3D脳オルガノイドにおける複数のミトコンドリアパラメータ測定のためのフローサイトメトリー解析の応用

要約

このプロトコルは、ミトコンドリア体積の変化、ミトコンドリア呼吸鎖(MRC)複合サブユニットの量、ミトコンドリアDNA(mtDNA)複製など、複数のミトコンドリア機能パラメータを同時に評価するために、ストリーミングサイトメーターと複数の抗体を使用する独自の方法を報告しています。

要約

ミトコンドリア機能障害は、多くの種類の神経変性に共通して一次的または二次的に寄与しており、ミトコンドリア質量、ミトコンドリア呼吸鎖(MRC)複合体、およびミトコンドリアDNA(mtDNA)コピー数の変化は、これらのプロセスでしばしば特徴づけられます。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するヒト脳オルガノイドは、脳の3次元(3D)細胞構造配列を再現し、複雑なヒトシステムにおける疾患メカニズムの研究や新しい治療法のスクリーニングの可能性を提供します。ここでは、iPS細胞由来皮質オルガノイドの複数のミトコンドリアパラメータを測定するための、フローサイトメトリーに基づく独自のアプローチについて報告します。このレポートでは、iPS細胞から皮質脳オルガノイドを作製するためのプロトコル、生成されたオルガノイドの単一細胞解離、固定、染色、およびその後のフローサイトメトリー解析により、複数のミトコンドリアパラメータを評価するための手順について詳しく説明します。MRC複合体サブユニットNADHに対する抗体であるユビキノン酸化還元酵素サブユニットB10(NDUFB10)またはミトコンドリア転写因子A(TFAM)と電位依存性陰イオン選択的チャネル1(VDAC 1)を併用することで、ミトコンドリアあたりのこれらのタンパク質の量を評価できます。TFAMの量はmtDNAの量に対応するため、ミトコンドリア含有量あたりのmtDNAコピー数を間接的に推定できます。この手順全体は、2〜3時間以内に完了できます。重要なのは、ミトコンドリア質量に対する合計レベルと特定のレベルの両方を含む、複数のミトコンドリアパラメータの同時定量化を可能にすることです。

概要

ミトコンドリアは必須の細胞小器官であり、アデノシン三リン酸(ATP)産生の主要な部位です。ミトコンドリアは、細胞にエネルギーを供給するだけでなく、細胞情報の伝達、細胞分化、アポトーシスなど、複数の細胞プロセスにも関与し、細胞の成長と細胞周期を調節する能力を持っています。ミトコンドリア機能の変化は、パーキンソン病(PD)^1,2、アルツハイマー病(AD)³、筋萎縮性側索硬化症(ALS)⁴など、さまざまな神経変性疾患で確認されています。ミトコンドリアの機能障害は、老化プロセスに関与し、体細胞mtDNA変異を蓄積し、呼吸鎖機能を低下させます⁵。

神経変性ではさまざまな種類のミトコンドリア機能障害が発生しますが、このような変化を測定する能力は、疾患のメカニズムを研究し、潜在的な治療法を検討する際に非常に役立ちます。さらに、ヒトの脳細胞における疾患を再現する適切なin vitroモデルシステムを確立することは、疾患のメカニズムをより深く理解し、新しい治療法を開発するために不可欠です。神経変性疾患患者由来のiPS細胞は、ミトコンドリア損傷を発現する多様な脳細胞を生成するために使用されてきました6,7,8,9。iPS細胞に由来する3D脳オルガノイドの開発は、疾患モデリングにおける大きな一歩です。これらのiPS細胞由来の脳オルガノイドは、複雑性を提供し、患者自身の遺伝的背景を含んでいるため、患者の脳内の病理をより正確に反映する疾患モデルを提供します。

iPS細胞由来脳オルガノイド10,11,12を用いたミトコンドリア研究に関する研究はいくつか行われていますが、iPS細胞由来脳オルガノイドにおける複数のミトコンドリア機能パラメータを決定するための便利で信頼性の高い技術は依然として限られています。フローサイトメトリーは、以前に実証したように、ミトコンドリアのパラメータをシングルセルレベルで測定するための強力なツールを提供します¹³。この研究では、iPS細胞から皮質オルガノイドを作製するための詳細なプロトコルと、ミトコンドリア質量、呼吸鎖複合体サブユニット、mtDNAコピー数などの複数のミトコンドリアパラメータを同時に測定するための新しいフローサイトメトリーベースのアプローチを提供します(図1)。重要なことは、ミトコンドリア質量を分母として使用することにより、これらのプロトコルにより、ミトコンドリア単位あたりの合計レベルと特定のレベルの両方を測定できることです。

