Application de l’analyse cytométrique en flux pour mesurer plusieurs paramètres mitochondriaux dans des organoïdes cérébraux 3D

Résumé

Ce protocole fait état d’une méthode unique d’utilisation d’un cytomètre en continu et de plusieurs anticorps pour l’évaluation simultanée de plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux, y compris les modifications du volume mitochondrial, les quantités de sous-unités complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale (MRC) et la réplication de l’ADN mitochondrial (ADNmt).

Résumé

Le dysfonctionnement mitochondrial est un contributeur primaire ou secondaire commun à de nombreux types de neurodégénérescence, et des modifications de la masse mitochondriale, des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale (MRC) et du nombre de copies de l’ADN mitochondrial (ADNmt) figurent souvent dans ces processus. Les organoïdes du cerveau humain dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) récapitulent l’arrangement cytoarchitectural tridimensionnel (3D) du cerveau et offrent la possibilité d’étudier les mécanismes de la maladie et de cribler de nouvelles thérapies dans un système humain complexe. Ici, nous rapportons une approche unique basée sur la cytométrie en flux pour mesurer plusieurs paramètres mitochondriaux dans les organoïdes corticaux dérivés d’iPSC. Ce rapport détaille un protocole pour générer des organoïdes cérébraux corticaux à partir d’iPSC, la dissociation unicellulaire des organoïdes générés, la fixation, la coloration et l’analyse cytométrique en flux ultérieure pour évaluer plusieurs paramètres mitochondriaux. La double coloration avec des anticorps contre la sous-unité du complexe MRC NADH : la sous-unité B10 (NDUFB10) de l’ubiquinone oxydoréductase ou le facteur de transcription mitochondrial A (TFAM) associée au canal sélectif des anions 1 dépendant de la tension (VDAC 1) permet d’évaluer la quantité de ces protéines par mitochondrie. Étant donné que la quantité de TFAM correspond à la quantité d’ADNmt, elle fournit une estimation indirecte du nombre de copies d’ADNmt par contenu mitochondrial. L’ensemble de cette procédure peut être complété en l’espace de 2 à 3 heures. De manière cruciale, il permet la quantification simultanée de plusieurs paramètres mitochondriaux, y compris les niveaux totaux et spécifiques relatifs à la masse mitochondriale.

Introduction

Les mitochondries sont des organites cellulaires essentiels et le principal site de production de l’adénosine triphosphate (ATP). En plus de fournir de l’énergie aux cellules, les mitochondries participent également à de multiples processus cellulaires, notamment la transmission de l’information cellulaire, la différenciation cellulaire et l’apoptose, et ont la capacité de réguler la croissance cellulaire et le cycle cellulaire. Des modifications de la fonction mitochondriale ont été identifiées dans diverses maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson (MP)^1,2, la maladie d’Alzheimer (MA)³ et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)⁴. Le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle dans le processus de vieillissement, accumulant des mutations somatiques de l’ADNmt et déclinant la fonction de la chaîne respiratoire⁵.

Différents types de dysfonctionnement mitochondrial se produisent dans la neurodégénérescence, et la capacité de mesurer ces changements est extrêmement utile lors de l’étude des mécanismes de la maladie et de l’essai de traitements potentiels. En outre, la mise en place de systèmes modèles in vitro appropriés qui récapitulent les maladies dans les cellules cérébrales humaines est essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie et développer de nouvelles thérapies. Les iPSC de patients atteints de maladies neurodégénératives ont été utilisées pour générer diverses cellules cérébrales qui manifestent des lésions mitochondriales 6,7,8,9. Le développement d’organoïdes cérébraux 3D dérivés d’iPSC est une étape majeure dans la modélisation des maladies. Ces organoïdes cérébraux dérivés d’iPSC offrent de la complexité et contiennent le propre patrimoine génétique du patient, fournissant ainsi un modèle de maladie qui reflète plus précisément la pathologie du cerveau du patient.

