3D Brain Organoids에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하기 위한 유세포 분석 응용

요약

이 프로토콜은 미토콘드리아 부피의 변화, 미토콘드리아 호흡 사슬(MRC) 복합 소단위의 양 및 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 복제를 포함한 여러 미토콘드리아 기능 매개변수를 동시에 평가하기 위해 스트리밍 세포분석기와 여러 항체를 사용하는 고유한 방법을 보고합니다.

초록

미토콘드리아 기능 장애는 많은 유형의 신경 퇴행에 대한 일반적인 1차 또는 2차 원인이며, 미토콘드리아 질량, 미토콘드리아 호흡 사슬(MRC) 복합체 및 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 복제 수의 변화가 이러한 과정에서 자주 나타납니다. 인간 유도 만능 줄기세포(iPSC)에서 유래한 인간 뇌 오가노이드는 뇌의 3차원(3D) 세포구조학적 배열을 재현하고 복잡한 인간 시스템에서 질병 메커니즘을 연구하고 새로운 치료법을 스크리닝할 수 있는 가능성을 제공합니다. 여기에서는 iPSC 유래 피질 오가노이드에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하기 위한 고유한 유세포 분석 기반 접근 방식을 보고합니다. 이 보고서는 iPSC에서 피질 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜, 생성된 오가노이드의 단일 세포 해리, 고정, 염색 및 후속 유세포 분석을 통해 여러 미토콘드리아 매개변수를 평가하기 위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. MRC 복합체 소단위 NADH에 대한 항체를 사용한 이중 염색: 유비퀴논 산화환원효소 소단위 B10(NDUFB10) 또는 미토콘드리아 전사 인자 A(TFAM)와 전압 의존성 음이온 선택적 채널 1(VDAC 1)을 함께 사용하면 미토콘드리아당 이러한 단백질의 양을 평가할 수 있습니다. TFAM의 양은 mtDNA의 양에 해당하기 때문에 미토콘드리아 함량당 mtDNA 복제 수를 간접적으로 추정할 수 있습니다. 이 전체 절차는 2-3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 결정적으로, 이는 미토콘드리아 질량에 대한 총 및 특정 수준을 모두 포함하는 여러 미토콘드리아 매개변수의 동시 정량화를 허용합니다.

서문

미토콘드리아는 필수 세포 소기관이며 아데노신 삼인산(ATP) 생산의 주요 부위입니다. 미토콘드리아는 세포에 에너지를 제공하는 것 외에도 세포 정보 전달, 세포 분화, 세포사멸을 포함한 여러 세포 과정에 참여하며 세포 성장과 세포 주기를 조절하는 능력을 가지고 있습니다. 파킨슨병(PD)^1,2, 알츠하이머병(AD)³, 근위축성 측삭 경화증(ALS)⁴을 포함한 다양한 신경퇴행성 질환에서 미토콘드리아 기능의 변화가 확인되었습니다. 미토콘드리아 기능 장애는 노화 과정에서 체세포 mtDNA 돌연변이를 축적하고 호흡 사슬 기능을 저하시키는 역할을 한다⁵.

신경 퇴행에서는 다양한 유형의 미토콘드리아 기능 장애가 발생하며, 이러한 변화를 측정하는 능력은 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적인 치료법을 테스트할 때 매우 유용합니다. 또한 인간 뇌 세포의 질병을 재현하는 적절한 체외 모델 시스템을 구축하는 것은 질병 메커니즘을 더 잘 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 필수적입니다. 신경퇴행성 질환 환자의 iPSC는 미토콘드리아 손상을 나타내는 다양한 뇌 세포를 생성하는 데 사용되었습니다 6,7,8,9. iPSC에서 유래한 3D 뇌 오가노이드의 개발은 질병 모델링의 중요한 단계입니다. 이러한 iPSC 유래 뇌 오가노이드는 복잡성을 제공하고 환자 자신의 유전적 배경을 포함하므로 환자 뇌의 병리학을 보다 정확하게 반영하는 질병 모델을 제공합니다.