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プロトコル

1. iPS細胞の皮質オルガノイドへの分化

1. マトリックスコーティングプレートの調製
   1. 市販の基底膜マトリックスのバイアルを氷上で一晩解凍します。冷たいAdvanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12(1%最終濃度)で1:100に希釈します。アリコートを作成し、-20°Cで保存します( 材料の表を参照)。
   2. メンブレンマトリックス溶液を4°Cで解凍し(冷たく保ちます)、必要な数のウェルをコーティングします(6ウェルプレートの1ウェルに1mL)。37°Cで1時間インキュベートします。
   3. インキュベーターからプレートを取り出し、室温(RT)に到達させます(1時間放置します)。
      注:プレートは冷蔵庫で最大2週間保存できます(使用前に取り出して、その日に必要なコーティングされたウェルをRTで温めることを忘れないでください)。プレートは3日以内に使用することをお勧めします。長期間保存する場合は、コーティングされたプレートに1 mLのエッセンシャル8メディウム( 材料の表を参照)を加えて、ゲルの乾燥を防ぎます。

2. iPS細胞培養用のEssential 8(E8)培地の調製

1. 無菌環境で、E8基礎培地とE8サプリメントを組み合わせてE8培地を調製します( 資料の表を参照)。これは4°Cで2週間保存できます。
   注:冷凍E8サプリメントを4°Cで一晩解凍してから、完全な培地を調製してください。冷凍サプリメントを37°Cで解凍することはお勧めしません。E8 Mediumを2週間使用します。使用する前に、触ると冷たくなくなるまで、RTでその日に必要なE8ミディアムを温めてください。

3. iPS細胞の継代培養

1. マトリックスコーティングプレートをRTまたはインキュベーターで37°Cで20〜30分間温めます。RTで必要な量のE8Mediumを事前に温めます。
2. ピペットで培地を吸引します。
3. iPSC(材料表を参照)をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(Ca²⁺/Mg²⁺ free)(DPBS-/-)(6ウェルプレートの1ウェルに4 mL)ですすぎます(材料表を参照)。
4. エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(0.5 mM)(6ウェルプレートの1ウェルに1 mL)を加えます。コロニーの端がプレートから剥がれ始めるまで(通常は3〜5分)、37°Cでインキュベートします。
5. 解離液を吸引します。
6. 予め加温したE8培地(6ウェルプレートのウェル1個につき4 mL)を加え、高圧でiPS細胞コロニーを分離します。
7. マトリックスコーティングされた6ウェルプレート(6ウェルプレートの1ウェルに2 mL)で2つの異なるウェルに移し、37°Cでインキュベートします。
   注:プレートをインキュベーターに入れる前に、軽く振ってください。分割比は1:2-1:4にすることができます。
8. コロニーが適切なサイズと接続で80%の合流点を得るまで、毎日メディアを交換します。
   注:適切なサイズのコロニーを監視し、通常は明確に定義された円形の形状と0.5〜1mmの範囲の直径によって特徴付けられます。コロニーは、明確に描かれた滑らかな境界を持つ、密集したコンパクトな構造を示す必要があります。

4. 胚様体(EB)形成と神経誘導

1. 神経誘導媒体(NIM)は、 材料表に記載されている成分を組み合わせて調製します。
2. 培地を吸引し、細胞をDPBS -/-(6ウェルプレート中のウェルあたり4 mL)ですすいでください。
3. 予熱したアキュターゼ(6ウェルプレートに1ウェルあたり1 mL)( 材料表を参照)をウェルに加え、37°Cで10分間インキュベートします。
4. 1000 μLのピペットチップを使用して、溶液を3〜4回静かに上下させます。
5. 10%ウシ胎児血清(FBS)を含む2mLのDMEMで中和し、細胞を含む15mLのコニカルチューブを600 x g でRTで5分間遠心分離します。
6. シングルセルパレットまで静かにピペッティングして、セルペレットを再懸濁します。
7. 自動セルカウンターでトリパン^ブルー14 を使用して生細胞濃度をカウントし、計算します。
8. 希釈比を計算し、NIMで細胞を希釈して、最終細胞濃度を60,000生細胞/mLにします。
9. Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632(最終濃度50μM)( 材料表参照)を細胞懸濁液に添加し、穏やかに混合します。
10. 150 μLのシングルセル懸濁液を超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに加え( 材料表を参照)、インキュベーターに入れます。Day 0 として設定します。
11. 1日目に、各ウェルの細胞とEBフォームを確認します。
    注:顕微鏡下での明るく、球状で、半透明の外観、自由浮遊して分離したままでいる能力、およびダークスポットとして現れる死細胞がないことに基づいて、成功したEB形成を評価します。
12. 2日目に、各ウェルから75 μLの培地を慎重に取り出し、150 μL NIMと50 μM Y-27632を各ウェルに加えます。
13. 4日目、6日目、8日目に、各ウェルから100 μLの培地を取り出し、各ウェルに150 μLのNIMを加えます。

