JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, mitokondriyal hacimdeki değişiklikler, mitokondriyal solunum zinciri (MRC) kompleks alt birimlerinin miktarları ve mitokondriyal DNA (mtDNA) replikasyonu dahil olmak üzere çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametrelerin eşzamanlı değerlendirmesi için bir akış sitometresi ve çoklu antikorların kullanılması için benzersiz bir yöntem bildirir.

Özet

Mitokondriyal disfonksiyon, birçok nörodejenerasyon tipine ortak bir birincil veya ikincil katkıda bulunur ve mitokondriyal kütle, mitokondriyal solunum zinciri (MRC) kompleksleri ve mitokondriyal DNA (mtDNA) kopya sayısındaki değişiklikler sıklıkla bu süreçlerde yer alır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen insan beyni organoidleri, beynin üç boyutlu (3D) sitomimari düzenlemesini özetler ve karmaşık bir insan sisteminde hastalık mekanizmalarını inceleme ve yeni terapötikleri tarama imkanı sunar. Burada, iPSC'den türetilmiş kortikal organoidlerde çoklu mitokondriyal parametreleri ölçmek için benzersiz bir akış sitometrisi tabanlı yaklaşım bildiriyoruz. Bu rapor, iPSC'lerden kortikal beyin organoidleri üretmek, üretilen organoidlerin tek hücreli ayrışması, fiksasyon, boyama ve çoklu mitokondriyal parametreleri değerlendirmek için müteakip akış sitometrik analizi için bir protokolü detaylandırır. MRC kompleksi alt birimi NADH'ye karşı antikorlarla çift boyama: Ubikinon Oksidoredüktaz Alt Birimi B10 (NDUFB10) veya mitokondriyal transkripsiyon faktörü A (TFAM), voltaja bağlı anyon seçici kanal 1 (VDAC 1) ile birlikte mitokondri başına bu proteinlerin miktarının değerlendirilmesine izin verir. TFAM miktarı mtDNA miktarına karşılık geldiğinden, mitokondriyal içerik başına mtDNA kopyalarının sayısının dolaylı bir tahminini sağlar. Tüm bu prosedür 2-3 saat içinde tamamlanabilir. En önemlisi, mitokondriyal kütleye göre hem toplam hem de spesifik seviyeler dahil olmak üzere çoklu mitokondriyal parametrelerin eşzamanlı olarak ölçülmesine izin verir.

Giriş

Mitokondri, temel hücresel organellerdir ve adenozin trifosfat (ATP) üretiminin ana bölgesidir. Mitokondri, hücreler için enerji sağlamanın yanı sıra, hücre bilgi iletimi, hücre farklılaşması ve apoptoz dahil olmak üzere çoklu hücresel süreçlere katılır ve hücre büyümesini ve hücre döngüsünü düzenleme yeteneğine sahiptir. Parkinson hastalığı (PD)1,2, Alzheimer hastalığı (AD)3 ve amyotrofik lateral skleroz (ALS)4 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda mitokondriyal fonksiyondaki değişiklikler tanımlanmıştır. Mitokondriyal disfonksiyon yaşlanma sürecinde, somatik mtDNA mutasyonlarının birikmesinde ve solunum zinciri fonksiyonunun azalmasında rol oynar5.

Nörodejenerasyonda çeşitli mitokondriyal disfonksiyon türleri ortaya çıkar ve bu tür değişiklikleri ölçme yeteneği, hastalık mekanizmalarını incelerken ve potansiyel tedavileri test ederken son derece yararlıdır. Ayrıca, insan beyin hücrelerinde hastalığı özetleyen uygun in vitro model sistemlerin kurulması, hastalık mekanizmalarının daha iyi anlaşılması ve yeni tedavilerin geliştirilmesi için hayati önem taşımaktadır. Nörodejeneratif hastalıkları olan hastalardan alınan iPSC'ler, mitokondriyal hasarı gösteren çeşitli beyin hücreleri üretmek için kullanılmıştır 6,7,8,9. iPSC'lerden türetilen 3D beyin organoidlerinin geliştirilmesi, hastalık modellemesinde önemli bir adımdır. Bu iPSC'den türetilmiş beyin organoidleri karmaşıklık sağlar ve hastanın kendi genetik geçmişini içerir, böylece hastanın beynindeki patolojiyi daha doğru yansıtan bir hastalık modeli sağlar.