Bien que certaines recherches aient été menées sur des études mitochondriales utilisant des organoïdes cérébraux dérivés d’iPSC 10,11,12, les techniques pratiques et fiables pour déterminer plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux dans les organoïdes cérébraux dérivés d’iPSC restent limitées. La cytométrie en flux fournit un outil puissant pour mesurer les paramètres mitochondriaux au niveau de la cellule unique, comme nous l’avons démontré précédemment¹³. Cette étude fournit un protocole détaillé pour générer des organoïdes corticaux à partir d’iPSC, combiné à une nouvelle approche basée sur la cytométrie en flux pour mesurer simultanément plusieurs paramètres mitochondriaux, y compris la masse mitochondriale, les sous-unités complexes de la chaîne respiratoire et le nombre de copies d’ADNmt (Figure 1). Il est important de noter qu’en utilisant la masse mitochondriale comme dénominateur, ces protocoles permettent de mesurer à la fois les niveaux totaux et spécifiques par unité mitochondriale.

Protocole

1. Différenciation des iPSC en organoïdes corticaux

1. Préparation de plaques revêtues de matrice
   1. Décongelez le flacon de la matrice de membrane basale disponible dans le commerce sur de la glace pendant la nuit. Diluer à 1:100 dans du froid Advanced Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F12 DMEM/F12 (concentration finale de 1 %). Faites des aliquotes et conservez-les à -20 °C (voir tableau des matériaux).
   2. Décongeler la solution matricielle membranaire à 4 °C (la garder froide) et enduire le nombre requis de puits (1 mL pour un puits dans une plaque à 6 puits). Incuber à 37 °C pendant 1 h.
   3. Sortez la plaque de l’incubateur et laissez-la atteindre la température ambiante (RT) (laissez-la pendant une heure).
      REMARQUE : Les plaques peuvent être conservées jusqu’à 2 semaines au réfrigérateur (n’oubliez pas de les sortir et de réchauffer les puits enduits nécessaires pour ce jour-là à RT jusqu’à ce qu’ils ne soient plus froids au toucher avant utilisation). Il est recommandé d’utiliser les plaques dans les 3 jours. Pour un stockage de longue durée, ajoutez 1 mL d’Essential 8 Medium (voir le tableau des matériaux) à la plaque enduite pour éviter que le gel ne se dessèche.

2. Préparation du milieu Essential 8 (E8) pour la culture d’iPSC

1. Dans un environnement stérile, préparez le milieu E8 en combinant le milieu de base E8 avec un supplément de E8 (voir le tableau des matériaux). Celui-ci peut être conservé à 4 °C pendant 2 semaines.
   REMARQUE : Décongelez le supplément E8 congelé à 4 °C pendant la nuit avant de préparer le milieu complet. Il n’est pas recommandé de décongeler le supplément congelé à 37 °C ; utilisez E8 Medium pendant 2 semaines. Avant utilisation, chaud E8 Medium requis pour cette journée à RT jusqu’à ce qu’il ne soit plus froid au toucher.

3. Sous-culture des CSPi

1. Préchauffer les plaques revêtues d’une matrice dans un RT ou un incubateur à 37 °C pendant 20 à 30 min. Préchauffez la quantité de E8 Medium nécessaire à RT.
2. Aspirer le milieu de culture à l’aide d’une pipette.
3. Rincer les iPSC (voir le tableau des matières) avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (sans Ca²⁺/Mg²⁺ ) (DPBS-/-) (4 mL pour un puits dans une plaque à 6 puits).
4. Ajouter de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,5 mM) (1 mL pour un puits dans une plaque à 6 puits). Incuber à 37 °C jusqu’à ce que les bords des colonies commencent à se détacher de la plaque (généralement 3 à 5 min).
5. Aspirez la solution de dissociation.
6. Ajouter du E8 moyen préchauffé (4 mL pour un puits dans une plaque à 6 puits) et utiliser une pression élevée pour détacher les colonies d’iPSC.
7. Transvaser dans deux puits différents dans une plaque à 6 puits recouverte d’une matrice (2 mL pour un puits dans une plaque à 6 puits) et incuber à 37 °C.
   REMARQUE : Secouez doucement avant de mettre la plaque dans l’incubateur. Le rapport de division peut être de 1:2-1:4.
8. Échangez des milieux tous les jours jusqu’à ce que les colonies obtiennent une confluence de 80 % avec une bonne taille et des connexions.
   REMARQUE : Surveiller les colonies d’une taille appropriée, généralement caractérisées par une forme circulaire bien définie et un diamètre variant de 0,5 à 1 mm. Les colonies doivent présenter des structures denses et compactes avec des bordures lisses et clairement délimitées.