5. 皮質オルガノイドの生成

1. ビタミンAを除いた神経分化培地(NDM-)を、 材料表に記載されている成分を組み合わせて調製します。
2. 10日目に、5mLピペットを使用して、超低アタッチメント96ウェルプレートから超低アタッチメント6ウェルプレートにEBを移します。8 つの EB を各ウェルに慎重に移します (図 2)。各ウェルに5 mLのNDM-を加えます。
3. プレートをインキュベーター内のオービタルシェーカーに置き、80rpmで回転を開始します。
4. 12日目、14日目、16日目に、3 mLの古い培地を吸引した後、NDM-を4 mLと交換します。

6. 皮質オルガノイドの成熟と長期培養

1. ビタミンA(NDM+)と脳由来神経栄養因子(BDNF)を用いた神経分化培地を調製します。詳細については 、資料の表を参照してください。
2. 18日目に、3 mLの培地を取り出し、4 mLのNDM +を追加します。.
3. プレートを紡績培養に戻します。
4. 4日ごとに栄養を与え、分化した皮質オルガノイドをNDM+で使用するまで維持します。25-40日齢の皮質オルガノイドをダウンストリーム解析に使用しました。
   注:皮質オルガノイドはより長く(最大3〜4か月)維持できます。しかし、栄養交換が不足しているため、細胞の生存率は低下します。

7. 免疫細胞化学および免疫蛍光染色による細胞特性評価

1. 1000 μLのピペットを使用して、培地からオルガノイドを静かに収集し、標準的な顕微鏡スライド上の最小限の培地で培地に静かに置きます。
2. 室温で完全に乾燥させ、4%パラホルムアルデヒド(PFA)(サンプルあたり300μL)を30分間加えます。PFAを除去し、PBSで2回すすいでください。
   注:PFAは毒性があり、発がん性が疑われています。皮膚や目との接触を避け、化学薬品のヒュームフードの下で取り扱ってください。
3. 30%ショ糖溶液(サンプルあたり300 μL)をスライドに加え、4°Cで一晩インキュベートします。
4. PBS(Ca²⁺/Mg²⁺)、0.3% Triton X-100、および10%正常ヤギ血清を含むブロッキングバッファー(BB)(サンプルあたり300 μL)でオルガノイドをブロッキングおよび透過処理します。室温で2時間(または4°Cで一晩)。オルガノイドの輪郭を疎水性バリアペンで描き、バッファーをスライド上に保持します。
5. ブロッキングバッファー(サンプルあたり300 μL)、抗SRY(性決定領域Y)-ボックス2(SOX2、1:100)、および抗神経マーカーであるツベリンβIII(Tuj1、1:1000)に一次抗体とサンプルを重ね合わせ、暗所で4°Cで一晩インキュベートします( 材料表を参照)。
6. 穏やかなロッキングプラットフォームで2〜3回のバッファー交換を行いながら、PBSで3時間洗浄します。
7. 二次抗体(サンプルあたり300 μL)、抗Alexa Flour 488(1:800)、および抗Alexa Flour 594(1:800)と、加湿した暗室で4°Cで一晩インキュベートします。Hoechst 33342 (1:5000) 核染色剤を同時に追加します ( 材料の表を参照)。
8. 抗体を吸引し、PBSで素早くすすぎ、0.01%NaAzideを含むPBSを4°Cで1〜2日間添加して、コンタミネーションを防ぎます。
9. PBSを吸引し、余分な溶液を取り除きます。オルガノイドを封入剤( 材料の表を参照)でマウントし、カバースリップを追加します。気泡の形成を避け、RTの暗い部屋に少なくとも12時間置いて、取り付けが完全に重合するのを待ちます。
   注:これで、サンプルを蛍光顕微鏡で想像する準備が整いました。

