初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

要約

この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。

要約

網膜の主要な支持細胞は、網膜グリアミュラー細胞です。それらは網膜表面全体を覆い、網膜血管と網膜ニューロンの両方に近接しています。ミュラー細胞は、その増殖により、神経伝達物質、レチノイン酸化合物、イオン(カリウムK+など)の取り込みとリサイクルなど、健康な網膜でいくつかの重要な役割を果たします。血流を調節し、血液網膜関門を維持することに加えて、それらはまた、網膜への代謝と栄養素の供給を調節します。この原稿では、マウスMüller初代細胞を単離するための確立された手順を紹介しています。眼疾患のさまざまなマウスモデルに関与する根底にある分子プロセスをよりよく理解するために、ミュラー細胞単離は優れたアプローチです。この原稿では、マウスからのミュラー細胞単離の詳細な手順を概説しています。除核から播種まで、全体のプロセスは約数時間続きます。播種後5〜7日間は、単離された細胞が妨げられずに成長できるように、培地を変更しないでください。次に、形態学と異なる免疫蛍光マーカーを用いた細胞の特性評価が、このプロセスの次となります。細胞の最大継代回数は3〜4倍です。

概要

ミュラー細胞(MC)は、網膜組織に見られる主要かつ最も豊富なグリア細胞です。彼らは、網膜¹内の構造的完全性と代謝機能を提供する主要なプレーヤーです。MCの戦略的な構造は、網膜の厚さ全体に広がっているため、網膜をサポートします。足場のような特性に加えて、それらは網膜ニューロンの代謝機能を持ち、グルコースや乳酸などのエネルギー基質を供給します。これらの機能は、健康な神経機能を維持するために重要です。MCの障害は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障など、さまざまな網膜疾患の一因となることが報告されています^2,3。MCは、網膜の再生治療のための内因性細胞源となり得る¹。それらはまた、網膜のかなりの部分を占めており、強力な証拠は、いくつかの種で、これらの細胞が欠落しているニューロンを置換するために刺激され得ることを示唆している²。それらはニューロンと有益に協力し、円錐状に分岐するミュラー細胞の端足が血管を密に引き抜き、網膜の神経成分をつなぎます。ニューロンの発達とニューロンの可塑性を維持するために、ミュラー細胞はニューロンの柔らかい基質として機能し、ニューロンを機械的外傷から保護します³。さらに、病理学的状況下では、ミュラー細胞は、失われた光受容体およびニューロンを複製または再生する神経前駆細胞または幹細胞に分化することがある^2,3,4。ミュラー細胞は、自己複製や分化のためのさまざまなレベルの可能性など、網膜幹細胞の特性を保持しています^5,6。ミュラーグリア細胞は、神経栄養因子を産生し、神経伝達物質を取り込み、リサイクルし、イオンを空間的に緩衝し、網膜を恒常性に保つために血液網膜関門を維持する重要な網膜系統を有する^7,8,9。このことは、網膜変性症に関連する疾患を治療するための細胞ベースの治療における有望なツールとしてのミュラー細胞の可能性を浮き彫りにしています。ミュラー細胞は、網膜全体に分布する主要なグリアであり、ニューロンと血管の両方につながっています。それらは重要な保護的役割を果たし、網膜細胞の生存率と安定性を維持するために不可欠な構造的および代謝的サポートを提供します。残念ながら、網膜からの初代ミュラー細胞単離に関する文献には、非常に少ないプロトコルが見つかっています^10,11。

私たちは、マウス初代ミュラー細胞を確実に単離し、培養するための強化されたアプローチを紹介します。このプロトコルは、野生型C57BL/6マウスおよびトランスジェニックマウス^12,13からMüller細胞を単離するために、我々のグループで使用された。このプロトコルには、性別の好みがない5〜11日齢のマウスが使用されます。細胞は最大4回継代されています。しかし、P4ではフラスコに付着しなくなり、健康な培養物を育てることが難しくなります。培養物は網膜色素上皮(RPE)細胞で汚染されていることが多いため、細胞株で追加の実験を行う前に、少なくとも1回は細胞を継代する必要があります。継代により、汚染物質からのさらなる分離が可能になります。したがって、提示されたプロトコルは、マウスMüller細胞を単離するための迅速かつ効果的な方法を提供し、その後、治療標的を研究し、網膜疾患の潜在的な治療法を評価するための信頼性の高いプラットフォームとして使用することができます¹⁴。

プロトコル

動物を用いたすべての実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠し、Institute for Animal Care and Use Committee(IACUC)およびオークランド大学のポリシー(プロトコル番号2022-1160)によって承認された動物プロトコルに従って行われました。

