בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

Abstract

התא התומך העיקרי ברשתית הוא תא מולר גליית הרשתית. הם מכסים את כל פני הרשתית ונמצאים בסמיכות הן לכלי הדם ברשתית והן לנוירונים ברשתית. בגלל גדילתם, תאי מולר מבצעים מספר משימות חיוניות ברשתית בריאה, כולל ספיגה ומיחזור של מוליכים עצביים, תרכובות חומצה רטינואית ויונים (כמו אשלגן K+). בנוסף להסדרת זרימת הדם ושמירה על מחסום הדם-רשתית, הם גם מווסתים את חילוף החומרים ואת אספקת החומרים המזינים לרשתית. נוהל מבוסס לבידוד תאי מולר ראשוניים של עכבר מוצג בכתב יד זה. כדי להבין טוב יותר את התהליכים המולקולריים הבסיסיים המעורבים במודלים עכבריים שונים של הפרעות עיניים, בידוד תאי מולר הוא גישה מצוינת. כתב יד זה מתאר הליך מפורט לבידוד תאי מולר מעכברים. מהאינוקלציה ועד הזריעה, התהליך כולו נמשך כמספר שעות. במשך 5-7 ימים לאחר הזריעה, אין לשנות את המדיה על מנת לאפשר לתאים המבודדים לגדול ללא הפרעה. אפיון תאים באמצעות מורפולוגיה וסמנים אימונופלואורסצנטיים מובחנים הוא השלב הבא בתהליך. המעברים המרביים לתאים הם 3-4 פעמים.

Introduction

תאי מולר (MCs) הם תאי הגליה העיקריים והנפוצים ביותר הנמצאים ברקמת הרשתית. הם שחקני המפתח במתן שלמות מבנית ותפקודים מטבוליים בתוך הרשתית¹. המבנה האסטרטגי של MCs מתפרש על פני כל עובי הרשתית, ובכך מספק תמיכה לרשתית. בנוסף לתכונות דמויות הפיגומים שלהם, יש להם פונקציות מטבוליות עבור נוירונים ברשתית, המספקים להם מצעי אנרגיה, כולל גלוקוז ולקטט. תפקודים אלה חיוניים על מנת לשמור על תפקוד עצבי בריא. דווח כי MCs לקויים תורמים למחלות רשתית שונות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטינופתיה סוכרתית וגלאוקומה ^2,3. MCs יכולים להיות מקורות תאיים אנדוגניים לטיפול רגנרטיבי ברשתית¹. הם גם מהווים חלק משמעותי מהרשתית, וראיות חזקות מצביעות על כך שבכמה מינים, תאים אלה יכולים להיות מעוררים להחליף נוירונים חסרים². הם משתפים פעולה באופן מועיל עם נוירונים, וכפות הרגליים הסופיות של תאי מולר המסתעפים בחרוט פותחות בצפיפות את כלי הדם ומחברות את המרכיבים העצביים של הרשתית. על מנת לשמור על התפתחות עצבית ופלסטיות עצבית, תאי מולר משמשים כמצע רך לנוירונים, ומגינים עליהם מפני טראומה מכנית³. בנוסף, בנסיבות פתולוגיות, תאי מולר עשויים להתמיין לאבות עצביים או תאי גזע המשכפלים או מחדשים את הפוטורצפטורים והנוירונים^{שאבדו 2,3,4}. תאי מולר שומרים על המאפיינים של תאי גזע ברשתית, כולל רמות שונות של פוטנציאל להתחדשות עצמית והתמיינות ^5,6. לתא הגליה של מולר יש שושלת רשתית משמעותית המייצרת גורמים נוירוטרופיים, סופגת וממחזרת מוליכים עצביים, חוצצת יונים מרחבית ושומרת על מחסום הדם-רשתית על מנת לשמור על הרשתית בהומאוסטזיס ^7,8,9. זה מדגיש את הפוטנציאל של תאי מולר ככלי מבטיח בטיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות הקשורות לניוון הרשתית. תאי מולר הם תאי הגליה העיקריים המפוזרים ברחבי הרשתית, ומתחברים הן לנוירונים והן לכלי הדם. הם ממלאים תפקיד הגנה חיוני, ומספקים תמיכה מבנית ומטבולית חיונית לשמירה על הכדאיות והיציבות של תאי הרשתית. למרבה הצער, מעט מאוד פרוטוקולים נמצאים בספרות לבידוד תאי מולר ראשוניים מהרשתית^10,11.