8. 皮質オルガノイドの解離

1. 50 mLの遠心分離チューブに30 mLのDPBS -/-を加えます。
2. 10 mLピペットを使用して、脳オルガノイドをチューブ内に静かに集めます。1回の染色に少なくとも3つのオルガノイドを使用し、25日以上40日未満である必要があります。
3. 沈殿物オルガノイドを約5分間。遠心分離しないでください。
4. DPBSを吸引し、2 mLの予熱したAccutaseをチューブに加えます。サンプルをウォーターバスで37°Cの5分間インキュベートします。
5. 1000 μLのピペットチップを使用して、気泡を発生させずに15回穏やかに回転させます。サンプルを水浴中で37°Cでさらに5分間インキュベートします。
6. 1000 μLのピペットチップを15回使用して、気泡を発生させずに穏やかに解離します(図3A)。
   注:まだ未解離細胞がある場合は、未解離細胞を新しい50 mL遠心チューブに移し、37°Cウォーターバスでさらに5分間インキュベートします。その後、1000 μLのピペットチップを20回使用して、穏やかに解離します。
7. 10% FBSを含む4 mL DMEMで中和し、細胞を含む15 mLコニカルチューブを600 x g で室温で5分間遠心分離します。
8. 上清を吸引し、1000 μL ピペットチップを使用して 200 μL DPBS で気泡を発生させずに 10 回再懸濁します。
9. 200 μL の DPBS を添加して、DPBS 中の細胞懸濁液の総量を 400 μL にします。
10. フィルターまたはフィルターチューブでろ過します(35または40μmのフィルターを使用し、フィルターを使用する前にDPBSでフィルターをすすいでください)。
11. 溶液の半分をチューブ内で分離し、未染色のサンプルとして使用します。

9. 固定細胞におけるMRC複合体サブユニットおよびTFAMのフローサイトメトリー測定

1. Live and Dead (L/D) 染色色素 (1: 1000) ( 材料表を参照) を添加します (フローサイトメトリーのマーカーの設定に応じて、遠赤または近赤外のいずれかを使用します)。
   注:L/D色素用の新しいバイアルを開封した場合は、50 μL DMSOを添加して再構成し、10 μLのアリコートを作成して-20°Cで保存します。
2. 室温と暗所で30分間保管します。40mLのDPBSを加えます-/-。600 x g で5分間遠心分離します。
3. 上清を廃棄した後、単一細胞懸濁液に再懸濁します。
4. 細胞を氷冷した90%メタノール1 mLで-20°Cで20分間固定し、透過処理します。
5. 0.3 Mグリシン、5%ヤギ血清、および1%ウシ血清アルブミン(BSA)をPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)に含有する1 mLブロックバッファーでサンプルをブロッキングします。
6. PBSを含む20 mLのフローバッファー(Ca²⁺/Mg²⁺)で0.2% BSAを1回または2回洗浄します。
7. Alexa Fluor 405と結合した抗NDUFB10抗体(1:100)、Alexa Fluor PEと結合した抗VDAC 1抗体(1:100)、およびAlexa Fluor 488と結合した抗TFAM抗体(1:200)を30分間添加します( 材料表を参照)。
8. 20 mLのフローバッファーで洗浄します。
9. 吸引して約100 μLを残し、細胞ペレットを300 μLのフローバッファーに再構成します。
10. 細胞を1.5mLのフローチューブに移します。暗くて氷の中に置いてください。
11. フローサイトメーターで解析します( 材料の表を参照)。450/50バンドパスフィルターを使用したAnti NDUFB10-Alexa 405、530/30バンドパスフィルターを使用したTFAM-Alexa 488、670/14バンドパスフィルターを使用したVDAC 1-Alexa 647、780/60バンドパスフィルターのL/D色素の信号が検出されました(図3B)。