iPSC'den türetilmiş beyin organoidleri10,11,12 kullanılarak mitokondriyal çalışmalar üzerine bazı araştırmalar yapılmış olsa da, iPSC'den türetilmiş beyin organoidlerinde çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri belirlemek için uygun ve güvenilir teknikler sınırlı kalmaktadır. Akış sitometrisi, daha önce gösterdiğimiz gibi, tek hücre düzeyinde mitokondriyal parametreleri ölçmek için güçlü bir araç sağlar13. Bu çalışma, mitokondriyal kütle, solunum zinciri kompleksi alt birimleri ve mtDNA kopya sayısı dahil olmak üzere birden fazla mitokondriyal parametreyi aynı anda ölçmek için yeni bir akış sitometrisi tabanlı yaklaşımla birlikte iPSC'lerden kortikal organoidler üretmek için ayrıntılı bir protokol sağlar (Şekil 1). Daha da önemlisi, mitokondriyal kütleyi bir payda olarak kullanarak, bu protokoller mitokondriyal birim başına hem toplam hem de spesifik seviyelerin ölçülmesine izin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. iPSC'lerin kortikal organoidlere farklılaşması

  1. Matris kaplı plakaların hazırlanması
    1. Piyasada bulunan bazal membran matrisinin şişesini gece boyunca buz üzerinde çözdürün. Soğukta 1:100'e seyreltin Advanced Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 (%1 nihai konsantrasyon). Alikotlar yapın ve -20 °C'de saklayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
    2. Membran matris çözeltisini 4 ° C'de çözün (soğuk tutun) ve gerekli sayıda kuyucuk kaplayın (6 oyuklu bir plakada bir kuyucuk için 1 mL). 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    3. Plakayı inkübatörden alın ve oda sıcaklığına (RT) ulaşmasına izin verin (bir saat bekletin).
      NOT: Plakalar buzdolabında 2 haftaya kadar saklanabilir (kullanmadan önce çıkarılacak kadar soğuk olmayana kadar RT'de o gün için gerekli olan kaplanmış kuyuları çıkarmayı ve ısıtmayı unutmayın). Plakların 3 gün içerisinde kullanılması tavsiye edilir. Uzun süreli saklama için, jelin kurumasını önlemek için kaplanmış plakaya 1 mL Essential 8 Medium ( Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin.

2. iPSC kültürü için Hazırlık Temel 8 (E8) ortamı

  1. Steril bir ortamda, E8 bazal ortamını E8 takviyesi ile birleştirerek E8 Ortamını hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Bu, 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
    NOT: Dondurulmuş E8 takviyesini, tüm ortamı hazırlamadan önce gece boyunca 4 °C'de çözün. Dondurulmuş takviyenin 37 °C'de çözülmesi önerilmez; E8 Medium'u 2 hafta boyunca kullanın. Kullanmadan önce, o gün için gerekli olan E8 Medium'u RT'de artık dokunulamayacak kadar soğuk olana kadar ısıtın.

3. iPSC'lerin alt kültürlenmesi

  1. Matris kaplı plakaları RT veya inkübatörde 37 °C'de 20-30 dakika önceden ısıtın. RT'de ihtiyaç duyulan E8 Medium miktarını önceden ısıtın.
  2. Kültür ortamını bir pipetle aspire edin.
  3. iPSC'leri (Malzeme Tablosuna bakınız) Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (Ca2 + / Mg2 + ücretsiz) (DPBS-/-) (6 oyuklu bir plakada bir kuyucuk için 4 mL) ile durulayın.
  4. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (0.5 mM) (6 oyuklu bir plakada bir oyuk için 1 mL) ekleyin. Kolonilerin kenarları plakadan ayrılmaya başlayana kadar (genellikle 3-5 dakika) 37 °C'de inkübe edin.
  5. Ayrışma çözeltisini aspire edin.
  6. Önceden ısıtılmış E8 Medium (6 oyuklu bir plakada bir kuyucuk için 4 mL) ekleyin ve iPSC kolonilerini ayırmak için yüksek basınç kullanın.
  7. Matris kaplı 6 oyuklu bir plakada (6 oyuklu bir plakada bir kuyucuk için 2 mL) iki farklı kuyucuğa aktarın ve 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Plakayı inkübatöre koymadan önce hafifçe çalkalayın. Bölme oranı 1: 2-1: 4 olabilir.
  8. Koloniler iyi boyut ve bağlantılarla %80 birleşim elde edene kadar günlük olarak medya alışverişi yapın.
    NOT: Tipik olarak iyi tanımlanmış, dairesel bir şekil ve 0,5 ila 1 mm arasında değişen bir çap ile karakterize edilen uygun büyüklükteki kolonileri izleyin. Koloniler, açıkça tanımlanmış, pürüzsüz sınırları olan yoğun, kompakt yapılar sergilemelidir.