אנו מציגים גישה משופרת לבידוד וטיפוח אמינים של תאי מולר ראשוניים של עכברים. פרוטוקול זה שימש בקבוצה שלנו כדי לבודד תאי מולר מעכברי בר מסוג C57BL/6 ועכברים טרנסגניים^12,13. עכברים בגילאי 5 עד 11 ימים, ללא העדפת מין, משמשים לפרוטוקול זה. תאים עברו עד 4 פעמים; עם זאת, ב P4 הם מפסיקים לדבוק צלוחיות, וזה הופך להיות קשה לגדל תרבות בריאה. התרבית מזוהמת לעתים קרובות בתאי אפיתל פיגמנטי רשתית (RPE), ולכן יש להעביר את התאים לפחות פעם אחת לפני ביצוע ניסויים נוספים בקו התא. המעבר מאפשר בידוד נוסף ממזהמים. לכן, הפרוטוקול שהוצג מציע דרך מהירה ויעילה לבודד תאי מולר עכבר, אשר לאחר מכן יכול לשמש פלטפורמה אמינה לחקר מטרות טיפוליות והערכת טיפולים פוטנציאליים למחלות רשתית¹⁴.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים תאמו את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ונעשו בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים שלנו שאושר על ידי ועדת המכון לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ומדיניות אוניברסיטת אוקלנד (פרוטוקול מספר 2022-1160)

1. הכנת מדיה ופתרונות

1. הכן את תמיסת העיניים של תאי Müller על ידי השלמת Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, פרטים בטבלת החומרים) עם פניצילין/סטרפטומיצין בדילול של 1:1000. לדוגמה, עבור 10 מ"ל של DMEM, להוסיף 10 μL של פניצילין/סטרפטומיצין.
   הערה: זוהי מדיה פשוטה ללא סרום שהוכנה. כמו כן, חממו את המדיה המלאה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש בה לעבודות תרבית תאים.
2. הכינו מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא על ידי תוספת DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS, מומת חום), ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לדוגמה (500 מ"ל של מדיה DMEM + 50 מ"ל של FBS + 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין).
3. הכינו תמיסת טריפסין-EDTA 0.05% עם Collagenase IV בריכוז של 200 U/mL (טריפסין-EDTA משמש להמסת הכמות המחושבת של אבקת Collagenase IV כדי להגיע לריכוז הדרוש).

2. חינוך

1. המתת חסד אתית של העכבר באמצעות שאיפת CO₂ בהתאם להנחיות IACUC.
   1. בקצרה, הניחו את בעלי החיים בתא CO₂ כדי להחדיר 100% CO₂ בקצב מילוי של 30-70% מהנפח של התא עם CO₂ כדי להשיג את המטרה של חוסר הכרה מהיר תוך 2-3 דקות עם מצוקה מינימלית לעכברים.
   2. מכיוון שהעכברים נמצאים בגיל צעיר (~10 ימים), בצעו פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית כדי להבטיח המתת חסד נאותה.
2. לאחר עיקור אזור העבודה עם 70% אתנול, הניחו את העכבר על כרית תחתונה סטרילית.
3. חלץ את העיניים על ידי הנחת זרועות הפינצטה בחלק האחורי של העין, משיכה עדינה מאזור המסלול, והפעלת העיניים על ידי הפעלת לחץ עם פינצטה בסגנון 5/45 לאזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזיס.
   הערה: יש לעקר את כלי הדיסקציה עם 70% אתנול ולאחר מכן מלח חיץ פוספט לפני הנתיחה.
4. ודא כי עצב הראייה עדיין מחובר לעין על ידי enucleating העין לאט. הקפד למשוך את עצב הראייה (מזוהה חזותית כחוט לבן) מאחורי העין.
   הערה: שלב זה אינו חייב להתבצע תחת מיקרוסקופ, וניתן לבצע אותו על ספסל מעוקר.