10. フローサイトメトリーの取得と解析

1. コントロールオルガノイドの未染色サンプルおよび単一染色サンプルを使用して、サイトメーター設定の電圧を設定します。
2. 未染色のコントロールチューブを使用して、細胞集団のサイズと粒度に基づいて前方散乱領域(FSC-A)と側方散乱領域(SSC-A)の散布図を設定します(図4A)。
3. デブリをゲートアウトして、FSC-AおよびSSC-Aプロットから生細胞を選択します。サイドスキャッターハイト(SSC-H)を使用したダブレット のゲートアウトSSC-Aプロット(図4B)。
4. L/D色素の染色に基づいて生細胞を選択するには、APC-cy7 vs.FSC-Aプロット(図4C)。
5. 各線の未染色サンプルを使用して、FSC-A vs.蛍光色素チャネル(FITC、APC、BV 421)プロット。
6. フローサイト^{メーター15}の補正をセットアップ。
7. アイソタイプコントロールをネガティブコントロールに使用して、バックグラウンド染色を観察します。
8. データ集録を実行します。
   1. L/D色素の染色に基づいて生細胞を選択するには、APC-cy7 vs.FSC-Aプロット(図4C)。
   2. 染色されていないものをネガティブコントロールとして活用します。次に、FSC-Aとの比較を検討しながら。蛍光色素チャネル(FITC、APC、BV 421)をプロットし、単一細胞イベントの主要集団の上にゲートを確立します(図4D-F)。
9. FlowJoソフトウェアを使用してデータ解析を実行します( 「材料の表」を参照)。
   1. ゲートの位置を染色した細胞サンプルに複製します。陽性染色を示す細胞の数を記録します。
   2. ターゲット集団ごとに、ヒストグラムの x 軸にプロットされたさまざまなチャネル(FITC、APC、BV 421)の蛍光強度(MFI)の中央値を評価して、ミトコンドリアシグナルを特定します。複合体IサブユニットNDUFB10およびTFAMの特定の値は、複合体発現またはTFAMのMFIをミトコンドリア質量指標VDAC1で割ることによって決定できます。

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結果

図1は、分化プロセスとフローサイトメトリー分析に使用される戦略を図示したものです。ヒトiPS細胞を非接着性の96ウェルプレートで培養してEBを形成し、その後、非接着性の6ウェルプレートに移して完全に成長した皮質オルガノイドを得ました。オルガノイドの細胞組成は、ニューロン¹⁶ およびグリア^{マーカー...}

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ディスカッション

ヒトiPS細胞から皮質脳オルガノイドを作製し、これらのオルガノイドから単離された単一細胞のミトコンドリアパラメータのフローサイトメトリー解析を実施するためのプロトコールが提示されます。オルガノイドの細胞組成は、神経細胞およびグリア細胞マーカーの免疫組織化学的染色を伴う共焦点顕微鏡法によって検証されました。抗NDUFB10、VDAC 1、およびTFAMと?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies using in flow cytometry
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS biologicals	NBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa cruz technology	sc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
L/D fixable near-IR dead cell stain kit	Life technologies	L10119
Antibodies using in immunofluorence staining
anti-Tuj1	Abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
anti-Alexa Flour 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
anti-Alexa Flour 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
Commercial cells
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)			Provided by Gareth John Sullivan from the Institute of Basic Medical Sciences at the University of Oslo, Norway
Essential 8 Medium (iPSC culture medium)
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8 Supplement (50x) 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific	A1517101
Store at 4 °C and warm up to RT before use.
Instruments
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
Orbital shakers - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, UK
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
50 mL falcon tube	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, USA
Flowjo Sampler Analysis	FlowJo LLC, USA
10 mL pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL pipette	Sigma-Aldrich
40 µm Cell stariner	Sigma-Aldrich	CLS431750
ultra-low attachment 96-well plate	S-BIO	MS-9096UZ
Countess II automated cell counter	Thermo Fisher Scientific
Neural differentiation medium  (NDM+)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement 1% (v/v)	Life technologies	17504-044
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
Ascorbic acid 200 µM	Sigma-Aldrich	A92902
Store at 4° C for upto 2 weeks
Neural differentiation medium minus viatmin A (NDM-)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement W/O vit. A 1% (v/v)	Life technologies	12587010
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
Store at 4° C for upto 8 days
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Knockout serum replacement 15% (v/v)	Life technologies	10828028
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
β-Mercaptoethanol 100 µM	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µM	Tocris	1614
XAV939 2 µM	Sigma-Aldrich	X3004
Store at 4° C for upto 10 days
Neutralisation medium
IMDM	Life technologies	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
Other reagents
DPBS (Ca2+/Mg2+ free)	Thermo Fisher Scientific	14190250
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000
Accutase	Life technologies	A11105-01
Geltrex	Life technologies	A1413302
EDTA	Life technologies	15575038
Advanced DMEM / F12	Life technologies	12634010
Neural tissue dissociation kit	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 dihydrochloride Rock Inhibitor	Biotechne Tocris	1254
Fluoromount-G™ Mounting Medium	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908