4. Embriyoid cisim (EB) oluşumu ve nöral indüksiyon

  1. Malzeme Tablosunda listelenen bileşenleri birleştirerek nöral indüksiyon ortamı (NIM) hazırlayın.
  2. Ortamı aspire edin ve hücreleri DPBS -/- (6 oyuklu bir plakada oyuk başına 4 mL) ile durulayın.
  3. Kuyucuğa önceden ısıtılmış Accutase (6 oyuklu bir plakada oyuk başına 1 mL) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
  4. 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak çözeltiyi 3 ila 4 kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
  5. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile 2 mL DMEM ile nötralize edin ve hücreleri içeren 15 mL konik tüpü RT'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
  6. Tek hücreli paletler oluşana kadar hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletlerini yeniden süspanse edin.
  7. Otomatik bir hücre sayacında tripan mavisi14 kullanarak canlı hücre konsantrasyonunu sayın ve hesaplayın.
  8. Seyreltme oranını hesaplayın ve 60.000 canlı hücre / mL'lik nihai hücre konsantrasyonu elde etmek için hücreleri NIM'de seyreltin.
  9. Hücre süspansiyonuna Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 (nihai konsantrasyon 50 μM) (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve yavaşça karıştırın.
  10. Ultra düşük bağlantılı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 150 μL tek hücreli süspansiyon ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve inkübatöre yerleştirin. Gün 0 olarak ayarlayın.
  11. 1. günde, her kuyucuktaki hücreleri ve EB formlarını kontrol edin.
    NOT: Başarılı EB oluşumunu, mikroskop altında parlak, küresel ve yarı saydam görünümlerine, serbest yüzer ve ayrı kalma yeteneklerine ve koyu lekeler olarak görünen ölü hücrelerin yokluğuna göre değerlendirin.
  12. 2. günde, her bir oyuktan 75 μL ortamı dikkatlice çıkarın ve her oyuğa 50 μM Y-27632 ile birlikte 150 μL NIM ekleyin.
  13. 4, 6 ve 8. günlerde, her oyuktan 100 μL besiyeri çıkarın ve her oyuğa 150 μL NIM ekleyin.

5. Kortikal organoidlerin oluşumu

  1. Malzeme Tablosunda listelenen bileşenleri birleştirerek nöral farklılaşma ortamı eksi A vitamini (NDM-) hazırlayın.
  2. 10. günde, EB'leri 5 mL'lik bir pipet kullanarak ultra düşük bağlantılı 96 oyuklu plakadan ultra düşük bağlantılı 6 oyuklu plakaya aktarın. Her kuyucuğa sekiz EB'yi dikkatli bir şekilde aktarın (Şekil 2). Her kuyucuğa 5 mL NDM- ekleyin.
  3. Plakayı inkübatörün içindeki orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve 80 rpm'de dönmeye başlayın.
  4. 12, 14 ve 16. günlerde, 3 mL eski ortamı aspire ettikten sonra NDM-'yi 4 mL ile değiştirin.

6. Kortikal organoidlerin olgunlaşması ve uzun süreli kültürü

  1. A vitamini (NDM +) ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ile nöral farklılaşma ortamı hazırlayın. Ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
  2. 18. günde, 3 mL ortamı çıkarın ve 4 mL NDM + ekleyin.
  3. Plakayı eğirme kültürüne geri koyun.
  4. Her 4 günde bir besleyin ve farklılaşmış kortikal organoidleri kullanana kadar NDM + 'da tutun. Downstream analizi için 25-40 günlük kortikal organoidler kullanıldı.
    NOT: Kortikal organoidler daha uzun süre korunabilir (3-4 aya kadar); Ancak beslenme alışverişi eksikliği nedeniyle hücre canlılığı düşecektir.

