT או בחממה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. יש לחמם מראש את כמות ה-E8 Medium הדרושה ב-RT.
  2. שאפו את מדיום התרבות בעזרת פיפטה.
  3. שטפו iPSCs (ראה טבלת חומרים) עם תמיסת מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco (Ca2+/Mg2+ חינם) (DPBS-/-) (4 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות).
  4. הוסף חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) (0.5 מ"מ) (1 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות). דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס עד ששולי המושבות מתחילים להתנתק מהצלחת (בדרך כלל 3-5 דקות).
  5. שאפו את תמיסת הדיסוציאציה.
  6. הוסף E8 בינוני מחומם מראש (4 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות) והשתמש בלחץ גבוה כדי לנתק מושבות iPSC.
  7. מעבירים לשתי בארות שונות בצלחת מצופה מטריצה של 6 בארות (2 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות) ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש לנער בעדינות לפני הכנסת הצלחת לחממה. יחס הפיצול יכול להיות 1:2-1:4.
  8. החלף מדיה מדי יום עד שהמושבות מקבלות מפגש של 80% עם גודל וחיבורים טובים.
    הערה: עקוב אחר מושבות בגודל מתאים, המאופיינות בדרך כלל בצורה מעגלית מוגדרת היטב ובקוטר שנע בין 0.5 ל-1 מ"מ. המושבות צריכות להציג מבנים צפופים וקומפקטיים עם גבולות ברורים וחלקים.

4. היווצרות גוף עוברי (EB) ואינדוקציה עצבית

  1. הכן מדיום אינדוקציה עצבית (NIM) על ידי שילוב הרכיבים המפורטים בטבלת החומרים.
  2. שאפו מדיום ושטפו את התאים עם DPBS -/- (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
  3. מוסיפים אקוטאז מחומם מראש (1 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) (ראה טבלת חומרים) בבאר ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה 3 עד 4 פעמים באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
  5. לנטרל עם 2 מ"ל DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ולצנטריפוגה את הצינור החרוטי של 15 מ"ל המכיל את התאים ב-600 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את הסופרנטנט.
  6. השעו מחדש את כדורי התא על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה עד למשטחים חד-תאיים.
  7. ספרו וחישבו את ריכוז התאים החיים באמצעות טריפן כחול14 במונה תאים אוטומטי.
  8. חשב את יחס הדילול ודלל תאים ב-NIM כדי ליצור ריכוז תאים סופי של 60,000 תאים חיים/מ"ל.
  9. הוסף את מעכב החלבון קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) Y-27632 (ריכוז סופי 50 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים) לתרחיף התא וערבב בעדינות.
  10. הוסף 150 מיקרוליטר של תרחיף תא בודד לכל באר של צלחת 96 בארות חיבור נמוכה במיוחד (ראה טבלת חומרים) והנח בחממה. הגדר כיום 0.
  11. ביום הראשון, בדוק את התאים ואת צורות ה-EB בכל באר.
    הערה: העריכו היווצרות EB מוצלחת על סמך המראה הבהיר, הכדורי והשקוף שלהם תחת מיקרוסקופ, יכולתם להישאר צפים ונפרדים, והיעדר תאים מתים, המופיעים ככתמים כהים.
  12. ביום השני, הסר 75 מיקרוליטר בינוני מכל באר בזהירות והוסף 150 מיקרוליטר NIM יחד עם 50 מיקרומטר Y-27632 לכל באר.
  13. בימים 4, 6 ו-8, הוציאו 100 מיקרוליטר בינוני מכל באר והוסיפו 150 מיקרוליטר NIM לכל באר.

5. יצירת אורגנואידים בקליפת המוח

  1. הכן מדיום התמיינות עצבית מינוס ויטמין A (NDM-) על ידי שילוב הרכיבים המפורטים בטבלת החומרים.
  2. ביום 10, העבירו EBs מצלחת 96 בארות החיבור הנמוכה במיוחד לצלחת 6 בארות החיבור הנמוכה במיוחד באמצעות פיפטה של 5 מ"ל. העבירו שמונה EBs לכל באר בזהירות (איור 2). הוסף 5 מ"ל NDM- לכל באר.
  3. הנח את הצלחת על שייקר המסלול בתוך החממה והתחל להסתובב ב-80 סל"ד.
  4. בימים 12, 14 ו-16, החלף את ה-NDM- ב-4 מ"ל לאחר שאיבת מדיום ישן של 3 מ"ל.

6. התבגרות ותרבות ארוכת טווח של אורגנואידים בקליפת המוח

  1. הכן מדיום התמיינות עצבית עם ויטמין A (NDM+) וגורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF). לפרטים, ראה טבלת חומרים.
  2. ביום ה-18, הסר את המדיום של 3 מ"ל והוסף 4 מ"ל NDM+.
  3. החזירו את הצלחת לתרבות המסתובבת.
  4. האכילו כל 4 ימים ושמרו על האורגנואידים המובחנים בקליפת המוח ב-NDM+ עד לשימוש. אורגנואידים קליפת המוח בני 25-40 יום שימשו לניתוח במורד הזרם.
    הערה: ניתן לשמור על האורגנואידים בקליפת המוח זמן רב יותר (עד 3-4 חודשים); אבל כדאיות התאים תרד בגלל היעדר חילופי תזונה.

7. אפיון תאים על ידי אימונוציטוכימיה וצביעה אימונופלואורסצנטית

  1. השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לאסוף בעדינות את האורגנואיד מהמדיום ולהניח אותו בעדינות על מדיום עם מדיום מינימלי בשקופית מיקרוסקופ רגילה.
  2. הניחו לו להתייבש לחלוטין ב-RT. הוסיפו 4% פרפורמלדהיד (PFA) (300 מיקרוליטר לדגימה) למשך 30 דקות. יש להסיר את ה-PFA ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS.
    הערה: PFA רעיל וחשוד כמסרטן. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים, ולטפל מתחת למכסה אדים כימי.
  3. מוסיפים 30% תמיסת סוכרוז (300 מיקרוליטר לדגימה) למגלשות ודוגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. חסום וחדור את האורגנואידים עם חיץ חוסם (BB) (300 מיקרוליטר לדגימה) המכיל PBS (עם Ca2+/Mg2+), 0.3% טריטון X-100 ו-10% סרום עיזים רגיל למשך שעתיים ב-RT (או לילה ב-4 מעלות צלזיוס). מתאר את האורגנואידים בעזרת עט מחסום הידרופובי כדי לשמור על המאגר על המגלשה.
  5. שכב דגימות עם נוגדן ראשוני במאגר חוסם (300 מיקרוליטר לדגימה), אנטי-SRY (אזור קובע מין Y)-תיבה 2 (SOX2, 1:100), וסמן אנטי-עצבי טוברין בטא III (Tuj1, 1:1000), ודגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בחושך (ראה טבלת חומרים).
  6. שטפו ב-PBS למשך 3 שעות עם שניים עד שלושה החלפות חיץ על פלטפורמת נדנדה עדינה.
  7. דגירה עם נוגדן משני (300 מיקרוליטר לדגימה), קמח אנטי-אלקסה 488 (1:800) וקמח אנטי-אלקסה 594 (1:800), למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בחדר חושך לח. הוסף כתם גרעיני Hoechst 33342 (1:5000) בו זמנית (ראה טבלת חומרים).
  8. שאפו את הנוגדן ושטפו במהירות עם PBS, ולאחר מכן הוסיפו PBS המכיל 0.01% NaAzide למשך 1-2 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע זיהום.
  9. שאפו את ה- PBS והסירו את התמיסה העודפת. הרכיב את האורגנואידים עם אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן הוסף כיסוי. הימנע מהיווצרות בועות אוויר והנח בחדר חשוך ב-RT למשך 12 שעות לפחות כדי לאפשר להרכבה להתפלמר במלואה.
    הערה: הדגימה מוכנה כעת לדמיון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