iPSC 유래 뇌 오가노이드^10,11,12를 사용한 미토콘드리아 연구에 대한 일부 연구가 수행되었지만, iPSC 유래 뇌 오가노이드에서 다중 미토콘드리아 기능 매개변수를 결정하기 위한 편리하고 신뢰할 수 있는 기술은 여전히 제한적입니다. 유세포 분석은 이전에 입증한 바와 같이 단일 세포 수준에서 미토콘드리아 매개변수를 측정할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다¹³. 이 연구는 미토콘드리아 질량, 호흡 사슬 복합 소단위 및 mtDNA 복제 수를 포함한 여러 미토콘드리아 매개변수를 동시에 측정하기 위한 새로운 유세포 분석 기반 접근 방식과 결합하여 iPSC에서 피질 오가노이드를 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다(그림 1). 중요한 것은 미토콘드리아 질량을 분모로 사용함으로써 이러한 프로토콜을 통해 미토콘드리아 단위당 총 수준과 특정 수준을 모두 측정할 수 있다는 것입니다.

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프로토콜

1. iPSC를 피질 오가노이드로 분화

1. 매트릭스 코팅 플레이트의 준비
   1. 시중에서 판매되는 기저막 매트릭스의 바이알을 얼음 위에서 밤새 해동합니다. 차갑게 1:100으로 희석하여 Advanced Dulbecco의 Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12(최종 농도 1%). 부분 표본을 만들어 -20 °C에서 보관합니다( 재료 표 참조).
   2. 멤브레인 매트릭스 용액을 4°C에서 해동하고(차갑게 유지) 필요한 수의 웰(6웰 플레이트의 웰 1개당 1mL)을 코팅합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
   3. 인큐베이터에서 접시를 꺼내 실온(RT)에 도달하도록 합니다(한 시간 동안 그대로 두십시오).
      알림: 플레이트는 냉장고에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다(사용하기 전에 꺼내서 RT에서 그날 필요한 코팅된 웰을 만졌을 때 더 이상 식지 않을 때까지 따뜻하게 하는 것을 잊지 마십시오). 플레이트는 3일 이내에 사용하는 것이 좋습니다. 장기간 보관하는 경우, 코팅된 플레이트에 Essential 8 Medium( 재료 표 참조) 1mL를 첨가하여 겔이 마르는 것을 방지하십시오.

2. iPSC 배양을 위한 Preparation Essential 8 (E8) 배지

1. 멸균 환경에서 E8 기초 배지와 E8 보충제를 결합하여 E8 배지를 준비합니다( 재료 표 참조). 4°C에서 2주 동안 보관할 수 있습니다.
   알림: 완전한 배지를 준비하기 전에 냉동 E8 보충제를 4°C에서 밤새 해동합니다. 냉동 보충제를 37 ° C에서 해동하는 것은 권장되지 않습니다. E8 Medium을 2주 동안 사용합니다. 사용하기 전에 RT에서 만졌을 때 더 이상 차갑지 않을 때까지 그날 E8 Medium을 따뜻하게 해야 합니다.

3. iPSC의 외배양(Subculturing)

1. 매트릭스 코팅된 플레이트를 RT 또는 인큐베이터에서 37°C에서 20-30분 동안 예열합니다. RT에서 필요한 E8 Medium의 양을 예열합니다.
2. 피펫으로 배양 배지를 흡입합니다.
3. 둘베코의 인산염 완충 식염수(Ca²⁺/Mg²⁺ free)(DPBS-/-)(6웰 플레이트의 웰 1개당 4mL)로 iPSC(재료 표 참조)를 헹굽니다.
4. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(0.5mM)(6웰 플레이트에 1웰당 1mL)을 추가합니다. 군체의 가장자리가 플레이트에서 분리되기 시작할 때까지 37 ° C에서 배양하십시오 (보통 3-5 분).
5. 해리 솔루션을 흡인합니다.
6. 예열된 E8 Medium(6웰 플레이트의 웰 1개당 4mL)을 추가하고 고압을 사용하여 iPSC 콜로니를 분리합니다.
7. 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트(6웰 플레이트의 한 웰에 2mL)에 있는 두 개의 다른 웰로 옮기고 37°C에서 배양합니다.
   알림: 플레이트를 인큐베이터에 넣기 전에 부드럽게 흔듭니다. 분할 비율은 1:2-1:4일 수 있습니다.
8. 식민지가 좋은 크기와 연결로 80% 합류할 때까지 매일 미디어를 교환합니다.
   참고: 일반적으로 잘 정의된 원형 모양과 0.5에서 1mm 범위의 직경을 특징으로 하는 적절한 크기의 집락을 모니터링합니다. 군체는 명확하게 묘사되고 매끄러운 경계가 있는 조밀하고 조밀한 구조를 보여야 합니다.