1. 培地と溶液の調製

1. Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM、材料表の詳細)にペニシリン/ストレプトマイシンを1:1000の希釈で添加することにより、Müller細胞眼液を調製します。例えば、10 mLのDMEMには、10 μLのペニシリン/ストレプトマイシンを加えます。
   注:これは調製されたシンプルな無血清培地です。また、細胞培養作業に使用する前に、培地全体を37°Cのウォーターバスで温めてください。
2. DMEMに10%ウシ胎児血清(FBS、熱不活化)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することにより、完全な初代ミュラー細胞増殖培地を調製します。たとえば、(500 mLのDMEM培地+ 50 mLのFBS+ 5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン)。.
3. 0.05% トリプシン-EDTA溶液をコラゲナーゼIVと200 U/mLの濃度で調製します(トリプシン-EDTAを使用して、計算された量のコラゲナーゼIV粉末を溶解し、必要な濃度に到達します)。

2. エヌクリーション

1. IACUCガイドラインに従って_CO2 吸入を使用してマウスを倫理的に安楽死させます。
   1. 簡単に言えば、動物をCO₂チャンバーに入れて、チャンバーvol / minの30〜70%の充填率で100%のCO_{2を導入し、マウス}への苦痛を最小限に抑えて2〜3分以内に意識を急速に失うという目標を達成する。
   2. マウスは若い年齢(~10日)であるため、適切な安楽死を確保するための二次的な方法として子宮頸部脱臼を行います。
2. 作業領域を70%エタノールで滅菌した後、マウスを滅菌アンダーパッドに置きます。
3. ピンセットの腕を目の後ろに置き、眼窩領域からそっと引っ張って眼窩領域から引き抜き、眼窩領域に5/45スタイルのピンセットで圧力を加えて眼球を摘出して眼球を伸ばします。
   注:解剖前に、解剖ツールを70%エタノールで滅菌し、続いてリン酸緩衝生理食塩水で滅菌します。
4. 視神経がまだ目に接続されていることを確認し、眼球をゆっくりと摘出します。視神経(白いコードとして視覚的に識別される)を目の後ろに引っ張るようにしてください。
   注:この手順は顕微鏡下で実行する必要はなく、滅菌されたベンチで実行できます。

3.除核眼の治療

1. 15 mLの遠心分離チューブをアルミホイルで覆い、チューブに10 mLのミュラー細胞眼液を入れます。
2. 解剖した眼球をミュラー細胞眼液が入った15mLチューブに入れ、室温で一晩または約18時間放置します。
3. 18時間後、眼液をデカンタし、2〜3 mLの温めた(37°C)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で眼を短時間すすいでください。
4. PBSをデカントし、10mLのトリプシン溶液が入った100mmのシャーレに目を移します。(ステップ1.3で準備)。
   注:トリプシンは除核眼全体に使用され、解剖中の網膜層からの細胞分離を促進する解離剤として機能します。解剖された網膜には、RPE細胞を含む多くの細胞があり、これらは粘着性があり、ミュラー細胞培養を汚染する可能性が最も高い¹⁴。顕微鏡検査では、5日間の単離後(最初の培地交換中)に、RPE細胞がプレートから剥離して¹³個死んだことが明確に示されました。RPE単離に使用される培地はDMEM/F-12で、DMEM(ミュラー細胞単離に使用)とは異なる組成で、ピルビン酸ナトリウムと低グルコースが含まれています。
5. ディッシュをインキュベーターに入れ、37°Cおよび5%CO₂で1.5〜2時間インキュベートします。
6. インキュベート後、約5 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地が入った60 mmのシャーレに眼球を移します。

4. 解剖

注:この手順は、培養フードの無菌環境内で実行する必要があります。したがって、フードの表面を70%アルコールで徹底的に滅菌し、すべてのツールと解剖顕微鏡を滅菌することが不可欠です。ビデオは、視認性を高め、デモンストレーションの目的でボンネットの外で録画されたことは注目に値します。

1. 滅菌したラボグレードの組織の小片を皿に入れて、解剖中の目を安定させます。解剖顕微鏡の下に目を置き、解剖を開始します。
   注:ラボグレードの組織を使用すると、液体で満たされた皿(完全なメディア)での目の操作が容易になり、正確な解剖が保証されます。
2. バンナスのハサミとM5Sスタイルのピンセットを使用して、結合組織、外眼筋、視神経を切除します。
   1. M5Sスタイルのピンセットで目をつかみ、バンナスのハサミまたは注射器の針でオラセラータセクションを切開します。
      注:眼の前部と後部の間には、ora serrataと呼ばれる水色の円形の線があり、解剖中の正確な方向の目印として使用できます。
   2. M5Sスタイルのピンセットで切開部をつかみ、目の後部から角膜を引っ張るか引き裂きます。網膜の完全性が損なわれないように、少しずつ引っ張ります。
      注:これらの手順は、アイカップの後部(神経および色素性網膜)から目の前部(角膜、虹彩、およびレンズ)を取り除くためのものです。
   3. 網膜層の完全性を維持するために、神経網膜から網膜色素上皮をそっと引っ張って取り除きます。RPE層は通常粘着性があり、ニューロン網膜に付着しているため、神経網膜には、分離の純度を可能な限り確保するために、黒い斑点がないようにする必要があります。
   4. 解剖した神経網膜をプレートに集める前に細かく切ってから、プレート上の細胞が均一に広がるようにします。
3. 4 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地を含むT25フラスコに神経網膜を播種します。
4. 最後に、フラスコをインキュベーターに入れ、37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。