7. İmmünositokimya ve immünofloresan boyama ile hücre karakterizasyonu

  1. Organoidi ortamdan nazikçe toplamak için 1000 μL'lik bir pipet kullanın ve standart bir mikroskop lamı üzerinde minimum ortamlı bir ortama nazikçe yerleştirin.
  2. 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) (numune başına 300 μL) ekleyin. PFA'yı çıkarın ve ardından PBS ile iki kez durulayın.
    NOT: PFA toksiktir ve kanserojen olduğundan şüphelenilmektedir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının ve kimyasal bir davlumbaz altında tutun.
  3. Slaytlara %30 sükroz çözeltisi (numune başına 300 μL) ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  4. Organoidleri, RT'de 2 saat boyunca (veya gece boyunca 4 ° C'de) PBS (Ca2 + / Mg2 + ile),% 0.3 Triton X-100 ve% 10 normal keçi serumu içeren bloke edici tampon (BB) (numune başına 300 μL) ile bloke edin ve geçirgenleştirin. Tamponu slayt üzerinde tutmak için organoidleri hidrofobik bir bariyer kalemle ana hatlarıyla belirtin.
  5. Numuneleri bloke edici tamponda (numune başına 300 μL), anti-SRY (cinsiyet belirleyici bölge Y)-kutu 2'de (SOX2, 1:100) ve anti-nöral belirteç tüberin beta III'te (Tuj1, 1:1000) birincil antikor ile kaplayın ve gece boyunca karanlıkta 4 °C'de inkübe edin (bkz.
  6. Yumuşak bir sallanan platform üzerinde iki ila üç tampon değişikliği ile PBS'de 3 saat yıkayın.
  7. İkincil antikor (numune başına 300 μL), anti-Alexa Unu 488 (1:800) ve anti-Alexa Unu 594 (1:800) ile gece boyunca nemlendirilmiş bir karanlık odada 4 °C'de inkübe edin. Hoechst 33342 (1:5000) nükleer lekesini aynı anda ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
  8. Antikoru aspire edin ve PBS ile hızlı bir şekilde durulayın, ardından kontaminasyonu önlemek için 4 ° C'de 1-2 gün boyunca% 0.01 NaAzid içeren PBS ekleyin.
  9. PBS'yi aspire edin ve fazla çözeltiyi çıkarın. Organoidleri montaj ortamıyla monte edin ( Malzeme Tablosuna bakın), ardından bir lamel ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önleyin ve montajın tamamen polimerize olmasını sağlamak için en az 12 saat RT'de karanlık bir odaya koyun.
    NOT: Numune artık bir floresan mikroskobu altında hayal edilmeye hazırdır.

8. Kortikal organoidlerin ayrışması

  1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 30 mL DPBS -/- ekleyin.
  2. 10 mL'lik bir pipet kullanarak beyin organoidlerini tüpte nazikçe toplayın. Bir boyama için en az 3 organoid kullanılır ve bunlar 25 günden fazla ancak 40 günden az olmalıdır.
  3. Yaklaşık 5 dakika boyunca tortu organoidleri. Santrifüj yapmayın.
  4. DPBS'yi aspire edin ve tüpe 2 mL önceden ısıtılmış Accutase ekleyin. Numuneyi su banyosunda 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
  5. Kabarcık oluşturmadan 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak 15 kez hafifçe ezin. Numuneyi bir su banyosunda 37 °C'de 5 dakika daha inkübe edin.
  6. 1000 μL pipet uçları kullanılarak kabarcık oluşturmadan 15 kez nazikçe ayrışır (Şekil 3A).
    NOT: Hala ayrılmamış hücreler varsa, ayrışmamış hücreleri yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve ardından 37 ° C su banyosunda 5 dakika daha inkübe edin. Daha sonra 1000 μL pipet ucunu 20 kez kullanarak nazikçe ayrışın.
  7. % 10 FBS ile 4 mL DMEM ile nötralize edin ve hücreleri içeren 15 mL konik tüpü 600 x g'da RT'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı aspire edin ve kabarcık oluşturmadan 1000 μL pipet ucu kullanarak 10 kez 200 μL DPBS ile yeniden süspanse edin.
  9. DPBS'de toplam 400 μL hücre süspansiyonu hacmi yapmak için 200 μL DPBS ekleyin.
  10. Filtre veya filtre borusu ile filtreleyin (35 veya 40 μm filtreler kullanın ve filtreyi kullanmadan önce filtreyi DPBS ile durulayın).
  11. Çözeltinin yarısını bir tüpte ayırın ve lekelenmemiş numune olarak kullanın.