4. 배아체(EB) 형성 및 신경 유도

1. 재료 표에 나열된 구성 요소를 결합하여 신경 유도 매체(NIM)를 준비합니다.
2. 배지를 흡입하고 DPBS -/-(6웰 플레이트의 웰당 4mL)로 세포를 헹굽니다.
3. 예열된 Accutase(6웰 플레이트의 웰당 1mL)( 재료 표 참조)를 웰에 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
4. 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 용액을 위아래로 3-4회 부드럽게 피펫팅합니다.
5. 10% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 2mL DMEM으로 중화하고 세포가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브를 600 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 흡인합니다.
6. 단일 세포 팔레트가 될 때까지 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.
7. 자동 세포 계수기에서 trypan blue¹⁴ 를 사용하여 살아있는 세포 농도를 계산하고 계산합니다.
8. 희석 비율을 계산하고 NIM에서 세포를 희석하여 최종 세포 농도를 60,000 live cells/mL로 만듭니다.
9. 세포 현탁액에 Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 (최종 농도 50 μM) ( 재료 표 참조)를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.
10. 150μL의 단일 세포 현탁액을 초저 부착 96웰 플레이트( 재료 표 참조)의 각 웰에 추가하고 인큐베이터에 넣습니다. Day 0으로 설정합니다.
11. 1일차에는 각 웰의 세포와 EB 형태를 확인합니다.
    참고: 현미경으로 볼 때 EB의 밝고, 구형이며, 반투명한 모습, 자유롭게 떠다니고 분리된 상태를 유지할 수 있는 능력, 검은 반점으로 나타나는 죽은 세포가 없는 것을 기준으로 성공적인 EB 형성을 평가합니다.
12. 2일차에 각 웰에서 75μL 배지를 조심스럽게 제거하고 각 웰에 50μM Y-27632와 함께 150μL NIM을 추가합니다.
13. 4일, 6일, 8일에 각 웰에서 100μL 배지를 제거하고 각 웰에 150μL NIM을 추가합니다.

5. 피질 오가노이드의 생성

1. 재료 표에 나열된 성분을 결합하여 신경 분화 배지에서 비타민 A(NDM-)를 뺀 성분을 준비합니다.
2. 10일차에 5mL 피펫을 사용하여 초저 부착 96웰 플레이트에서 초저 부착 6웰 플레이트로 EB를 옮깁니다. 8개의 EB를 각 유정으로 조심스럽게 옮깁니다(그림 2). 각 웰에 NDM-을 5mL 추가합니다.
3. 인큐베이터 내부의 오비탈 셰이커에 플레이트를 놓고 80rpm으로 회전을 시작합니다.
4. 12일, 14일, 16일에 3mL 오래된 배지를 흡입한 후 NDM-을 4mL로 교체합니다.

6. 피질 organoids의 성숙 그리고 장기 문화

1. 비타민 A(NDM+) 및 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)로 신경 분화 배지를 준비합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
2. 18일째에 3mL 배지를 제거하고 4mL NDM+를 추가합니다.
3. 접시를 회전 배양으로 되돌립니다.
4. 4일마다 먹이고 사용할 때까지 NDM+에서 분화된 피질 오가노이드를 유지하십시오. 다운스트림 분석을 위해 25-40일 된 피질 오가노이드를 사용했습니다.
   참고: 피질 오가노이드는 더 오래(최대 3-4개월) 유지될 수 있습니다. 그러나 영양 교환의 부족으로 인해 세포 생존력이 떨어질 것입니다.

7. immunocytochemistry와 immunofluorescence staining에 의하여 세포 특성화

1. 1000μL 피펫을 사용하여 배지에서 오가노이드를 부드럽게 채취하고 표준 현미경 슬라이드에서 최소한의 배지가 있는 배지에 부드럽게 놓습니다.
2. RT에서 완전히 건조시킵니다.4% 파라포름알데히드(PFA)(샘플당 300μL)를 30분 동안 추가합니다. PFA를 제거한 다음 PBS로 두 번 헹굽니다.
   참고: PFA는 독성이 있으며 발암성이 의심됩니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하고 화학 연기 후드 아래에서 취급하십시오.
3. 슬라이드에 30% 자당 용액(샘플당 300μL)을 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
4. PBS(Ca²⁺/Mg²⁺ 포함), 0.3% Triton X-100 및 10% 일반 염소 혈청을 함유한 차단 완충액(BB)(샘플당 300μL)으로 오가노이드를 RT에서 2시간 동안(또는 4°C에서 하룻밤) 차단 및 투과화합니다. 슬라이드에 버퍼를 유지하기 위해 소수성 장벽 펜으로 오가노이드의 윤곽을 그립니다.
5. 차단 완충액(샘플당 300μL), anti-SRY(성 결정 영역 Y)-box 2(SOX2, 1:100) 및 항신경 마커 tuberin beta III(Tuj1, 1:1000)의 1차 항체와 함께 샘플을 오버레이하고 어두운 곳에서 4°C에서 밤새 배양합니다( 재료 표 참조).
6. PBS에서 3시간 동안 세척하고 부드러운 흔들림 플랫폼에서 2-3번의 완충액을 교체하십시오.
7. 2차 항체(샘플당 300μL), anti-Alexa Flour 488(1:800) 및 anti-Alexa Flour 594(1:800)로 4°C에서 하룻밤 동안 가습된 암실에서 배양합니다. Hoechst 33342 (1:5000) 핵 염색을 동시에 추가합니다( 재료 표 참조).
8. 항체를 흡인하고 PBS로 빠르게 헹군 다음 0.01% NaAzide가 함유된 PBS를 4°C에서 1-2일 동안 첨가하여 오염을 방지합니다.
9. PBS를 흡입하고 과도한 용액을 제거합니다. 장착 매체로 오가노이드를 장착한 다음( 재료 표 참조) 커버슬립을 추가합니다. 기포가 형성되는 것을 피하고 마운팅이 완전히 중합될 수 있도록 최소 12시간 동안 RT의 어두운 방에 두십시오.
   참고: 이제 샘플은 형광 현미경으로 상상할 준비가 되었습니다.

8. 피질 오가노이드의 해리

1. 50mL 원심분리 튜브에 30mL DPBS -/-를 추가합니다.
2. 10mL 피펫을 사용하여 튜브의 뇌 오가노이드를 부드럽게 수집합니다. 한 번의 염색에는 최소 3개의 오가노이드가 사용되며, 25일 이상 40일 미만이어야 합니다.
3. 약 5분 동안 오가노이드를 침전합니다. 원심분리하지 마십시오.
4. DPBS를 흡입하고 튜브에 예열된 Accutase 2mL를 추가합니다. 샘플을 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다.
5. 기포가 생성되지 않도록 1000μL 피펫 팁을 사용하여 15회 부드럽게 분쇄합니다. 수조에서 37°C에서 5분 더 샘플을 배양합니다.
6. 기포 생성 없이 1000μL 피펫 팁을 15회 사용하여 부드럽게 해리됩니다(그림 3A).
   참고: 여전히 해리되지 않은 세포가 있는 경우 해리되지 않은 세포를 새로운 50mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음 37°C 수조에서 5분 더 배양합니다. 그런 다음 1000μL 피펫 팁을 20회 사용하여 부드럽게 해리합니다.
7. 10% FBS가 포함된 4mL DMEM으로 중화하고 600 x g 에서 세포가 포함된 15mL 코니컬 튜브를 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.
8. 기포 생성 없이 1000μL 피펫 팁을 사용하여 상층액을 흡입하고 200μL DPBS로 재현탁합니다.
9. 200μL DPBS를 추가하여 DPBS에서 총 400μL 세포 현탁액을 만듭니다.
10. 필터 또는 필터 튜브로 필터링합니다(필터를 사용하기 전에 35 또는 40μm 필터를 사용하고 DPBS로 필터를 헹굽니다).
11. 튜브에서 용액의 절반을 분리하여 염색되지 않은 샘플로 사용합니다.