5. ミュラー初代グリア細胞の培養

1. 細胞の成長を促進するために、フラスコを3〜5日間動かさないでください。
2. 5日目以降は培地を交換し、その後は細胞が90%コンフルエントになるまで1日おきに交換します。

6. ミュラー初代グリア細胞の継代

1. Müller細胞培養培地を吸引し、続いてPBSで2 mLの洗浄を行い、PBSを吸引します。0.25% Trypsin-EDTA(1x)を2 mL、またはプレートを覆うのに十分な量を加えます。
2. 室温で5〜10分間インキュベートします。
3. 顕微鏡下で細胞がプレートから剥離していることを確認します。次に、細胞懸濁液を回収し、予熱した4 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地(ステップ1.2で調製)を回収チューブに加えます。
4. 300 x gで7分間遠心分離します。上清を吸引した後、ペレットを10 mLの完全初代ミュラー細胞増殖培地に再懸濁します。細胞数は解剖した眼の数によって異なる可能性があるため、播種やインキュベーションの前に細胞を数えることをお勧めします。推奨される播種密度は、T75フラスコ中の3.0 x 10⁶ セルです。
   注:細胞は最大4〜5回継代できます。ただし、最も一貫性のある実験結果は、1〜2回の継代後に見つかります。

7. 免疫蛍光

注:免疫蛍光プロトコールを使用して、ミュラー細胞の特異性を染色および検証します。ここでは、免疫蛍光プロトコルの簡単な概要を示します。このステップは、第1のパッセージ¹²の後に行われる。

1. 細胞を細胞培養チャンバースライド(8ウェルチャンバースライドでウェルあたり30,000細胞)に播種します。
2. 単離した細胞を、37°Cおよび5%CO₂の完全ミュラー細胞培養培地(ステップ1.2で調製)で24〜48時間培養します。
3. 培地を吸引し、細胞が80〜90%コンフルエントになったら、各ウェルに250〜300μLの1x PBSでチャンバースライドを洗浄します。
4. スライドを各ウェル上の4%パラホルムアルデヒドの250-300μLで10〜15分間固定し、続いてPBS/TX-100で洗浄します(各5分/3x)。
5. ブロッキングバッファーを37°Cで1時間加えます( 材料表を参照)。
6. ブロッキング溶液を吸引し、次にMüller細胞に特異的な一次抗体を添加して、グルタミンシンテターゼとビメンチン^5,12を使用して単離された細胞の純度を確認します。37°Cで3時間インキュベートします(150-200 μL/スライドの容量のブロッキングバッファー中の抗体濃度1:100-1:200を使用)。スライドをPBS / TX-100洗浄(各5分および10分)で洗浄します。
   注:これらの抗体は、ミュラー細胞を同定し、ミュラー細胞培養の成功と純度を確保するための特徴であるため、選択されました。
7. 二次抗体(抗体濃度が1:1000の範囲のブロッキングバッファー、150-200 μL/スライド)を添加し、37°Cで1時間インキュベートします。 その後、PBS/Triton X-100で3回(各5〜10分)洗浄します。
8. DAPI封入剤を一滴塗布して核を標識し、スライドをカバースリップで覆います。カバースリップを置くときは気泡を避けてください。
9. 蛍光顕微鏡を使用してスライドを確認し、画像を撮影します( 資料の表を参照)。
   注:セルは、細胞を見つけるために10倍の倍率でex / em 359/461のDAPIで配置されます。倍率が高いほど細胞を捕捉できます。他の波長は、選択した色によって異なります。緑色(GFP)-ex/em 488/510。赤色(Cy3) - ex/em 555/569。

結果

単離されたMüller細胞の特異性、純度、およびバリア機能の検証
単離されたミュラー細胞の生存率、形態、および独特の性質を確認するために、細胞を光学顕微鏡で調べました。P0およびP1の画像が記録されました(図1A)。単離されたミュラー細胞のRPE細胞によるコンタミネーションをチェックし、その純度を確認するために、RPE細胞マーカーであるRPE65に?...

ディスカッション

マウスからの一次網膜色素上皮(RPE)の単離は、以前に私たちの研究室によって文書化されました。この原稿では、Müller初代細胞単離の詳細なデモンストレーションプロトコルについて説明します。この手順には、マウスの眼から単離されたMüller細胞の核出術、処理、解剖、収集、播種、培養、および特性評価が含まれます。これは、以前の出版物で見つかった以前に成功したプロトコルと、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM (1X)	Thermo Scientific	11885084	Media to grow Müller cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase	Cell signalling	80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS)	Thermo Scientific	J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Vimentin	invitrogen	MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a