9. Sabit hücrelerde MRC kompleks alt birimlerinin ve TFAM'ın akış sitometrisi ölçümü

  1. Canlı ve Ölü (L/D) boyama boyası (1: 1000) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (akış sitometrisi belirteçlerinin kurulumuna bağlı olarak Uzak Kırmızı veya Yakın kızılötesi ile).
    NOT: L / D boya için yeni bir şişe açılırsa, sulandırmak için 50 μL DMSO ekleyin ve -20 ° C'de saklamak için 10 μL'lik bir alikot yapın.
  2. 30 dakika boyunca RT'de ve karanlıkta tutun. 40 mL DPBS -/- ekleyin. 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı attıktan sonra tek hücreli süspansiyona yeniden süspansiyon edin.
  4. Hücreleri 1 mL buz gibi %90 metanol ile -20 ° C'de 20 dakika sabitleyin ve geçirgen hale getirin.
  5. Numuneleri PBS'de (Ca2 + / Mg2 + ile) 0.3 M glisin,% 5 keçi serumu ve% 1 sığır serum albümini (BSA) içeren 1 mL blok tamponunda bloke edin.
  6. % 0.2 BSA ile PBS içeren 20 mL akış tamponu (Ca2 + / Mg2 + ile) ile bir veya iki kez yıkayın.
  7. Alexa Fluor 405 (1:100) ile konjuge anti-NDUFB10, Alexa Fluor PE (1:100) ile konjuge anti-VDAC 1 ve Alexa Fluor 488 (1:200) ile konjuge anti-TFAM antikoru 30 dakika boyunca ekleyin (bkz.
  8. 20 mL akış tamponu ile yıkayınız.
  9. Yaklaşık 100 μL'yi aspire edin ve bırakın ve hücre peletlerini 300 μL'lik akış tamponuna yeniden sulandırın.
  10. Hücreleri 1,5 mL akış tüplerine aktarın. Karanlıkta ve buzda tutun.
  11. Akış sitometresinde analiz edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Anti NDUFB10-Alexa 405 için sinyaller 450/50 bant geçiren filtre kullanılarak, TFAM-Alexa 488 530/30 bant geçiren filtre kullanılarak, VDAC 1-Alexa 647 için 670/14 bant geçiren filtre kullanılarak ve 780/60 bant geçiren filtrede L/D boya için sinyaller tespit edildi (Şekil 3B).