4. Formation du corps embryoïde (EB) et induction neuronale

1. Préparez le milieu d’induction neuronale (NIM) en combinant les composants énumérés dans la table des matériaux.
2. Aspirer le milieu et rincer les cellules avec du DPBS -/- (4 mL par puits dans une plaque à 6 puits).
3. Ajouter de l’Accutase préchauffée (1 mL par puits dans une assiette à 6 puits) (voir le tableau des matières) dans le puits et incuber à 37 °C pendant 10 min.
4. Pipetez doucement la solution de haut en bas 3 à 4 fois à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL.
5. Neutraliser avec 2 mL de DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et centrifuger le tube conique de 15 mL contenant les cellules à 600 x g pendant 5 min à RT. Aspirer le surnageant.
6. Remettez les granulés de cellule en suspension en pipetant doucement de haut en bas jusqu’à ce que les palettes d’une seule cellule se transforment.
7. Comptez et calculez la concentration de cellules vivantes à l’aide du bleu trypan¹⁴ dans un compteur de cellules automatisé.
8. Calculez le taux de dilution et diluez les cellules dans le NIM pour obtenir une concentration finale de cellules de 60 000 cellules vivantes/ml.
9. Ajouter l’inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK) Y-27632 (concentration finale 50 μM) (voir le tableau des matériaux) à la suspension cellulaire et mélanger délicatement.
10. Ajouter 150 μL de suspension à cellule unique dans chaque puits de plaque à 96 puits à très faible fixation (voir le tableau des matériaux) et placer dans l’incubateur. Configurer en tant que Jour 0.
11. Le jour 1, vérifiez les cellules et les formes d’EB dans chaque puits.
    REMARQUE : Évaluez la formation réussie d’EB en fonction de leur apparence brillante, sphérique et translucide au microscope, de leur capacité à rester flottantes et séparées, et de l’absence de cellules mortes, qui apparaissent comme des taches sombres.
12. Le jour 2, retirez soigneusement 75 μL de milieu de chaque puits et ajoutez 150 μL de NIM ainsi que 50 μM d’Y-27632 dans chaque puits.
13. Les jours 4, 6 et 8, retirez 100 μL de milieu de chaque puits et ajoutez 150 μL de NIM dans chaque puits.

5. Génération d’organoïdes corticaux

1. Préparez le milieu de différenciation neurale sans vitamine A (NDM-) en combinant les composants énumérés dans la table des matériaux.
2. Le 10e jour, transférez les EB de la plaque à 96 puits à fixation ultra-basse à la plaque à 6 puits à fixation ultra-basse à l’aide d’une pipette de 5 ml. Transférez huit EB dans chaque puits avec prudence (figure 2). Ajouter 5 mL de NDM- dans chaque puits.
3. Placez la plaque sur l’agitateur orbital à l’intérieur de l’incubateur et commencez à tourner à 80 tr/min.
4. Les jours 12, 14 et 16, remplacez le NDM par 4 mL après avoir aspiré 3 mL de l’ancien milieu.

6. Maturation et culture à long terme d’organoïdes corticaux

1. Préparez un milieu de différenciation neurale avec de la vitamine A (NDM+) et du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Pour plus de détails, voir la Table des matériaux.
2. Le 18e jour, retirer le milieu de 3 mL et ajouter 4 mL de NDM+.
3. Remettez l’assiette dans la culture de filature.
4. Nourrir tous les 4 jours et maintenir les organoïdes corticaux différenciés dans NDM+ jusqu’à l’utilisation. Des organoïdes corticaux âgés de 25 à 40 jours ont été utilisés pour l’analyse en aval.
   REMARQUE : Les organoïdes corticaux peuvent être maintenus plus longtemps (jusqu’à 3-4 mois) ; Mais la viabilité cellulaire sera réduite en raison du manque d’échange de nutriments.