3. טיפול בעיניים הלומדות

1. כסו צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל ברדיד אלומיניום ומלאו את הצינור ב-10 מ"ל של תמיסת העיניים של תא מולר.
2. הניחו את העיניים המנותחות בצינור של 15 מ"ל המכיל תמיסת עיניים של תאי מולר ואפשרו להן לשבת למשך הלילה, או כ-18 שעות, בטמפרטורת החדר.
3. לאחר 18 שעות, לרוקן את תמיסת העיניים ולשטוף בקצרה את העיניים עם 2-3 מ"ל של מחומם (37 ° C) פוספט חוצץ מלוחים (PBS).
4. דקרו את PBS והזיזו את העיניים לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 10 מ"ל של תמיסת טריפסין. (הוכן בשלב 1.3).
   הערה: טריפסין משמש על כל העין enucleated, מתנהג כסוכן דיסוציאטיבי כדי להקל על הפרדת תאים משכבות הרשתית במהלך דיסקציה. ברשתית המנותחת יש תאים רבים, כולל תאי RPE, שהם דביקים ובעלי הסבירות הגבוהה ביותר לזהם את תרבית תאי מולר¹⁴. בדיקה מיקרוסקופית הראתה בבירור כי לאחר 5 ימי בידוד (במהלך שינוי המדיה הראשון), תאי RPE התנתקו מהצלחת ומתו¹³. המדיה המשמשת לבידוד RPE היא DMEM/F-12, בעלת הרכב שונה מ-DMEM (המשמש לבידוד תאי מולר), המכילה נתרן פירובט וגלוקוז נמוך.
5. מניחים את המנה באינקובטור ודגרים במשך 1.5 עד 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
6. לאחר הדגירה, מעבירים את העיניים לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה כ-5 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא.

4. דיסקציה

הערה: הליך זה חייב להתבצע בתוך הסביבה הסטרילית של מכסה המנוע. לפיכך, חיוני לעקר ביסודיות את משטחי מכסה המנוע עם 70% אלכוהול, יחד עם כל הכלים ומיקרוסקופ הדיסקציה. ראוי לציין כי הסרטון הוקלט מחוץ למכסה המנוע לצורך ראות טובה יותר ומטרות הדגמה ברורות יותר.

1. הניחו חתיכה קטנה של רקמה מעוקרת ברמת מעבדה בצלחת כדי לסייע בייצוב העיניים במהלך הנתיחה. הניחו את העיניים מתחת למיקרוסקופ מנתח כדי להתחיל את הדיסקציה.
   הערה: השימוש ברקמה ברמת מעבדה מאפשר תמרון של העיניים בכלי מלא נוזל (מדיה שלמה), ומבטיח דיסקציה מדויקת.
2. השתמשו במספריים של Vannas ובפינצטה בסגנון M5S כדי להסיר את רקמת החיבור, השרירים החוץ-עיניים ועצב הראייה.
   1. תפסו את העין בפינצטה בסגנון M5S ובצעו חתך באזור האורה-סראטה בעזרת מספריים של Vannas או מחט של מזרק.
      הערה: קיים קו מעגלי בצבע תכלת בין החלק הקדמי והאחורי של העין הנקרא אורה סראטה (ora serrata), אשר יכול לשמש כנקודת ציון לכיווני מדויק במהלך הדיסקציה.
   2. אחזו את החתך בפינצטה בסגנון M5S ומשכו או קרעו את הקרנית מהחלק האחורי של העין. משכו פנימה במרווחים קטנים כדי להבטיח ששלמות הרשתית תישאר שלמה.
      הערה: שלבים אלה הם להסיר את החלק הקדמי של העין (קרנית, קשתית ועדשה) מהחלק האחורי של העין (רשתית עצבית ופיגמנטית).
   3. כדי לשמור על שלמות שכבות הרשתית, משוך בעדינות והסר את אפיתל פיגמנט הרשתית מהרשתית העצבית. הרשתית העצבית צריכה להיות נקייה מכל כתמים שחורים כדי להבטיח את טוהר הבידוד ככל האפשר, שכן שכבת RPE היא בדרך כלל דביקה ומחוברת לרשתית העצבית.
   4. חתכו את הרשתית העצבית המנותחת לחתיכות קטנות לפני שתאספו אותה בצלחת כדי להבטיח התפשטות הומוגנית של התאים בצלחת.
3. לוחית את הרשתית העצבית בבקבוק T25 המכיל 4 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא.
4. לבסוף, מניחים את הבקבוק באינקובטור ודגרים ב 37 ° C ו 5% CO₂.

5. גידול תאי גליה ראשוניים

1. אין להזיז את הבקבוק במשך 3-5 ימים כדי לקדם את צמיחת התאים.
2. שנה את המדיה לאחר היום החמישי וכל יומיים לאחר מכן עד שהתאים יהיו 90% נפגשים.

6. מעבר תאי גליה ראשוניים של מולר

1. שאפו את מדיית תרבית התאים של מולר, ואחריה 2 מ"ל שטיפה ב-PBS, ושאפו החוצה את PBS. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA (1x), או מספיק כדי לכסות את הצלחת.
2. דוגרים במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. ודא שהתאים מנותקים מהצלחת מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, אספו את תרחיף התא והוסיפו 4 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא שחומם מראש (37°C) (מוכן בשלב 1.2) לצינור האיסוף.
4. צנטריפוגה למשך 7 דקות ב 300 x גרם. לאחר שאיפת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא. מכיוון שמספר התא יכול להשתנות בהתאם למספר העיניים המנותחות, לכן, עדיף לספור את התאים לפני הזריעה והדגירה. צפיפות הזריעה המומלצת היא 3.0 x 10⁶ תאים בצלוחית T75.
   הערה: ניתן להעביר תאים עד 4-5 פעמים. עם זאת, תוצאות הניסוי העקביות ביותר נמצאות לאחר 1-2 מעברים.

7. Immunofluorescence

הערה: השתמש בפרוטוקול immunofluorescence כדי להכתים ולאמת את הספציפיות של תאי Müller. להלן סקירה קצרה של פרוטוקול immunofluorescent. שלב זה מבוצע לאחר הקטע הראשון¹².

1. זרעו את התאים בשקופית תא תרבית תאים (30,000 תאים לבאר עבור שקופית של 8 בארות).
2. תרבית את התאים המבודדים במשך 24-48 שעות בתווך תרבית תאי מולר שלם (מוכן בשלב 1.2) ב 37 ° C ו 5% CO₂.
3. שאפו החוצה את המדיה ושטפו את שקופית התא עם 250-300 μL של 1x PBS על כל באר כאשר התאים הם 80-90% במפגש.
4. תקן את המגלשה למשך 10 עד 15 דקות ב 250-300 μL של 4% paraformaldehyde על כל באר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS / TX-100 (5 דקות כל אחד / 3x).
5. הוסף מאגר חוסם למשך שעה אחת ב- 37°C (ראה טבלת חומרים).
6. יש לשאוף את התמיסה החוסמת, ולאחר מכן להוסיף את הנוגדנים הראשוניים הספציפיים לתאי מולר כדי לאשר את טוהר התאים המבודדים באמצעות גלוטמין סינטטאז ווימנטין ^5,12. דגירה במשך 3 שעות ב-37°C (באמצעות ריכוז נוגדנים של 1:100-1:200 בחיץ חוסם בנפח של 150-200 μL/slide). שטפו את המגלשה בשטיפות PBS/TX-100 (5 ו-10 דקות כל אחת).
   הערה: נוגדנים אלה נבחרו מכיוון שהם סימני היכר לזיהוי תאי מולר ולהבטחת ההצלחה והטוהר של תרבית תאי מולר.
7. מוסיפים את הנוגדן המשני (עם ריכוז נוגדנים שנע בין 1:1000 בחיץ חוסם ב-150-200 מיקרוליטר/שקופית) ודגרים במשך שעה אחת ב-37°C. לאחר מכן, שטפו עם PBS/Triton X-100, שלוש פעמים (5-10 דקות כל אחת).
8. החל טיפה של אמצעי הרכבה DAPI כדי לתייג את הגרעינים לפני כיסוי השקופית בכיסוי. הימנעו מבועות אוויר בעת הנחת הכיסוי.
9. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק את השקופית וללכוד תמונות (ראה טבלת חומרים).
   הערה: תאים ממוקמים עם DAPI ב- ex/em 359/461 בהגדלה של 10x כדי לאתר תאים; הגדלה גבוהה יותר יכולה ללכוד תאים. אורכי גל אחרים יהיו תלויים בצבע הנבחר. צבע ירוק (GFP)- ex/em 488/510. צבע אדום (Cy3)- ex/em 555/569.

תוצאות

אימות הספציפיות, הטוהר ותפקוד המחסום של תאי מולר מבודדים
כדי לאשר את הכדאיות, המורפולוגיה והתכונות הייחודיות של תאי מולר המבודדים, התאים נבדקו תחת מיקרוסקופ אור. תועדו תמונות P0 ו-P1 (איור 1A). כדי לבדוק את הזיהום של תאי מולר מבודדים בתאי RPE ולאשר את טוהרו, בוצעה צביע?...

Discussion

הבידוד של אפיתל פיגמנטי רשתית ראשוני (RPE) מעכברים תועד בעבר על ידי המעבדה שלנו. כתב יד זה מתאר פרוטוקול הדגמה מפורט לבידוד תאי מולר ראשוניים. הליך זה כולל חינוך, טיפול, נתיחה, איסוף, זריעה, תרבית ואפיון של תאי מולר שבודדו מעיני עכבר. הוא מבוסס על פרוטוקול מוצלח בעבר שנמצא בפרסומים קודמים ועל ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM (1X)	Thermo Scientific	11885084	Media to grow Müller cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase	Cell signalling	80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS)	Thermo Scientific	J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Vimentin	invitrogen	MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a