10. Akış sitometrisi edinimi ve analizi

  1. Sitometre ayarlarının voltajını ayarlamak için kontrol organoidinin boyanmamış ve tek lekeli örneklerini kullanın.
  2. Hücre popülasyonunun boyutuna ve ayrıntı düzeyine bağlı olarak ileri saçılma alanı (FSC-A) ve yan saçılma alanı (SSC-A) dağılım grafiklerini ayarlamak için boyanmamış kontrol tüpünü kullanın (Şekil 4A).
  3. FSC-A ve SSC-A grafiklerinden canlı hücreleri seçmek için kalıntıları kapatın. Yan saçılma yüksekliğini (SSC-H) kullanarak çiftleri dışarı çıkarın vs. SSC-A grafiği (Şekil 4B).
  4. APC-cy7'ye geçerek L/D boyanın boyanmasına dayalı olarak canlı hücreleri seçin. FSC-A grafiği (Şekil 4C).
  5. Her satırın boyanmamış örneklerini kullanarak, FSC-A vs.'deki olayların ana popülasyonunun üzerine bir kapı çizin. florokrom kanalları (FITC, APC, BV 421) grafikleri.
  6. Kurulum, akış sitometresi15 için kompanzasyonlar.
  7. Arka plan lekelenmesini gözlemlemek için negatif kontrol için izotip kontrolünü kullanın.
  8. Veri toplama işlemini gerçekleştirin.
    1. APC-cy7'ye geçerek L/D boyanın boyanmasına dayalı olarak canlı hücreleri seçin. FSC-A grafiği (Şekil 4C).
    2. Lekelenmemiş olanı negatif kontrol olarak kullanın. Ardından, FSC-A vs. florokrom kanallar (FITC, APC, BV 421) grafikleri, tek hücreli olayların ana popülasyonunun üzerinde bir kapı oluşturur (Şekil 4D-F).
  9. FlowJo yazılımını kullanarak veri analizi yapın (Malzeme Tablosuna bakın).
    1. Kapıların konumlarını lekeli hücre numuneleri üzerine çoğaltın. Pozitif lekelenme gösteren hücrelerin sayısını belgeleyin.
    2. Hedeflenen her popülasyon için, mitokondriyal sinyali tanımlamak için bir histogramın x ekseni üzerinde çizilen farklı kanalların (FITC, APC, BV 421) medyan floresan yoğunluğunu (MFI) değerlendirin. Kompleks I alt birim NDUFB10 ve TFAM için spesifik değerler, karmaşık ifadenin MFI'sinin veya TFAM'ın mitokondriyal kütle göstergesi VDAC 1'e bölünmesiyle belirlenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1, farklılaşma sürecinin ve akış sitometrik analizi için kullanılan stratejilerin diyagramatik bir temsilini sağlar. İnsan iPSC'leri, EB'ler oluşturmak için yapışık olmayan 96 oyuklu plakalarda kültürlendi ve daha sonra tamamen büyümüş kortikal organoidler elde etmek için yapışık olmayan 6 oyuklu plakalara aktarıldı. Organoidlerin hücresel bileşimi, nöronal16 ve glial belirteçler1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

İnsan iPSC'lerinden kortikal beyin organoidleri üretmek ve bu organoidlerden izole edilen tek hücrelerde mitokondriyal parametrelerin akış sitometrik analizini gerçekleştirmek için bir protokol sunulmuştur. Organoidlerin hücresel bileşimi, nöronal ve glial hücre belirteçleri için immünohistokimyasal boyama ile konfokal mikroskopi ile doğrulandı. Anti-NDUFB10, VDAC 1 ve TFAM ile birlikte boyama akış sitometrisi tabanlı stratejinin, bir hücredeki mitokondri sayısına...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Norveç Oslo Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Gareth John Sullivan'a bize AG05836 (RRID:CVCL_2B58) hücre hattını cömertçe sağladığı için en içten şükranlarımızı sunarız. Norveç'teki Bergen Üniversitesi'ndeki Moleküler Görüntüleme Merkezi, Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki fonlarla desteklenmiştir: K.L, kısmen Bergen Üniversitesi Meltzers Høyskolefonds (proje numarası: 103517133) ve Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat (proje numarası: 103816102) tarafından desteklenmiştir. L.A.B, Norveç Araştırma Konseyi (proje numarası: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ve Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies using in flow cytometry
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405NOVUS biologicalsNBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647Santa cruz technologysc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488Abcamab198308
L/D fixable near-IR dead cell stain kitLife technologiesL10119
Antibodies using in immunofluorence staining
anti-Tuj1Abcamab78078
anti-SOX2 Abcamab97959
anti-Alexa Flour 488Thermo Fisher ScientificA28175
anti-Alexa Flour 594Thermo Fisher ScientificA-21442
Commercial cells
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)Provided by Gareth John Sullivan from the Institute of Basic Medical Sciences at the University of Oslo, Norway
Essential 8 Medium (iPSC culture medium)
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher ScientificA1516901
Essential 8 Supplement (50x) 2% (v/v)Thermo Fisher ScientificA1517101
Store at 4 °C and warm up to RT before use.
Instruments
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
Orbital shakers - SSM1, SSL1Stuart Equipment, UK
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
50 mL falcon tubeSigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences, USA
Flowjo Sampler AnalysisFlowJo LLC, USA
10 mL pipetteSigma-AldrichSIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL pipetteSigma-Aldrich
40 µm Cell starinerSigma-AldrichCLS431750
ultra-low attachment 96-well plateS-BIOMS-9096UZ
Countess II automated cell counterThermo Fisher Scientific
Neural differentiation medium  (NDM+)
DMEM/F12Life technologies11330032
Neurobasal mediumLife technologies2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)Life technologies35050
N2 supplement 0.5% (v/v)Life technologies17502-048
B27 supplement 1% (v/v)Life technologies17504-044
β-Mercaptoethanol 50 µMSigma-aldrichM3148
BDNF 20 ng/mLPeprotech450-02
Ascorbic acid 200 µMSigma-Aldrich A92902
Store at 4° C for upto 2 weeks
Neural differentiation medium minus viatmin A (NDM-)
DMEM/F12Life technologies11330032
Neurobasal mediumLife technologies2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)Life technologies35050
N2 supplement 0.5% (v/v)Life technologies17502-048
B27 supplement W/O vit. A 1% (v/v)Life technologies12587010
β-Mercaptoethanol 50 µMSigma-aldrichM3148
Store at 4° C for upto 8 days
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12Life technologies11330032
Knockout serum replacement 15% (v/v)Life technologies10828028
Glutamax supplement 1% (v/v)Life technologies35050
β-Mercaptoethanol 100 µMSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 nMStemgent/Reprocell04-0074
SB431542 10 µMTocris1614
XAV939 2 µMSigma-AldrichX3004
Store at 4° C for upto 10 days
Neutralisation medium
IMDMLife technologies21980032
FBS 10%Sigma-Aldrich12103C
Other reagents
DPBS (Ca2+/Mg2+ free)Thermo Fisher Scientific14190250
Bovine Serum AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000
AccutaseLife technologiesA11105-01
GeltrexLife technologiesA1413302
EDTALife technologies15575038
Advanced DMEM / F12Life technologies12634010
Neural tissue dissociation kitMiltenyi biotec130-092-628
Y-27632 dihydrochloride Rock InhibitorBiotechne Tocris1254
Fluoromount-G™ Mounting MediumSouthernBiotech0100-20
PFAThermo Fisher Scientific28908