7. Caractérisation cellulaire par immunocytochimie et coloration par immunofluorescence

1. À l’aide d’une pipette de 1000 μL, prélevez délicatement l’organoïde du milieu et placez-le doucement sur un milieu avec un minimum de milieu sur une lame de microscope standard.
2. Laisser sécher complètement à RT. Ajouter 4 % de paraformaldéhyde (PFA) (300 μL par échantillon) pendant 30 min. Retirez le PFA, puis rincez deux fois avec du PBS.
   REMARQUE : Le PFA est toxique et soupçonné d’être cancérigène. Évitez tout contact avec la peau et les yeux et manipulez-le sous une hotte chimique.
3. Ajouter une solution de saccharose à 30 % (300 μL par échantillon) dans les lames et incuber toute la nuit à 4 °C.
4. Bloquer et perméabiliser les organoïdes avec un tampon de blocage (BB) (300 μL par échantillon) contenant du PBS (avec Ca²⁺/Mg²⁺), 0,3 % de Triton X-100 et 10 % de sérum de chèvre normal pendant 2 h à RT (ou toute la nuit à 4 °C). Tracez le contour des organoïdes avec un stylo barrière hydrophobe pour maintenir le tampon sur la lame.
5. Superposer les échantillons avec l’anticorps primaire dans le tampon de blocage (300 μL par échantillon), l’anti-SRY (région déterminante du sexe Y) boîte 2 (SOX2, 1:100) et le marqueur anti-neural tubérine bêta III (Tuj1, 1:1000), et incuber pendant la nuit à 4 °C dans l’obscurité (voir le tableau des matériaux).
6. Laver au PBS pendant 3 h avec deux à trois changements de tampon sur une plate-forme à bascule douce.
7. Incuber avec l’anticorps secondaire (300 μL par échantillon), la farine anti-Alexa 488 (1:800) et la farine anti-Alexa 594 (1:800), pendant la nuit à 4 °C dans une chambre noire humidifiée. Ajouter la coloration nucléaire Hoechst 33342 (1:5000) en même temps (voir tableau des matériaux).
8. Aspirez l’anticorps et rincez-le rapidement avec du PBS, puis ajoutez du PBS contenant 0,01 % de naazide pendant 1 à 2 jours à 4 °C pour éviter toute contamination.
9. Aspirez le PBS et retirez l’excédent de solution. Montez les organoïdes avec un support de montage (voir tableau des matériaux), puis ajoutez une lamelle. Évitez la formation de bulles d’air et placez-le dans une pièce sombre à RT pendant au moins 12 h pour permettre au montage de polymériser complètement.
   REMARQUE : L’échantillon est maintenant prêt à être imaginé sous un microscope à fluorescence.

8. Dissociation des organoïdes corticaux

1. Ajouter 30 mL de DPBS -/- dans un tube à centrifuger de 50 mL.
2. Prélevez délicatement les organoïdes cérébraux dans le tube à l’aide d’une pipette de 10 ml. Au moins 3 organoïdes sont utilisés pour une coloration, et ils doivent avoir plus de 25 jours mais moins de 40 jours.
3. Sédimenter les organoïdes pendant environ 5 min. Ne pas centrifuger.
4. Aspirez le DPBS et ajoutez 2 ml d’Accutase préchauffé dans le tube. Incuber l’échantillon dans le bain-marie pendant 5 min à 37 °C.
5. Triturez 15 fois doucement à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL sans générer de bulles. Incuber l’échantillon pendant encore 5 minutes à 37 °C dans un bain-marie.
6. Dissociation douce en utilisant 15 fois des pointes de pipette de 1000 μL sans générer de bulles (Figure 3A).
   REMARQUE : S’il reste encore des cellules non dissociées, transférez les cellules non dissociées dans un nouveau tube à centrifuger de 50 ml, puis incubez pendant 5 minutes supplémentaires à un bain-marie à 37 °C. Ensuite, dissociez doucement en utilisant 20 fois des pointes de pipette de 1000 μL.
7. Neutraliser avec 4 mL de DMEM avec 10 % de FBS et centrifuger le tube conique de 15 mL contenant les cellules à 600 x g pendant 5 min à RT.
8. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension avec 200 μL DPBS à l’aide de pointes de pipette de 1000 μL 10 fois sans générer de bulles.
9. Ajouter 200 μL de DPBS pour obtenir un volume total de 400 μL de suspensions cellulaires dans du DPBS.
10. Filtrez avec le filtre ou le tube filtrant (utilisez des filtres de 35 ou 40 μm et rincez le filtre avec DPBS avant d’utiliser le filtre).
11. Séparez la moitié de la solution dans un tube et utilisez-la comme échantillon non coloré.

