Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Özet

Retinanın birincil destek hücresi retinal glial Müller hücresidir. Tüm retina yüzeyini kaplarlar ve hem retina kan damarlarına hem de retina nöronlarına yakındırlar. Büyümeleri nedeniyle Müller hücreleri, sağlıklı bir retinada nörotransmiterlerin, retinoik asit bileşiklerinin ve iyonların (potasyum K+ gibi) alımı ve geri dönüşümü dahil olmak üzere birçok önemli görevi yerine getirir. Kan akışını düzenlemenin ve kan-retina bariyerini korumanın yanı sıra, metabolizmayı ve retinaya besin tedarikini de düzenlerler. Birincil fare Müller hücrelerini izole etmek için yerleşik bir prosedür bu el yazmasında sunulmuştur. Oküler bozuklukların çeşitli fare modellerinde yer alan altta yatan moleküler süreçleri daha iyi anlamak için Müller hücre izolasyonu mükemmel bir yaklaşımdır. Bu el yazması, farelerden Müller hücre izolasyonu için ayrıntılı bir prosedürü özetlemektedir. Enükleasyondan tohumlamaya kadar tüm süreç yaklaşık birkaç saat sürer. Tohumlamadan sonraki 5-7 gün boyunca, izole edilen hücrelerin engellenmeden büyümesine izin vermek için ortam değiştirilmemelidir. Morfoloji ve farklı immünofloresan belirteçler kullanılarak hücre karakterizasyonu süreçte daha sonra gelir. Hücreler için maksimum geçişler 3-4 katıdır.

Giriş

Müller hücreleri (MC'ler), retina dokusunda bulunan ana ve en bol bulunan glial hücrelerdir. Retina içinde yapısal bütünlük ve metabolik fonksiyonların sağlanmasında kilit oyunculardırlar¹. MC'lerin stratejik yapısı tüm retina kalınlığına yayılır ve böylece retinaya destek sağlar. İskele benzeri özelliklerine ek olarak, retinal nöronlar için metabolik işlevlere sahiptirler ve onlara glikoz ve laktat dahil olmak üzere enerji substratları sağlarlar. Bu işlevler, sağlıklı nöronal işlevi sürdürmek için çok önemlidir. Bozulmuş MC'lerin yaşa bağlı makula dejenerasyonu, diyabetik retinopati ve glokom ^2,3 dahil olmak üzere çeşitli retina hastalıklarına katkıda bulunduğu bildirilmiştir. MC'ler retinada rejeneratif tedavi için endojen hücresel kaynaklar olabilir¹. Ayrıca retinanın önemli bir bölümünü oluştururlar ve güçlü kanıtlar, bazı türlerde bu hücrelerin eksik nöronların yerine geçecek şekilde uyarılabileceğini göstermektedir². Nöronlarla faydalı bir şekilde işbirliği yaparlar ve konik olarak dallanan Müller hücrelerinin uç ayakları, kan damarlarını yoğun bir şekilde kınından çıkarır ve retinanın nöral bileşenlerini birbirine bağlar. Nöronal gelişimi ve nöronal plastisiteyi korumak için Müller hücreleri, nöronlar için yumuşak bir substrat görevi görür ve onları mekanik travmadan^{korur 3}. Ek olarak, patolojik koşullar altında, Müller hücreleri, kayıp fotoreseptörleri ve nöronları kopyalayan veya yeniden üreten nöral progenitörlere veya kök hücrelere farklılaşabilir ^2,3,4. Müller hücreleri, kendini yenileme ve farklılaşma için farklı potansiyel seviyeleri de dahil olmak üzere retinal kök hücrelerin özelliklerini korur ^5,6. Müller glial hücresi, retinayı homeostazda tutmak için nörotrofik faktörler üreten, nörotransmiterleri alan ve geri dönüştüren, iyonları uzamsal olarak tamponlayan ve kan-retina bariyerini koruyan önemli bir retina soyuna sahiptir ^7,8,9. Bu, Müller hücrelerinin retina dejenerasyonu ile ilgili hastalıkların tedavisinde hücre bazlı tedavilerde umut verici bir araç olarak potansiyelini vurgulamaktadır. Müller hücreleri, retina boyunca dağılan ve hem nöronlara hem de kan damarlarına bağlanan birincil gliadır. Retina hücrelerinin canlılığını ve stabilitesini korumak için gerekli yapısal ve metabolik desteği sağlayarak çok önemli bir koruyucu rol oynarlar. Ne yazık ki, literatürde retinadan primer Müller hücre izolasyonu için çok az protokol bulunmaktadır^10,11.