8. דיסוציאציה של אורגנואידים בקליפת המוח

  1. הוסף 30 מ"ל DPBS -/- בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
  2. אסוף בעדינות את האורגנואידים במוח בצינור באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. לפחות 3 אורגנואידים משמשים לצביעה אחת, והם צריכים להיות בני יותר מ-25 יום אך פחות מ-40 יום.
  3. אורגנואידים משקעים למשך כ -5 דקות. אין צנטריפוגה.
  4. שאפו DPBS והוסיפו 2 מ"ל Accutase מחומם מראש בצינור. דגרו את הדגימה באמבט המים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. יש לשלש 15 פעמים בעדינות באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר מבלי ליצור בועות. דגרו את הדגימה למשך 5 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  6. מנותק בעדינות על ידי שימוש בקצות פיפטה של 1000 מיקרוליטר 15 פעמים מבלי ליצור בועות (איור 3A).
    הערה: אם עדיין יש כמה תאים לא מפורקים, העבירו את התאים הלא מפורקים לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל ולאחר מכן דגרו למשך 5 דקות נוספות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן התנתק בעדינות על ידי שימוש בקצות פיפטה של 1000 מיקרוליטר 20 פעמים.
  7. לנטרל עם 4 מ"ל DMEM עם 10% FBS וצנטריפוגה את הצינור החרוטי של 15 מ"ל המכיל את התאים ב-600 x גרם למשך 5 דקות ב-RT.
  8. שאפו סופרנטנט והשעו מחדש עם 200 מיקרוליטר DPBS באמצעות קצות פיפטה של 1000 מיקרוליטר 10 פעמים מבלי ליצור בועות.
  9. הוסף 200 μL DPBS כדי ליצור נפח כולל של מתלי תאים של 400 μL ב-DPBS.
  10. סנן עם המסנן או צינור המסנן (השתמש במסננים של 35 או 40 מיקרומטר ושטוף את המסנן עם DPBS לפני השימוש במסנן).
  11. הפרד מחצית מהתמיסה בשפופרת והשתמש בה כדגימה לא מוכתמת.

9. מדידת ציטומטריית זרימה של תת-יחידות מורכבות MRC ו-TFAM בתאים קבועים

  1. הוסף צבע צביעה חי ומת (L/D) (1: 1000) (ראה טבלת חומרים) (עם אדום רחוק או אינפרא אדום קרוב, תלוי בהגדרה של הסמנים לציטומטריית זרימה).
    הערה: אם נפתח בקבוקון חדש לצבע L/D, הוסף 50 מיקרוליטר DMSO כדי להרכיב מחדש וצור מינון של 10 מיקרוליטר כדי לאחסן אותם ב-20 מעלות צלזיוס.
  2. יש לשמור ב-RT ובחושך למשך 30 דקות. הוסף 40 מ"ל DPBS -/-. צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 x גרם למשך 5 דקות.
  3. השעו מחדש לתרחיף חד-תאי לאחר השלכת הסופרנטנט.
  4. תקן וחדור את התאים עם 1 מ"ל 90% מתנול קר כקרח ב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  5. חסום את הדגימות במאגר בלוק של 1 מ"ל המכיל 0.3 M גליצין, 5% סרום עיזים ו-1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS (עם Ca2+/Mg2+).
  6. שטפו עם מאגר זרימה של 20 מ"ל המכיל PBS (עם Ca2+/Mg2+) עם 0.2% BSA פעם או פעמיים.
  7. הוסף את הנוגדנים העיקריים נגד NDUFB10 מצומד עם Alexa Fluor 405 (1:100), אנטי-VDAC 1 מצומד עם Alexa Fluor PE (1:100) ונוגדנים נגד TFAM מצומדים עם Alexa Fluor 488 (1:200) למשך 30 דקות (ראה טבלת חומרים).
  8. שטפו עם מאגר זרימה של 20 מ"ל.
  9. שאפו והשאירו כ-100 מיקרוליטר והרכיבו מחדש את כדורי התא למאגר זרימה של 300 מיקרוליטר.
  10. העבירו את התאים לצינורות זרימה של 1.5 מ"ל. שמור בחושך וקרח.
  11. נתח על ציטומטר הזרימה (ראה טבלת חומרים). אותות זוהו עבור Anti NDUFB10-Alexa 405 באמצעות מסנן פס פס 450/50, TFAM-Alexa 488 באמצעות מסנן פס פס 530/30, VDAC 1-Alexa 647 באמצעות מסנן פס פס 670/14 וצבע L/D במסנן פס פס 780/60 (איור 3B).