9. Mesure par cytométrie en flux des sous-unités du complexe MRC et du TFAM dans les cellules fixes

1. Ajouter un colorant de coloration vivant et mort (L/D) (1:1000) (voir tableau des matériaux) (soit avec du rouge lointain, soit du proche infrarouge, selon la configuration des marqueurs pour la cytométrie en flux).
   REMARQUE : Si un nouveau flacon de colorant L/D est ouvert, ajoutez 50 μL de DMSO pour reconstituer et faites une aliquote de 10 μL pour les conserver à -20 °C.
2. Conserver dans l’air libre et à l’obscurité pendant 30 min. Ajouter 40 mL de DPBS -/-. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min.
3. Remettre en suspension dans une suspension unicellulaire après avoir jeté le surnageant.
4. Fixez et perméabilisez les cellules avec 1 mL de méthanol glacé à 90 % à -20 °C pendant 20 min.
5. Bloquez les échantillons dans un tampon de bloc de 1 mL contenant 0,3 M de glycine, 5 % de sérum de chèvre et 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS (avec Ca²⁺/Mg²⁺).
6. Laver une ou deux fois avec un tampon d’écoulement de 20 mL contenant du PBS (avec Ca²⁺/Mg²⁺) avec 0,2 % de BSA.
7. Ajoutez les anticorps primaires anti-NDUFB10 conjugués à Alexa Fluor 405 (1:100), anti-VDAC 1 conjugués à Alexa Fluor PE (1:100) et anticorps anti-TFAM conjugués à Alexa Fluor 488 (1:200) pendant 30 min (voir tableau des matériaux).
8. Laver avec un tampon d’écoulement de 20 ml.
9. Aspirez et laissez environ 100 μL et reconstituez les granulés de cellule en tampon d’écoulement de 300 μL.
10. Transférez les cellules dans des tubes d’écoulement de 1,5 ml. Restez dans l’obscurité et la glace.
11. Analyser sur le cytomètre en flux (voir Tableau des matériaux). Des signaux ont été détectés pour l’Anti NDUFB10-Alexa 405 à l’aide d’un filtre passe-bande 450/50, le TFAM-Alexa 488 à l’aide d’un filtre passe-bande 530/30, le VDAC 1-Alexa 647 à l’aide d’un filtre passe-bande 670/14 et le colorant L/D dans le filtre passe-bande 780/60 (Figure 3B).

10. Acquisition et analyse de la cytométrie en flux

1. Utilisez des échantillons non colorés et colorés uniques de l’organoïde de contrôle pour régler la tension des paramètres du cytomètre.
2. Utilisez le tube de contrôle non coloré pour définir les diagrammes de dispersion de l’aire de diffusion directe (FSC-A) et de l’aire de diffusion latérale (SSC-A) en fonction de la taille et de la granularité de la population cellulaire (Figure 4A).
3. Éliminez les débris pour sélectionner des cellules vivantes dans les parcelles FSC-A et SSC-A. Gate out doublets en utilisant la hauteur de diffusion latérale (SSC-H) vs. Graphique SSC-A (figure 4B).
4. Sélectionnez les cellules vivantes en fonction de la coloration du colorant L/D en passant à APC-cy7 vs. Graphique FSC-A (figure 4C).
5. À l’aide des échantillons non colorés de chaque ligne, tracez une porte au-dessus de la population principale des événements dans FSC-A vs. tracés des canaux fluorochromes (FITC, APC, BV 421).
6. Set up compense le cytomètre de flux¹⁵.
7. Utilisez le contrôle d’isotype pour le contrôle négatif afin d’observer la coloration de fond.
8. Effectuer l’acquisition de données.
   1. Sélectionnez les cellules vivantes en fonction de la coloration du colorant L/D en passant à APC-cy7 vs. le graphique FSC-A (figure 4C).
   2. Utilisez l’non taché comme contrôle négatif. Ensuite, lors de l’examen du FSC-A vs. les canaux fluorochromes (FITC, APC, BV 421) établissent une porte au-dessus de la population principale d’événements unicellulaires (Figure 4D-F).
9. Effectuer l’analyse des données à l’aide du logiciel FlowJo (voir Tableau des matériaux).
   1. Dupliquez les positions des portes sur les échantillons de cellules colorées. Documentez le nombre de cellules qui présentent une coloration positive.
   2. Pour chaque population ciblée, évaluer l’intensité médiane de fluorescence (MFI) des différents canaux (FITC, APC, BV 421) tracés sur l’axe des x d’un histogramme afin d’identifier le signal mitochondrial. Des valeurs spécifiques pour la sous-unité complexe I NDUFB10 et TFAM peuvent être déterminées en divisant le MFI de l’expression complexe ou TFAM par l’indicateur de masse mitochondriale, VDAC 1.