Fare birincil Müller hücrelerini güvenilir bir şekilde izole etmek ve kültürlemek için gelişmiş bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol grubumuzda Müller hücrelerini vahşi tip C57BL/6 farelerden ve transgenik farelerden izole etmek için kullanıldı^12,13. Bu protokol için 5 ila 11 günlük yaşları arasında, cinsiyet tercihi olmayan fareler kullanılır. Hücreler 4 defaya kadar geçilmiştir; bununla birlikte, P4'te şişeye yapışmayı bırakırlar ve sağlıklı bir kültür yetiştirmek zorlaşır. Kültür genellikle Retina Pigmentli Epitel (RPE) hücreleri ile kontamine olur, bu nedenle hücre hattı üzerinde herhangi bir ek deney yapmadan önce hücreler en az bir kez geçilmelidir. Geçiş, kirleticilerden daha fazla izolasyon sağlar. Bu nedenle, sunulan protokol, fare Müller hücrelerini izole etmek için hızlı ve etkili bir yol sunar, bu da daha sonra terapötik hedefleri araştırmak ve retina hastalıkları için potansiyel tedavileri değerlendirmek için güvenilir bir platform olarak kullanılabilir¹⁴.

Protokol

Hayvanlarla yapılan tüm deneyler, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO beyanına uygundur ve Hayvan Bakımı ve Kullanımı Enstitüsü Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan hayvan protokolümüze ve Oakland Üniversitesi politikalarına (protokol numarası 2022-1160) göre yapılmıştır

1. Besiyeri ve çözelti hazırlama

1. Dulbecco Modifiye Eagle Medium'u (DMEM, detaylar malzeme tablosunda) 1:1000 seyreltmede penisilin / streptomisin ile destekleyerek Müller hücre gözü solüsyonunu hazırlayın. Örneğin, 10 mL DMEM için 10 μL penisilin / streptomisin ekleyin.
   NOT: Bu, hazırlanmış basit bir serumsuz ortamdır. Ayrıca, hücre kültürü çalışması için kullanmadan önce tüm ortamı 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
2. DMEM'i %10 Fetal Sığır Serumu (FBS, ısıyla inaktive edilmiş) ve %1 penisilin / streptomisin ile destekleyerek tam birincil Müller hücre büyüme ortamını hazırlayın. Örneğin (500 mL DMEM ortamı + 50 mL FBS + 5 mL penisilin / streptomisin).
3. 200 U/mL konsantrasyonda Kollajenaz IV ile% 0.05'lik bir Tripsin-EDTA çözeltisi hazırlayın (Tripsin-EDTA, gerekli konsantrasyona ulaşmak için hesaplanan Kollajenaz IV tozu miktarını çözmek için kullanılır).

2. Enükleasyon

1. IACUC yönergelerini izleyerek CO₂ inhalasyonu kullanarak fareyi etik olarak ötenazi yapın.
   1. Kısaca, farelere minimum sıkıntı ile 2-3 dakika içinde hızlı bilinç kaybı hedefine ulaşmak için CO₂ ile oda hacminin / dakikasının% 30-70'i doluluk oranında% 100 CO₂ vermek için hayvanları CO 2 odasına yerleştirin.
   2. Fareler genç yaşta (~ 10 gün) olduğundan, uygun ötenaziyi sağlamak için ikincil bir yöntem olarak servikal çıkık yapın.
2. Çalışma alanını %70 etanol ile sterilize ettikten sonra, fareyi steril bir alt ped üzerine yerleştirin.
3. Cımbızın kollarını gözün arkasına yerleştirerek, orbital bölgeden nazikçe çekerek ve proptoza neden olmak için orbital alana 5/45 tarzı cımbızla baskı uygulayarak gözleri enükleize ederek gözleri çıkarın.
   NOT: Diseksiyondan önce diseksiyon aletlerini %70 etanol ve ardından fosfat tampon salin ile sterilize edin.
4. Gözü yavaşça enüklee ederek optik sinirin hala göze bağlı olduğundan emin olun. Optik siniri (görsel olarak beyaz kordon olarak tanımlanır) gözün arkasına çektiğinizden emin olun.
   NOT: Bu adımın mikroskop altında gerçekleştirilmesine gerek yoktur ve sterilize edilmiş bir tezgahta gerçekleştirilebilir.

3. Enükleasyonlu gözlerin tedavisi

1. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünü alüminyum folyo ile örtün ve tüpü 10 mL Müller hücre gözü solüsyonu ile doldurun.
2. Diseke edilmiş gözleri Müller hücre göz solüsyonu içeren 15 mL'lik tüpe yerleştirin ve gece boyunca veya yaklaşık 18 saat oda sıcaklığında bekletin.
3. 18 saat sonra, göz solüsyonunu boşaltın ve gözleri 2-3 mL ısıtılmış (37 ° C) fosfat tamponlu salin (PBS) ile kısa bir süre durulayın.
4. PBS'yi boşaltın ve gözleri 10 mL tripsin çözeltisi içeren 100 mm'lik bir Petri kabına taşıyın. (adım 1.3'te hazırlanmıştır).
   NOT: Tripsin, diseksiyon sırasında retina katmanlarından hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için dissosiyatif bir ajan olarak işlev gören tüm enükleasyonlu gözde kullanılır. Diseke retina, yapışkan olan ve Müller hücre kültürünü kontamine etme olasılığı en yüksek olan RPE hücreleri de dahil olmak üzere birçok hücreye sahiptir¹⁴. Mikroskobik inceleme, 5 günlük izolasyondan sonra (ilk ortam değişikliği sırasında), RPE hücrelerinin plakadan ayrıldığını ve¹³ öldüğünü açıkça gösterdi. RPE izolasyonu için kullanılan ortam, sodyum piruvat ve düşük glikoz içeren DMEM'den (Müller hücre izolasyonunda kullanılan) farklı bir bileşime sahip DMEM/F-12'dir.
5. Çanağı bir kuluçka makinesine koyun ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de 1,5 ila 2 saat inkübe edin.
6. İnkübe ettikten sonra, gözleri yaklaşık 5 mL tam primer Müller hücre büyüme ortamı içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın.

4. Diseksiyon

NOT: Bu prosedür, kültür başlığının steril ortamında gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle, davlumbaz yüzeylerinin tüm aletler ve diseksiyon mikroskobu ile birlikte %70 alkol ile iyice sterilize edilmesi önemlidir. Videonun daha iyi görünürlük ve daha net gösterim amaçları için kaputun dışında kaydedildiğini belirtmekte fayda var.

1. Diseksiyon sırasında gözleri stabilize etmeye yardımcı olmak için tabağa küçük bir parça sterilize edilmiş laboratuvar sınıfı doku yerleştirin. Diseksiyonu başlatmak için gözleri diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
   NOT: Laboratuvar sınıfı doku kullanımı, gözlerin sıvı dolu bir kapta (tam ortam) manevra yapmasını kolaylaştırarak hassas diseksiyon sağlar.
2. Bağ dokusunu, göz dışı kasları ve optik siniri çıkarmak için Vannas makası ve M5S tarzı cımbız kullanın.
   1. M5S tarzı cımbızla gözü kavrayın ve Vannas makas veya şırınga iğnesi ile ora serrata bölümünde bir kesi yapın.
      NOT: Gözün ön ve arka kısmı arasında ora serrata adı verilen açık mavi dairesel bir çizgi vardır ve bu, diseksiyon sırasında doğru yönlendirme için bir yer işareti olarak kullanılabilir.
   2. Kesi aletini M5S tarzı cımbızla kavrayın ve korneayı gözün arka kısmından çekin veya yırtın. Retinanın bütünlüğünün bozulmadan kalmasını sağlamak için küçük artışlarla çekin.
      NOT: Bu adımlar, gözün ön kısmını (Kornea, İris ve Lens) göz kabının arka kısmından (nöral ve pigmentli retinalar) çıkarmak içindir.
   3. Retina katmanlarının bütünlüğünü korumak için, retina pigmentli epiteli nazikçe çekin ve nöral retinadan çıkarın. RPE tabakası genellikle yapışkan olduğundan ve nöronal retinaya bağlı olduğundan, izolasyonun saflığını mümkün olduğunca sağlamak için nöral retinada herhangi bir siyah leke bulunmamalıdır.
   4. Hücrelerin plaka üzerinde homojen bir şekilde yayılmasını sağlamak için diseke edilen nöral retinayı bir plakada toplamadan önce küçük parçalara ayırın.
3. Nöral retinaları, 4 mL tam primer Müller hücre büyüme ortamı içeren bir T25 şişesinde plakalayın.
4. Son olarak, şişeyi bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.

5. Primer Müller glial hücrelerinin kültürlenmesi

1. Hücre büyümesini teşvik etmek için şişeyi 3-5 gün boyunca hareket ettirmeyin.
2. Beşinci günden sonra ve daha sonra hücreler% 90 birleşene kadar her gün ortamı değiştirin.

6. Primer Müller glial hücrelerinin pasajı

1. Müller hücre kültürü ortamını aspire edin, ardından PBS'de 2 mL yıkayın ve PBS'yi aspire edin. 2 mL% 0.25 Tripsin-EDTA (1x) veya plakayı kaplayacak kadar ekleyin.
2. Oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin.
3. Hücrelerin mikroskop altında plakadan ayrıldığından emin olun. Daha sonra, hücre süspansiyonunu toplayın ve toplama tüpüne 4 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) tam birincil Müller hücre büyüme ortamı (adım 1.2'de hazırlanmıştır) ekleyin.
4. 300 x g'da 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire ettikten sonra, peleti 10 mL tam birincil Müller hücre büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücre sayısı diseke edilen göz sayısına göre değişebildiğinden, tohumlama ve inkübasyondan önce hücreleri saymak daha iyidir. Önerilen tohumlama yoğunluğu, bir T75 şişesinde 3.0 x^{10 6} hücredir.
   NOT: Hücreler 4-5 defaya kadar geçirilebilir. Bununla birlikte, en tutarlı deney sonuçları 1-2 pasajdan sonra bulunur.