9. 고정 세포에서 MRC complex subunit 및 TFAM의 유세포 분석 측정

1. Live and Dead(L/D) 염색 염료(1:1000)( 재료 표 참조)를 추가합니다(유세포 분석을 위한 마커 설정에 따라 Far Red 또는 Near-infrared를 사용).
   참고: L/D 염료용 새 바이알을 개봉한 경우 50μL DMSO를 추가하여 재구성하고 10μL 분취량을 만들어 -20°C에서 보관합니다.
2. RT를 유지하고 30분 동안 어둡게 유지합니다. 40mL DPBS -/-를 추가합니다. 600 x g 에서 5분 동안 원심분리기
3. 상층액을 버린 후 single-cell suspension으로 재현탁합니다.
4. -20°C에서 20분 동안 1mL의 얼음처럼 차가운 90% 메탄올로 세포를 고정하고 투과화합니다.
5. PBS(Ca²⁺/Mg²⁺ 포함)에서 0.3M 글리신, 5% 염소 혈청 및 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 1mL 블록 버퍼에서 샘플을 차단합니다.
6. PBS(Ca²⁺/Mg²⁺ 포함)가 포함된 20mL 플로우 버퍼와 0.2% BSA를 1회 또는 2회 세척합니다.
7. Alexa Fluor 405(1:100)로 접합된 1차 항체 항NDUFB10, Alexa Fluor PE와 접합된 anti-VDAC 1(1:100) 및 Alexa Fluor 488(1:200)과 결합된 anti-TFAM 항체를 30분 동안 추가합니다( 재료 표 참조).
8. 20mL 플로우 버퍼로 세척합니다.
9. 흡입하고 약 100μL를 남겨두고 세포 펠릿을 300μL 흐름 완충액으로 재구성합니다.
10. 세포를 1.5mL 유관으로 옮깁니다. 어둠과 얼음 속에 보관하십시오.
11. 유세포 분석기에서 분석합니다( 재료 표 참조). 450/50 대역통과 필터를 사용하는 Anti NDUFB10-Alexa 405, 530/30 대역통과 필터를 사용하는 TFAM-Alexa 488, 670/14 대역통과 필터를 사용하는 VDAC 1-Alexa 647 및 780/60 대역통과 필터의 L/D 염료에 대한 신호가 감지되었습니다(그림 3B).

10. 유세포 분석 수집 및 분석

1. 대조군 오가노이드의 염색되지 않은 단일 염색 샘플을 사용하여 세포 분석기 설정의 전압을 설정합니다.
2. 염색되지 않은 대조 튜브를 사용하여 세포 집단의 크기와 입도에 따라 전방 산란 영역(FSC-A) 및 측면 산란 영역(SSC-A) 산란 플롯을 설정합니다(그림 4A).
3. FSC-A 및 SSC-A 플롯에서 살아있는 세포를 선택하기 위해 파편을 게이트아웃합니다. 측면 산란 높이(SSC-H)를 사용하는 게이트 아웃 이중항 vs. SSC-A 플롯(그림 4B).
4. APC-cy7 vs. FSC-A 플롯(그림 4C).
5. 각 라인의 염색되지 않은 샘플을 사용하여 FSC-A vs. 형광 채널 (FITC, APC, BV 421) 플롯.
6. 유세포분석기¹⁵를 보상하는 설정.
7. 음성 대조군에 isotype control을 사용하여 배경 염색을 관찰합니다.
8. 데이터 수집을 수행합니다.
   1. APC-cy7 vs. FSC-A 플롯(그림 4C).
   2. 얼룩지지 않은 것을 음성 대조군으로 활용하십시오. 그런 다음 FSC-A 대. 형광 색소 채널(FITC, APC, BV 421) 플롯은 단일 세포 이벤트의 주요 개체군 위에 게이트를 설정합니다(그림 4D-F).
9. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다( 표 참조).
   1. 염색된 세포 샘플에 게이트의 위치를 복제합니다. 양성 염색을 보이는 세포의 수를 문서화합니다.
   2. 각 표적 모집단에 대해 히스토그램의 x축에 표시된 서로 다른 채널(FITC, APC, BV 421)의 중앙값 형광 강도(MFI)를 평가하여 미토콘드리아 신호를 식별합니다. 복합체 I 소단위 NDUFB10 및 TFAM에 대한 특정 값은 복합체 발현 또는 TFAM의 MFI를 미토콘드리아 질량 지표 VDAC 1로 나누어 결정할 수 있습니다.