Résultats

La figure 1 fournit une représentation schématique du processus de différenciation et des stratégies utilisées pour l’analyse cytométrique en flux. Des iPSC humaines ont été cultivées dans des plaques non adhérentes à 96 puits pour former des EB, puis transférées sur des plaques non adhérentes à 6 puits pour obtenir des organoïdes corticaux complètement développés. La composition cellulaire des organoïdes a été validée par microscopi...

Discussion

Un protocole est présenté pour générer des organoïdes cérébraux corticaux à partir d’iPSC humaines et pour effectuer l’analyse cytométrique en flux des paramètres mitochondriaux dans des cellules uniques isolées de ces organoïdes. La composition cellulaire des organoïdes a été vérifiée par microscopie confocale avec coloration immunohistochimique pour les marqueurs des cellules neuronales et gliales. Il a été démontré que la stratégie de co-coloration basée sur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies using in flow cytometry
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS biologicals	NBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa cruz technology	sc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
L/D fixable near-IR dead cell stain kit	Life technologies	L10119
Antibodies using in immunofluorence staining
anti-Tuj1	Abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
anti-Alexa Flour 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
anti-Alexa Flour 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
Commercial cells
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)			Provided by Gareth John Sullivan from the Institute of Basic Medical Sciences at the University of Oslo, Norway
Essential 8 Medium (iPSC culture medium)
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8 Supplement (50x) 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific	A1517101
Store at 4 °C and warm up to RT before use.
Instruments
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
Orbital shakers - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, UK
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
50 mL falcon tube	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, USA
Flowjo Sampler Analysis	FlowJo LLC, USA
10 mL pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL pipette	Sigma-Aldrich
40 µm Cell stariner	Sigma-Aldrich	CLS431750
ultra-low attachment 96-well plate	S-BIO	MS-9096UZ
Countess II automated cell counter	Thermo Fisher Scientific
Neural differentiation medium  (NDM+)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement 1% (v/v)	Life technologies	17504-044
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
Ascorbic acid 200 µM	Sigma-Aldrich	A92902
Store at 4° C for upto 2 weeks
Neural differentiation medium minus viatmin A (NDM-)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement W/O vit. A 1% (v/v)	Life technologies	12587010
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
Store at 4° C for upto 8 days
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Knockout serum replacement 15% (v/v)	Life technologies	10828028
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
β-Mercaptoethanol 100 µM	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µM	Tocris	1614
XAV939 2 µM	Sigma-Aldrich	X3004
Store at 4° C for upto 10 days
Neutralisation medium
IMDM	Life technologies	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
Other reagents
DPBS (Ca2+/Mg2+ free)	Thermo Fisher Scientific	14190250
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000
Accutase	Life technologies	A11105-01
Geltrex	Life technologies	A1413302
EDTA	Life technologies	15575038
Advanced DMEM / F12	Life technologies	12634010
Neural tissue dissociation kit	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 dihydrochloride Rock Inhibitor	Biotechne Tocris	1254
Fluoromount-G™ Mounting Medium	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908