7. İmmünofloresan

NOT: Müller hücre özgüllüğünü boyamak ve doğrulamak için immünofloresan protokolünü kullanın. İşte immünofloresan protokolüne kısa bir genel bakış. Bu adım, ilk pasajdan¹² sonra gerçekleştirilir.

1. Hücreleri bir Hücre Kültürü Odası Slaytına tohumlayın (8 oyuklu bir oda slaytı için oyuk başına 30.000 hücre).
2. İzole edilen hücreleri 24-48 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de tam bir Müller hücre kültürü ortamında (adım 1.2'de hazırlanan) kültürleyin.
3. Ortamı aspire edin ve hücreler% 80-90 birleştiğinde hazne slaytını her bir kuyucukta 250-300 μL 1x PBS ile yıkayın.
4. Slaytı her bir oyukta 250-300 μL% 4 paraformaldehit içinde 10 ila 15 dakika sabitleyin, ardından PBS / TX-100 (her biri 5 dakika / 3x) ile yıkayın.
5. 37 ° C'de 1 saat boyunca engelleme tamponu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
6. Bloke edici çözeltiyi aspire edin, ardından glutamin sentetaz ve vimentin ^5,12 kullanarak izole edilen hücrelerin saflığını doğrulamak için Müller hücrelerine özgü birincil antikorları ekleyin. 37 ° C'de 3 saat inkübe edin (150-200 μL / slayt hacminde bloke edici tamponda 1: 100-1: 200 antikor konsantrasyonu kullanılarak). Slaytı PBS/TX-100 yıkamalarla yıkayın (her biri 5 ve 10 dakika).
   NOT: Bu antikorlar, Müller hücrelerini tanımlamak ve Müller hücre kültürünün başarısını ve saflığını sağlamak için ayırt edici özellikler oldukları için seçilmiştir.
7. İkincil antikoru ekleyin (150-200 μL/slaytta bloke edici tamponda 1:1000 arasında değişen bir antikor konsantrasyonu ile) ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Daha sonra PBS / Triton X-100 ile üç kez (her biri 5-10 dakika) yıkayın.
8. Slaytı bir lamel ile kaplamadan önce çekirdekleri etiketlemek için bir damla DAPI montaj ortamı uygulayın. Lameli yerleştirirken hava kabarcıklarından kaçının.
9. Slaytı kontrol etmek ve görüntüleri yakalamak için bir floresan mikroskobu kullanın (bkz.
   NOT: Hücreler, hücreleri bulmak için 10x büyütmede ex/em 359/461'de DAPI ile yerleştirilmiştir; Daha yüksek büyütme hücreleri yakalayabilir. Diğer dalga boyları seçilen renge bağlı olacaktır. Yeşil renk (GFP) - eski / em 488/510. Kırmızı renk (Cy3)- ex/em 555/569.

Sonuçlar

İzole edilmiş Müller hücrelerinin özgüllüğünün, saflığının ve bariyer fonksiyonunun doğrulanması
İzole edilen Müller hücrelerinin canlılığını, morfolojisini ve ayırt edici niteliklerini doğrulamak için, hücreler bir ışık mikroskobu altında incelendi. P0 ve P1 görüntüleri kaydedildi (Şekil 1A). İzole Müller hücrelerinin RPE hücreleri ile kontaminasyonunu kontrol etmek ve saflığını doğrulamak için, RPE hücre markörü RPE65'e ?...

Tartışmalar

Primer retinal pigmente epitelin (RPE) farelerden izolasyonu daha önce laboratuvarımız tarafından belgelenmiştir. Bu el yazması, birincil Müller hücrelerinin izolasyonu için ayrıntılı bir gösteri protokolünü açıklamaktadır. Bu prosedür, fare gözlerinden izole edilen Müller hücrelerinin enükleasyonu, tedavisi, diseksiyonu, toplanması, tohumlanması, kültürü ve karakterizasyonunu içerir. Daha önceki yayınlarda bulunan daha önce başarılı bir protokole ve yakın tarihli bir yayında

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM (1X)	Thermo Scientific	11885084	Media to grow Müller cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase	Cell signalling	80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS)	Thermo Scientific	J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Vimentin	invitrogen	MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a