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결과

그림 1은 차별화 프로세스와 유세포 분석에 사용되는 전략을 다이어그램으로 표시한 것입니다. 인간 iPSC를 비접착성 96웰 플레이트에서 배양하여 EB를 형성한 다음 비접착성 6웰 플레이트로 옮겨 완전히 성장한 피질 오가노이드를 얻었습니다. 오가노이드의 세포 조성은 neuronal¹⁶ 및 glial markers¹⁷로 면역염색한 후 컨?...

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토론

인간 iPSC에서 피질 뇌 오가노이드를 생성하고 이러한 오가노이드에서 분리된 단일 세포에서 미토콘드리아 매개변수의 유세포 분석을 수행하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 오가노이드의 세포 구성은 신경 세포 및 신경교세포 마커에 대한 면역조직화학적 염색을 사용한 컨포칼 현미경으로 검증되었습니다. anti-NDUFB10, VDAC 1 및 TFAM과 함께 염색하는 유세포 분석 기반 전략...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies using in flow cytometry
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS biologicals	NBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa cruz technology	sc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
L/D fixable near-IR dead cell stain kit	Life technologies	L10119
Antibodies using in immunofluorence staining
anti-Tuj1	Abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
anti-Alexa Flour 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
anti-Alexa Flour 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
Commercial cells
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)			Provided by Gareth John Sullivan from the Institute of Basic Medical Sciences at the University of Oslo, Norway
Essential 8 Medium (iPSC culture medium)
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8 Supplement (50x) 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific	A1517101
Store at 4 °C and warm up to RT before use.
Instruments
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
Orbital shakers - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, UK
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
50 mL falcon tube	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, USA
Flowjo Sampler Analysis	FlowJo LLC, USA
10 mL pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL pipette	Sigma-Aldrich
40 µm Cell stariner	Sigma-Aldrich	CLS431750
ultra-low attachment 96-well plate	S-BIO	MS-9096UZ
Countess II automated cell counter	Thermo Fisher Scientific
Neural differentiation medium  (NDM+)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement 1% (v/v)	Life technologies	17504-044
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
Ascorbic acid 200 µM	Sigma-Aldrich	A92902
Store at 4° C for upto 2 weeks
Neural differentiation medium minus viatmin A (NDM-)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement W/O vit. A 1% (v/v)	Life technologies	12587010
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
Store at 4° C for upto 8 days
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Knockout serum replacement 15% (v/v)	Life technologies	10828028
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
β-Mercaptoethanol 100 µM	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µM	Tocris	1614
XAV939 2 µM	Sigma-Aldrich	X3004
Store at 4° C for upto 10 days
Neutralisation medium
IMDM	Life technologies	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
Other reagents
DPBS (Ca2+/Mg2+ free)	Thermo Fisher Scientific	14190250
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000
Accutase	Life technologies	A11105-01
Geltrex	Life technologies	A1413302
EDTA	Life technologies	15575038
Advanced DMEM / F12	Life technologies	12634010
Neural tissue dissociation kit	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 dihydrochloride Rock Inhibitor	Biotechne Tocris	1254
Fluoromount-G™ Mounting Medium	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908