10. רכישה וניתוח של ציטומטריית זרימה

  1. השתמש בדגימות לא מוכתמות ומוכתמות בודדות של אורגנואיד הבקרה כדי להגדיר את המתח של הגדרות הציטומטר.
  2. השתמש בשפופרת הבקרה הלא מוכתמת כדי להגדיר את עלילות הפיזור של אזור הפיזור הקדמי (FSC-A) ואזור הפיזור הצדדי (SSC-A) בהתבסס על הגודל והגרעיניות של אוכלוסיית התאים (איור 4A).
  3. הוצא פסולת כדי לבחור תאים חיים מחלקות FSC-A ו-SSC-A. שער החוצה מכפיל באמצעות גובה פיזור צד (SSC-H) לעומת תרשים SSC-A (איור 4B).
  4. בחר את התאים החיים על סמך צביעת צבע L/D על ידי מעבר ל-APC-cy7 לעומת תרשים FSC-A (איור 4C).
  5. באמצעות הדגימות הלא מוכתמות של כל קו, צייר שער מעל האוכלוסייה העיקרית של האירועים ב-FSC-A לעומת עלילות תעלות פלואורוכרום (FITC, APC, BV 421).
  6. ההגדרה מפצה על ציטומטר הזרימה15.
  7. השתמש בבקרת איזוטיפ לבקרה שלילית כדי לצפות בכתמי רקע.
  8. ביצוע איסוף נתונים.
    1. בחר את התאים החיים על סמך צביעת צבע L/D על ידי מעבר ל-APC-cy7 לעומת תרשים FSC-A (איור 4C).
    2. השתמש במה שלא מוכתם כשליטה שלילית. לאחר מכן, תוך כדי בחינת ה-FSC-A לעומת עלילות תעלות פלואורוכרום (FITC, APC, BV 421), מקימות שער מעל האוכלוסייה העיקרית של אירועי תא בודד (איור 4D-F).
  9. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים).
    1. שכפל את מיקומי השערים על דגימות התאים המוכתמים. תעד את מספר התאים המציגים צביעה חיובית.
    2. עבור כל אוכלוסייה ממוקדת, הערך את עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של ערוצים שונים (FITC, APC, BV 421) המשורטטים על ציר ה-x של היסטוגרמה כדי לזהות את האות המיטוכונדריאלי. ניתן לקבוע ערכים ספציפיים עבור תת-היחידה המורכבת I NDUFB10 ו-TFAM על ידי חלוקת ה-MFI של הביטוי המרוכב או TFAM במחוון המסה המיטוכונדריאלי, VDAC 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 מספק ייצוג דיאגרמטי של תהליך ההתמיינות והאסטרטגיות המשמשות לניתוח זרימה ציטומטרית. iPSCs אנושיים תורבבו בצלחות של 96 בארות שאינן נצמדות ליצירת EBs ולאחר מכן הועברו לצלחות 6 בארות שאינן דבקות כדי להשיג אורגנואידים קליפת המוח שגדלו במלואם. ההרכב התאי של ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מוצג פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במוח בקליפת המוח מ-iPSCs אנושיים ולביצוע ניתוח זרימה ציטומטרי של פרמטרים מיטוכונדריאלים בתאים בודדים שבודדו מהאורגנואידים הללו. ההרכב התאי של האורגנואידים אומת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית עם צביעה אימונוהיסטוכימית לסמני תאי עצב וגליה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מביעים את תודתנו הכנה לגארת' ג'ון סאליבן מהמכון למדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטת אוסלו, נורבגיה, על שסיפק לנו בנדיבות את קו התאים AG05836 (RRID:CVCL_2B58). אנו מודים באדיבות למרכז ההדמיה המולקולרית, מתקן הליבה של ציטומטריית זרימה באוניברסיטת ברגן בנורבגיה. עבודה זו נתמכה על ידי המימון הבא: K.L נתמכה בחלקה על ידי אוניברסיטת ברגן Meltzers Høyskolefonds (מספר פרויקט: 103517133) ו-Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat (מספר פרויקט: 103816102). L.A.B נתמכה על ידי מועצת המחקר הנורווגית (מספר פרויקט: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ו-Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies using in flow cytometry
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405NOVUS biologicalsNBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647Santa cruz technologysc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488Abcamab198308
L/D fixable near-IR dead cell stain kitLife technologiesL10119
Antibodies using in immunofluorence staining
anti-Tuj1Abcamab78078
anti-SOX2 Abcamab97959
anti-Alexa Flour 488Thermo Fisher ScientificA28175
anti-Alexa Flour 594Thermo Fisher ScientificA-21442
Commercial cells
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)Provided by Gareth John Sullivan from the Institute of Basic Medical Sciences at the University of Oslo, Norway
Essential 8 Medium (iPSC culture medium)
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher ScientificA1516901
Essential 8 Supplement (50x) 2% (v/v)Thermo Fisher ScientificA1517101
Store at 4 °C and warm up to RT before use.
Instruments
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
Orbital shakers - SSM1, SSL1Stuart Equipment, UK
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
50 mL falcon tubeSigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences, USA
Flowjo Sampler AnalysisFlowJo LLC, USA
10 mL pipetteSigma-AldrichSIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL pipetteSigma-Aldrich
40 µm Cell starinerSigma-AldrichCLS431750
ultra-low attachment 96-well plateS-BIOMS-9096UZ
Countess II automated cell counterThermo Fisher Scientific
Neural differentiation medium  (NDM+)
DMEM/F12Life technologies11330032
Neurobasal mediumLife technologies2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)Life technologies35050
N2 supplement 0.5% (v/v)Life technologies17502-048
B27 supplement 1% (v/v)Life technologies17504-044
β-Mercaptoethanol 50 µMSigma-aldrichM3148
BDNF 20 ng/mLPeprotech450-02
Ascorbic acid 200 µMSigma-Aldrich A92902
Store at 4° C for upto 2 weeks
Neural differentiation medium minus viatmin A (NDM-)
DMEM/F12Life technologies11330032
Neurobasal mediumLife technologies2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)Life technologies35050
N2 supplement 0.5% (v/v)Life technologies17502-048
B27 supplement W/O vit. A 1% (v/v)Life technologies12587010
β-Mercaptoethanol 50 µMSigma-aldrichM3148
Store at 4° C for upto 8 days
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12Life technologies11330032
Knockout serum replacement 15% (v/v)Life technologies10828028
Glutamax supplement 1% (v/v)Life technologies35050
β-Mercaptoethanol 100 µMSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 nMStemgent/Reprocell04-0074
SB431542 10 µMTocris1614
XAV939 2 µMSigma-AldrichX3004
Store at 4° C for upto 10 days
Neutralisation medium
IMDMLife technologies21980032
FBS 10%Sigma-Aldrich12103C
Other reagents
DPBS (Ca2+/Mg2+ free)Thermo Fisher Scientific14190250
Bovine Serum AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000
AccutaseLife technologiesA11105-01
GeltrexLife technologiesA1413302
EDTALife technologies15575038
Advanced DMEM / F12Life technologies12634010
Neural tissue dissociation kitMiltenyi biotec130-092-628
Y-27632 dihydrochloride Rock InhibitorBiotechne Tocris1254
Fluoromount-G™ Mounting MediumSouthernBiotech0100-20
PFAThermo Fisher Scientific28908

References

  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  3. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).
  4. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  5. Trifunovic, A., Larsson, N. G. Mitochondrial dysfunction as a cause of ageing. Journal of Internal Medicine. 263 (2), 167-178 (2008).
  6. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  7. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  10. Xu, L., et al. Abnormal mitochondria in Down syndrome iPSC-derived GABAergic interneurons and organoids. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1868 (6), 166388(2022).
  11. Liu, C., et al. Mitochondrial HSF1 triggers mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Huntington's disease. EMBO Molecular Medicine. 14 (7), e15851(2022).
  12. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  13. Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives. The Journal of Visualized Experiments. 177, e63116(2021).
  14. Strober, W. Trypan Blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  15. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. Chapter 1 (Unit 1), 14(2002).
  16. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome Biology. 6 (1), 204(2005).
  17. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  18. Xiang, Y., et al. Generation and fusion of human cortical and medial ganglionic eminence brain organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 47 (1), e61(2018).
  19. Pevny, L., Placzek, M. SOX genes and neural progenitor identity. Current Opinion in Neurobiology. 15 (1), 7-13 (2005).
  20. Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cytoskeleton and Cell Motility. 17 (2), 118-132 (1990).
  21. Rosebrock, D., et al. Enhanced cortical neural stem cell identity through short SMAD and WNT inhibition in human cerebral organoids facilitates emergence of outer radial glial cells. Nature Cell Biology. 24 (6), 981-995 (2022).
  22. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  23. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  24. Yan, Y., Zhang, S. C. Generation of cerebral cortical neurons from human pluripotent stem cells in 3D culture. Methods in Molecular Biology. 2683, 1-11 (2023).
  25. Pamies, D., et al. Human IPSC 3D brain model as a tool to study chemical-induced dopaminergic neuronal toxicity. Neurobiology of Disease. 169, 105719(2022).
  26. Pamies, D., Hartung, T., Hogberg, H. T. Biological and medical applications of a brain-on-a-chip. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J. : Online). 239 (9), 1096-1107 (2014).
  27. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  28. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IPSCMtDNANADH B10AVDAC 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved