Applicazione dell'analisi citofluorimetrica per la misurazione di parametri mitocondriali multipli in organoidi cerebrali 3D

Riepilogo

Questo protocollo riporta un metodo unico di utilizzo di un citometro a flusso e di più anticorpi per la valutazione simultanea di più parametri funzionali mitocondriali, tra cui le variazioni del volume mitocondriale, la quantità delle subunità del complesso della catena respiratoria mitocondriale (MRC) e la replicazione del DNA mitocondriale (mtDNA).

Abstract

La disfunzione mitocondriale è un fattore primario o secondario comune a molti tipi di neurodegenerazione e le variazioni della massa mitocondriale, dei complessi della catena respiratoria mitocondriale (MRC) e del numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) sono spesso presenti in questi processi. Gli organoidi cerebrali umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) umane ricapitolano la disposizione citoarchitettonica tridimensionale (3D) del cervello e offrono la possibilità di studiare i meccanismi della malattia e di esaminare nuove terapie in un sistema umano complesso. Qui, riportiamo un approccio unico basato sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in organoidi corticali derivati da iPSC. Questo rapporto descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali corticali da iPSC, la dissociazione a singola cellula degli organoidi generati, la fissazione, la colorazione e la successiva analisi citofluorimetrica per valutare più parametri mitocondriali. La doppia colorazione con anticorpi contro la subunità del complesso MRC NADH: subunità B10 dell'ubichinone ossidoreduttasi (NDUFB10) o fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM) insieme al canale 1 anio-selettivo voltaggio-dipendente (VDAC 1) consente di valutare la quantità di queste proteine per mitocondrio. Poiché la quantità di TFAM corrisponde alla quantità di mtDNA, fornisce una stima indiretta del numero di copie di mtDNA per contenuto mitocondriale. L'intera procedura può essere completata nell'arco di 2-3 ore. Fondamentalmente, consente la quantificazione simultanea di più parametri mitocondriali, inclusi i livelli totali e specifici relativi alla massa mitocondriale.

Introduzione

I mitocondri sono organelli cellulari essenziali e il sito principale della produzione di adenosina trifosfato (ATP). Oltre a fornire energia alle cellule, i mitocondri partecipano anche a molteplici processi cellulari, tra cui la trasmissione di informazioni cellulari, la differenziazione cellulare e l'apoptosi, e hanno la capacità di regolare la crescita cellulare e il ciclo cellulare. Cambiamenti nella funzione mitocondriale sono stati identificati in varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD)^1,2, il morbo di Alzheimer (AD)³ e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)⁴. La disfunzione mitocondriale svolge un ruolo nel processo di invecchiamento, accumulando mutazioni somatiche del mtDNA e declinando la funzione della catena respiratoria⁵.

Nella neurodegenerazione si verificano vari tipi di disfunzione mitocondriale e la capacità di misurare tali cambiamenti è estremamente utile quando si studiano i meccanismi della malattia e si testano potenziali trattamenti. Inoltre, la creazione di adeguati sistemi modello in vitro che ricapitolano la malattia nelle cellule cerebrali umane è fondamentale per comprendere meglio i meccanismi della malattia e sviluppare nuove terapie. Le iPSC di pazienti con malattie neurodegenerative sono state utilizzate per generare diverse cellule cerebrali che manifestano danni mitocondriali 6,7,8,9. Lo sviluppo di organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC è un passo importante nella modellazione delle malattie. Questi organoidi cerebrali derivati da iPSC forniscono complessità e contengono il background genetico del paziente, fornendo così un modello di malattia che riflette più accuratamente la patologia nel cervello del paziente.

Sebbene siano state condotte alcune ricerche su studi mitocondriali utilizzando organoidi cerebrali derivati da iPSC 10,11,12, le tecniche convenienti e affidabili per determinare più parametri funzionali mitocondriali in organoidi cerebrali derivati da iPSC rimangono limitate. La citometria a flusso fornisce un potente strumento per misurare i parametri mitocondriali a livello di singola cellula, come abbiamo dimostrato in precedenza¹³. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi corticali da iPSC, combinato con un nuovo approccio basato sulla citometria a flusso per misurare simultaneamente più parametri mitocondriali, tra cui la massa mitocondriale, le subunità del complesso della catena respiratoria e il numero di copie del mtDNA (Figura 1). È importante sottolineare che, utilizzando la massa mitocondriale come denominatore, questi protocolli consentono di misurare sia i livelli totali che quelli specifici per unità mitocondriale.

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Protocollo

1. Differenziazione delle iPSC in organoidi corticali

1. Preparazione di lastre rivestite a matrice
   1. Scongelare la fiala della matrice della membrana basale disponibile in commercio su ghiaccio durante la notte. Diluire in 1:100 a freddo Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 (concentrazione finale 1%). Fare aliquote e conservarle a -20 °C (vedi Tabella dei materiali).
   2. Scongelare la soluzione della matrice di membrana a 4 °C (mantenerla fredda) e rivestire il numero richiesto di pozzetti (1 mL per un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Incubare a 37 °C per 1 ora.
   3. Prendete la piastra dall'incubatrice e lasciatela raggiungere la temperatura ambiente (RT) (lasciatela per un'ora).
      NOTA: Le piastre possono essere conservate per un massimo di 2 settimane in frigorifero (ricordarsi di estrarle e riscaldare i pozzetti rivestiti necessari per quel giorno a RT fino a quando non sono più freddi al tatto prima dell'uso). Si consiglia di utilizzare le piastre entro 3 giorni. Per una conservazione prolungata, aggiungere 1 mL di Essential 8 Medium (vedere la Tabella dei materiali) alla piastra rivestita per evitare che il gel si secchi.

2. Terreno di preparazione Essential 8 (E8) per coltura iPSC

1. In un ambiente sterile, preparare E8 Medium combinando E8 basal medium con l'integratore E8 (vedi Tabella dei materiali). Questo può essere conservato a 4 °C per 2 settimane.
   NOTA: Scongelare l'integratore di E8 congelato a 4 °C per una notte prima di preparare il terreno completo. Si sconsiglia lo scongelamento dell'integratore congelato a 37 °C; utilizzare E8 Medium per 2 settimane. Prima dell'uso, scaldare l'E8 Medium necessario per quel giorno a RT fino a quando non è più freddo al tatto.

3. Subcoltura di iPSC

1. Preriscaldare le piastre rivestite a matrice in RT o incubatore a 37 °C per 20-30 min. Preriscaldare la quantità di E8 Medium necessaria a RT.
2. Aspirare il terreno di coltura con una pipetta.
3. Sciacquare le iPSC (vedere la Tabella dei materiali) con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (Ca²⁺/Mg²⁺ libero) (DPBS-/-) (4 mL per un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
4. Aggiungere acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,5 mM) (1 mL per un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Incubare a 37 °C fino a quando i bordi delle colonie iniziano a staccarsi dalla piastra (di solito 3-5 minuti).
5. Aspirare la soluzione di dissociazione.
6. Aggiungere il terreno E8 preriscaldato (4 ml per un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e utilizzare l'alta pressione per staccare le colonie di iPSC.
7. Trasferire in due pozzetti diversi in una piastra a 6 pozzetti rivestita di matrice (2 mL per un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e incubare a 37 °C.
   NOTA: Agitare delicatamente prima di inserire la piastra nell'incubatrice. Il rapporto di divisione può essere 1:2-1:4.
8. Scambia i media ogni giorno fino a quando le colonie ottengono l'80% di confluenza con buone dimensioni e connessioni.
   NOTA: Monitorare la presenza di colonie di dimensioni adeguate, tipicamente caratterizzate da una forma circolare ben definita e da un diametro che varia da 0,5 a 1 mm. Le colonie dovrebbero presentare strutture dense e compatte con bordi lisci e chiaramente delineati.

4. Formazione del corpo embrioide (EB) e induzione neurale

1. Preparare il mezzo di induzione neurale (NIM) combinando i componenti elencati nella Tabella dei materiali.
2. Aspirare il terreno e sciacquare le cellule con DPBS -/- (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
3. Aggiungere l'Accutasi preriscaldata (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) (vedere la Tabella dei materiali) nel pozzetto e incubare a 37 °C per 10 minuti.
4. Pipettare delicatamente la soluzione su e giù per 3 o 4 volte utilizzando un puntale per pipetta da 1000 μl.
5. Neutralizzare con 2 mL di DMEM con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e centrifugare la provetta conica da 15 mL contenente le cellule a 600 x g per 5 min a RT. Aspirare il surnatante.
6. Risospendere i pellet di cella pipettandoli delicatamente su e giù fino a pallet a cella singola.
7. Contare e calcolare la concentrazione di cellule vive utilizzando il tripano blu¹⁴ in un contatore di cellule automatizzato.
8. Calcolare il rapporto di diluizione e diluire le cellule in NIM per ottenere una concentrazione finale di 60.000 cellule vive/mL.
9. Aggiungere l'inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK) Y-27632 (concentrazione finale 50 μM) (vedere la Tabella dei materiali) alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente.
10. Aggiungere 150 μl di sospensione a cellula singola in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti a bassissimo attacco (vedere la Tabella dei materiali) e collocarla nell'incubatore. Imposta come Giorno 0.
11. Il giorno 1, controllare le cellule e le forme di EB in ogni pozzetto.
    NOTA: Valutare il successo della formazione di EB in base al loro aspetto luminoso, sferico e traslucido al microscopio, alla loro capacità di rimanere liberi di fluttuare e separarsi e all'assenza di cellule morte, che appaiono come macchie scure.
12. Il giorno 2, rimuovere con cura 75 μL di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 150 μL di NIM insieme a 50 μM di Y-27632 in ciascun pozzetto.
13. Nei giorni 4, 6 e 8, rimuovere 100 μL di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 150 μL di NIM a ciascun pozzetto.

5. Generazione di organoidi corticali

1. Preparare il mezzo di differenziazione neurale meno la vitamina A (NDM-) combinando i componenti elencati nella Tabella dei materiali.
2. Il giorno 10, trasferire gli EB dalla piastra a 96 pozzetti con attacco ultrabasso alla piastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso utilizzando una pipetta da 5 mL. Trasferire con cautela otto EB in ciascun pozzo (Figura 2). Aggiungere 5 mL di NDM- a ciascun pozzetto.
3. Posizionare la piastra sull'agitatore orbitale all'interno dell'incubatrice e iniziare a girare a 80 giri/min.
4. Nei giorni 12, 14 e 16, sostituire l'NDM- con 4 mL dopo aver aspirato 3 mL di terreno vecchio.

6. Maturazione e coltura a lungo termine di organoidi corticali

1. Preparare il terreno di differenziazione neurale con vitamina A (NDM+) e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF). Per i dettagli, vedere Tabella dei materiali.
2. Il giorno 18, rimuovere il terreno da 3 mL e aggiungere 4 mL di NDM+.
3. Rimetti il piatto alla coltura rotante.
4. Somministrare ogni 4 giorni e mantenere gli organoidi corticali differenziati in NDM+ fino all'uso. Per l'analisi a valle sono stati utilizzati organoidi corticali di 25-40 giorni.
   NOTA: Gli organoidi corticali possono essere mantenuti più a lungo (fino a 3-4 mesi); Ma la vitalità cellulare sarà ridotta a causa della mancanza di scambio nutrizionale.

7. Caratterizzazione cellulare mediante immunocitochimica e colorazione in immunofluorescenza

1. Utilizzare una pipetta da 1000 μl per raccogliere delicatamente l'organoide dal terreno e posizionarlo delicatamente su un terreno con un terreno minimo su un vetrino da microscopio standard.
2. Lasciare asciugare completamente a RT. Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) (300 μl per campione) per 30 minuti. Rimuovere il PFA e poi risciacquare due volte con PBS.
   NOTA: Il PFA è tossico e si sospetta che sia cancerogeno. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi e maneggiare sotto una cappa chimica.
3. Aggiungere una soluzione di saccarosio al 30% (300 μl per campione) ai vetrini e incubare per una notte a 4 °C.
4. Bloccare e permeabilizzare gli organoidi con tampone bloccante (BB) (300 μL per campione) contenente PBS (con Ca²⁺/Mg²⁺), 0,3% di Triton X-100 e 10% di siero di capra normale per 2 ore a RT (o durante la notte a 4 °C). Delineare gli organoidi con una penna barriera idrofobica per mantenere il tampone sul vetrino.
5. Sovrapporre i campioni con l'anticorpo primario nel tampone bloccante (300 μL per campione), l'anti-SRY (regione Y) che determina il sesso-box 2 (SOX2, 1:100) e il marcatore antineurale tuberina beta III (Tuj1, 1:1000) e incubare per una notte a 4 °C al buio (vedere la Tabella dei materiali).
6. Lavare in PBS per 3 ore con due o tre cambi di tampone su una leggera piattaforma a dondolo.
7. Incubare con anticorpo secondario (300 μl per campione), farina anti-Alexa 488 (1:800) e farina anti-Alexa 594 (1:800), per una notte a 4 °C in una camera oscura umidificata. Aggiungere contemporaneamente il colorante nucleare Hoechst 33342 (1:5000) (vedi Tabella dei materiali).
8. Aspirare l'anticorpo e risciacquare rapidamente con PBS, quindi aggiungere PBS contenente lo 0,01% di NaAzide per 1-2 giorni a 4 °C per prevenire la contaminazione.
9. Aspirare il PBS e rimuovere la soluzione in eccesso. Montare gli organoidi con il mezzo di montaggio (vedi Tabella dei materiali), quindi aggiungere un vetrino coprioggetti. Evitare la formazione di bolle d'aria e posizionare in una camera buia a RT per almeno 12 h per consentire alla montatura di polimerizzare completamente.
   NOTA: Il campione è ora pronto per essere immaginato al microscopio a fluorescenza.

8. Dissociazione di organoidi corticali

1. Aggiungere 30 mL di DPBS -/- in una provetta da centrifuga da 50 mL.
2. Raccogliere delicatamente gli organoidi cerebrali nella provetta utilizzando una pipetta da 10 ml. Almeno 3 organoidi vengono utilizzati per una colorazione e dovrebbero avere più di 25 giorni ma meno di 40 giorni.
3. Sedimentare gli organoidi per circa 5 min. Non centrifugare.
4. Aspirare DPBS e aggiungere 2 mL di Accutase preriscaldato nella provetta. Incubare il campione in bagnomaria per 5 minuti a 37 °C.
5. Triturare delicatamente 15 volte utilizzando un puntale per pipetta da 1000 μl senza generare bolle. Incubare il campione per altri 5 minuti a 37 °C a bagnomaria.
6. Dissociare delicatamente utilizzando puntali per pipette da 1000 μl 15 volte senza generare bolle (Figura 3A).
   NOTA: Se sono ancora presenti alcune cellule non dissociate, trasferire le cellule non dissociate in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL e quindi incubare per altri 5 minuti a bagnomaria a 37 °C. Quindi dissociare delicatamente utilizzando 20 puntali per pipette da 1000 μl per 20 volte.
7. Neutralizzare con 4 mL di DMEM con il 10% di FBS e centrifugare la provetta conica da 15 mL contenente le cellule a 600 x g per 5 minuti a RT.
8. Aspirare il surnatante e risospendere con 200 μl di DPBS utilizzando puntali per pipette da 1000 μl 10 volte senza generare bolle.
9. Aggiungere 200 μl di DPBS per ottenere un volume totale di 400 μl di sospensioni cellulari in DPBS.
10. Filtrare con il filtro o il tubo del filtro (utilizzare filtri da 35 o 40 μm e sciacquare il filtro con DPBS prima di utilizzare il filtro).
11. Separare metà della soluzione in una provetta e utilizzarla come campione non colorato.

9. Misura in citometria a flusso di subunità del complesso MRC e TFAM in cellule fissate

1. Aggiungere colorante vivo e morto (L/D) (1: 1000) (vedere la Tabella dei materiali) (con rosso lontano o vicino infrarosso, a seconda della configurazione dei marcatori per la citometria a flusso).
   NOTA: Se si apre una nuova fiala per il colorante L/D, aggiungere 50 μl di DMSO per ricostituirsi e fare un'aliquota da 10 μl per conservarli a -20 °C.
2. Mantenere in RT e buio per 30 min. Aggiungere 40 mL di DPBS -/-. Centrifugare a 600 x g per 5 min.
3. Risospendere in sospensione a cellula singola dopo aver scartato il surnatante.
4. Fissare e permeabilizzare le cellule con 1 mL di metanolo ghiacciato al 90% a -20 °C per 20 minuti.
5. Bloccare i campioni in un tampone a blocchi da 1 mL contenente 0,3 M di glicina, 5% di siero di capra e 1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS (con Ca²⁺/Mg²⁺).
6. Lavare con 20 mL di tampone di flusso contenente PBS (con Ca²⁺/Mg²⁺) con BSA allo 0,2% una o due volte.
7. Aggiungere gli anticorpi primari anti-NDUFB10 coniugati con Alexa Fluor 405 (1:100), anti-VDAC 1 coniugato con Alexa Fluor PE (1:100) e anticorpi anti-TFAM coniugati con Alexa Fluor 488 (1:200) per 30 minuti (vedere la Tabella dei materiali).
8. Lavare con 20 mL di tampone di flusso.
9. Aspirare e lasciare circa 100 μl e ricostituire i pellet cellulari in un tampone di flusso da 300 μl.
10. Trasferire le cellule in provette di flusso da 1,5 mL. Tenete al buio e sul ghiaccio.
11. Analizzare sul citometro a flusso (vedere la tabella dei materiali). I segnali sono stati rilevati per Anti NDUFB10-Alexa 405 utilizzando un filtro passa-banda 450/50, TFAM-Alexa 488 utilizzando un filtro passa-banda 530/30, VDAC 1-Alexa 647 utilizzando un filtro passa-banda 670/14 e colorante L/D nel filtro passa-banda 780/60 (Figura 3B).

10. Acquisizione e analisi della citometria a flusso

1. Utilizzare campioni non colorati e colorati singolarmente dell'organoide di controllo per impostare la tensione delle impostazioni del citometro.
2. Utilizzare il tubo di controllo non colorato per impostare i grafici di dispersione dell'area di dispersione diretta (FSC-A) e dell'area di dispersione laterale (SSC-A) in base alle dimensioni e alla granularità della popolazione cellulare (Figura 4A).
3. Elimina i detriti per selezionare le cellule vive dai grafici FSC-A e SSC-A. Doppietti Gate out utilizzando l'altezza di dispersione laterale (SSC-H) vs. Grafico SSC-A (Figura 4B).
4. Selezionare le cellule vive in base alla colorazione del colorante L/D passando a APC-cy7 vs. Grafico FSC-A (Figura 4C).
5. Utilizzando i campioni non colorati di ogni linea, disegna un cancello sopra la popolazione principale degli eventi in FSC-A vs. grafici dei canali fluorocromatici (FITC, APC, BV 421).
6. L'impostazione compensa il citometro a flusso¹⁵.
7. Utilizzare il controllo isotipo per il controllo negativo per osservare la colorazione di fondo.
8. Eseguire l'acquisizione dei dati.
   1. Selezionare le cellule vive in base alla colorazione del colorante L/D passando a APC-cy7 vs. il grafico FSC-A (Figura 4C).
   2. Utilizza il non macchiato come controllo negativo. Quindi, durante l'esame dell'FSC-A rispetto all'accordo i canali del fluorocromo (FITC, APC, BV 421) stabiliscono un gate sopra la popolazione principale di eventi a singola cellula (Figura 4D-F).
9. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software FlowJo (vedere la tabella dei materiali).
   1. Duplicare le posizioni dei cancelli sui campioni di cellule colorate. Documentare il numero di cellule che presentano una colorazione positiva.
   2. Per ciascuna popolazione target, valutare l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) di diversi canali (FITC, APC, BV 421) tracciati sull'asse x di un istogramma per identificare il segnale mitocondriale. I valori specifici per la subunità del complesso I NDUFB10 e TFAM possono essere determinati dividendo l'MFI dell'espressione complessa o TFAM per l'indicatore di massa mitocondriale, VDAC 1.

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Risultati

La Figura 1 fornisce una rappresentazione schematica del processo di differenziamento e delle strategie utilizzate per l'analisi citofluorimetrica. Le iPSC umane sono state coltivate in piastre a 96 pozzetti non aderenti per formare EB e poi trasferite in piastre a 6 pozzetti non aderenti per ottenere organoidi corticali completamente cresciuti. La composizione cellulare degli organoidi è stata convalidata utilizzando la microscopia confocale dopo immunocol...

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Discussione

Viene presentato un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali corticali da iPSC umane e per l'esecuzione dell'analisi citofluorimetrica dei parametri mitocondriali in singole cellule isolate da questi organoidi. La composizione cellulare degli organoidi è stata verificata mediante microscopia confocale con colorazione immunoistochimica per marcatori cellulari neuronali e gliali. È stato dimostrato che la strategia di co-colorazione basata sulla citometria a flusso con anti-N...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies using in flow cytometry
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS biologicals	NBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa cruz technology	sc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
L/D fixable near-IR dead cell stain kit	Life technologies	L10119
Antibodies using in immunofluorence staining
anti-Tuj1	Abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
anti-Alexa Flour 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
anti-Alexa Flour 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
Commercial cells
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)			Provided by Gareth John Sullivan from the Institute of Basic Medical Sciences at the University of Oslo, Norway
Essential 8 Medium (iPSC culture medium)
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8 Supplement (50x) 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific	A1517101
Store at 4 °C and warm up to RT before use.
Instruments
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
Orbital shakers - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, UK
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
50 mL falcon tube	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, USA
Flowjo Sampler Analysis	FlowJo LLC, USA
10 mL pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL pipette	Sigma-Aldrich
40 µm Cell stariner	Sigma-Aldrich	CLS431750
ultra-low attachment 96-well plate	S-BIO	MS-9096UZ
Countess II automated cell counter	Thermo Fisher Scientific
Neural differentiation medium  (NDM+)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement 1% (v/v)	Life technologies	17504-044
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
Ascorbic acid 200 µM	Sigma-Aldrich	A92902
Store at 4° C for upto 2 weeks
Neural differentiation medium minus viatmin A (NDM-)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement W/O vit. A 1% (v/v)	Life technologies	12587010
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
Store at 4° C for upto 8 days
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Knockout serum replacement 15% (v/v)	Life technologies	10828028
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
β-Mercaptoethanol 100 µM	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µM	Tocris	1614
XAV939 2 µM	Sigma-Aldrich	X3004
Store at 4° C for upto 10 days
Neutralisation medium
IMDM	Life technologies	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
Other reagents
DPBS (Ca2+/Mg2+ free)	Thermo Fisher Scientific	14190250
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000
Accutase	Life technologies	A11105-01
Geltrex	Life technologies	A1413302
EDTA	Life technologies	15575038
Advanced DMEM / F12	Life technologies	12634010
Neural tissue dissociation kit	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 dihydrochloride Rock Inhibitor	Biotechne Tocris	1254
Fluoromount-G™ Mounting Medium	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908