Referanslar

  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  3. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).
  4. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  5. Trifunovic, A., Larsson, N. G. Mitochondrial dysfunction as a cause of ageing. Journal of Internal Medicine. 263 (2), 167-178 (2008).
  6. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  7. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  10. Xu, L., et al. Abnormal mitochondria in Down syndrome iPSC-derived GABAergic interneurons and organoids. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1868 (6), 166388(2022).
  11. Liu, C., et al. Mitochondrial HSF1 triggers mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Huntington's disease. EMBO Molecular Medicine. 14 (7), e15851(2022).
  12. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  13. Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives. The Journal of Visualized Experiments. 177, e63116(2021).
  14. Strober, W. Trypan Blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  15. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. Chapter 1 (Unit 1), 14(2002).
  16. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome Biology. 6 (1), 204(2005).
  17. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  18. Xiang, Y., et al. Generation and fusion of human cortical and medial ganglionic eminence brain organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 47 (1), e61(2018).
  19. Pevny, L., Placzek, M. SOX genes and neural progenitor identity. Current Opinion in Neurobiology. 15 (1), 7-13 (2005).
  20. Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cytoskeleton and Cell Motility. 17 (2), 118-132 (1990).
  21. Rosebrock, D., et al. Enhanced cortical neural stem cell identity through short SMAD and WNT inhibition in human cerebral organoids facilitates emergence of outer radial glial cells. Nature Cell Biology. 24 (6), 981-995 (2022).
  22. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  23. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  24. Yan, Y., Zhang, S. C. Generation of cerebral cortical neurons from human pluripotent stem cells in 3D culture. Methods in Molecular Biology. 2683, 1-11 (2023).
  25. Pamies, D., et al. Human IPSC 3D brain model as a tool to study chemical-induced dopaminergic neuronal toxicity. Neurobiology of Disease. 169, 105719(2022).
  26. Pamies, D., Hartung, T., Hogberg, H. T. Biological and medical applications of a brain-on-a-chip. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J. : Online). 239 (9), 1096-1107 (2014).
  27. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  28. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Flow SitometriMitokondriyal ParametrelerN rodejenerasyonIPSC kaynakl beyin organoidleriMitokondriyal DisfonksiyonMitokondriyal Solunum ZinciriMtDNA Kopya Say sKortikal Organoidlerift BoyamaNADH Ubikinon Oksidored ktaz Alt Birimi B10Mitokondriyal Transkripsiyon Fakt r AVDAC 1Tek H creli DissosiyasyonProtokolMiktar Tayini

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır