Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

요약

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 절개로 시작하여 Müller 세포의 분리, 파종 및 배양으로 이어집니다.

초록

망막의 주요 지지 세포는 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)입니다. 그들은 전체 망막 표면을 덮고 있으며 망막 혈관과 망막 뉴런 모두에 매우 근접해 있습니다. 뮐러 세포는 성장하기 때문에 건강한 망막에서 신경전달물질, 레티노산 화합물 및 이온(예: 칼륨 K+)의 흡수 및 재활용을 포함하여 여러 가지 중요한 작업을 수행합니다. 혈류를 조절하고 혈액-망막 장벽을 유지하는 것 외에도 신진대사와 망막에 영양분 공급을 조절합니다. 이 원고에는 1차 마우스 Müller 세포를 분리하기 위한 확립된 절차가 제시되어 있습니다. 안구 질환의 다양한 마우스 모델과 관련된 기본 분자 과정을 더 잘 이해하기 위해 Müller 세포 분리는 탁월한 접근 방식입니다. 이 원고는 마우스에서 Müller 세포를 분리하기 위한 자세한 절차를 간략하게 설명합니다. 적출에서 파종에 이르기까지 전체 과정은 약 몇 시간 동안 지속됩니다. 파종 후 5-7일 동안은 분리된 세포가 방해받지 않고 자랄 수 있도록 배지를 변경해서는 안 됩니다. 형태학과 뚜렷한 면역형광 마커를 사용한 세포 특성 분석은 프로세스의 다음 단계입니다. 세포의 최대 통로는 3-4회입니다.

서문

뮐러 세포(Müller cell, MC)는 망막 조직에서 발견되는 가장 풍부하고 주요한 신경교세포(glial cell)입니다. 그들은 망막 내에서 구조적 무결성과 대사 기능을 제공하는 데 핵심적인 역할을 합니다¹. MC의 전략적 구조는 망막 두께 전체에 퍼져 있어 망막을 지지합니다. 스캐폴드와 같은 특성 외에도 망막 뉴런의 대사 기능을 가지고 있어 포도당과 젖산을 포함한 에너지 기질을 공급합니다. 이러한 기능은 건강한 신경 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다. 손상된 MC는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 및 녹내장을 포함한 다양한 망막 질환에 기여하는 것으로 보고되었습니다 ^2,3. MC는 망막의 재생 치료를 위한 내인성 세포 공급원이 될 수 있다¹. 이들은 또한 망막의 상당 부분을 구성하며, 강력한 증거에 따르면 여러 종에서 이러한 세포가 누락된 뉴런을 대체하도록 자극될 수 있습니다². 망막은 뉴런과 유익하게 협력하며, 원뿔 모양으로 분지된 뮐러 세포의 끝 부분은 혈관을 조밀하게 풀어내고 망막의 신경 구성 요소를 연결합니다. 뉴런 발달과 뉴런 가소성을 유지하기 위해 뮐러 세포는 뉴런의 부드러운 기질로 작용하여 기계적 외상으로부터 뉴런을 보호한다³. 또한 병리학적 상황에서 Müller 세포는 손실된 광수용체와 뉴런을 복제하거나 재생하는 신경 전구 세포 또는 줄기 세포로 분화할 수^{있습니다 2,3,4}. 뮐러 세포(Müller cell)는 자기 재생 및 분화(self-renewal and differentiation)를 위한 다양한 수준의 잠재력을 포함하여 망막 줄기 세포의 특성을 유지합니다 ^5,6. 뮐러 신경교세포(Müller glial cell)는 신경영양인자(neurotrophic factor)를 생성하고, 신경전달물질을 흡수 및 재활용하며, 이온을 공간적으로 완충하고, 망막의 항상성을 유지하기 위해 혈액-망막 장벽을 유지하는 중요한 망막 계통을 가지고 있습니다 ^7,8,9. 이는 망막 변성과 관련된 질병을 치료하기 위한 세포 기반 치료에서 유망한 도구로서 Müller 세포의 잠재력을 강조합니다. 뮐러 세포(Müller cell)는 망막 전체에 분포되어 있는 주요 신경교세포(glia)로, 뉴런과 혈관에 연결되어 있습니다. 망막 세포는 망막 세포의 생존력과 안정성을 유지하기 위해 필수적인 구조적 및 대사적 지원을 제공하는 중요한 보호 역할을 합니다. 불행히도, 문헌에서 망막^10,11로부터의 일차 뮐러 세포 분리에 대한 프로토콜은 거의 발견되지 않는다.

당사는 mouse primary Müller 세포를 신뢰성 있게 분리하고 배양하기 위한 향상된 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜은 야생형 C57BL/6 마우스 및 형질전환 마우스^12,13에서 Müller 세포를 분리하기 위해 우리 그룹에서 사용되었습니다. 성별 선호도가 없는 5일에서 11일 사이의 생쥐가 이 프로토콜에 사용됩니다. 세포는 최대 4 번 통과되었습니다. 그러나 P4가 되면 플라스크에 더 이상 붙지 않게 되고, 건강한 문화를 성장시키기가 어려워집니다. 배양액은 종종 RPE(Retinal Pigmented Epithelial) 세포로 오염되므로 세포주에 대한 추가 실험을 수행하기 전에 세포를 한 번 이상 통과시켜야 합니다. Passaging을 통해 오염 물질로부터 추가로 격리할 수 있습니다. 따라서 제시된 프로토콜은 마우스 뮐러 세포를 분리하는 빠르고 효과적인 방법을 제공하며, 이는 치료 표적을 연구하고 망막 질환에 대한 잠재적 치료법을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼으로 사용될 수 있습니다¹⁴.

프로토콜

동물을 대상으로 한 모든 실험은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명을 준수했으며 IACUC(Institute for Animal Care and Use Committee) 및 오클랜드 대학교 정책(프로토콜 번호 2022-1160)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 매체 및 용액 준비

1. 1:1000으로 희석하여 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM, 재료 표의 세부 정보)을 페니실린/스트렙토마이신으로 보충하여 Müller 세포 안구 용액을 준비합니다. 예를 들어, DMEM 10mL의 경우 페니실린/스트렙토마이신 10μL를 추가합니다.
   참고: 이 제품은 제조된 간단한 무혈청 배지입니다. 또한 세포 배양 작업에 사용하기 전에 전체 배지를 37°C 수조에서 데우십시오.
2. DMEM에 10% 소 태아 혈청(FBS, 열 비활성화) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충하여 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지를 준비합니다. 예: (DMEM 배지 500mL + FBS 50mL + 페니실린/스트렙토마이신 5mL).
3. 200U/mL 농도의 콜라겐분해효소 IV와 함께 0.05% 트립신-EDTA 용액을 준비합니다(트립신-EDTA는 필요한 농도에 도달하기 위해 계산된 양의 콜라겐분해효소 IV 분말을 용해하는 데 사용됨).

2. 적출

1. IACUC 지침에 따라 CO₂ 흡입을 사용하여 마우스를 윤리적으로 안락사시킵니다.
   1. 간단히 말해서, 동물을 CO₂ 챔버에 넣어 100 % CO₂ 를 CO₂ 로 챔버 부피 / 분의 30-70 %의 충전 비율로 도입하여 마우스에 대한 고통을 최소화하면서 2-3 분 이내에 빠른 무의식 목표를 달성합니다.
   2. 생쥐는 어린 나이(~10일)이기 때문에 적절한 안락사를 보장하기 위한 2차 방법으로 자궁경부 탈구를 수행합니다.
2. 작업 영역을 70% 에탄올로 멸균한 후 멸균 언더패드에 마우스를 놓습니다.
3. 핀셋의 팔을 눈 뒤쪽에 위치시키고 안와 부위를 부드럽게 잡아 당겨 눈을 추출하고 5/45 스타일의 핀셋으로 안와 부위에 압력을 가하여 눈을 적출하여 돌출부를 일으킵니다.
   알림: 해부 전에 70% 에탄올로 해부 도구를 소독한 다음 인산염 완충 식염수로 소독하십시오.
4. 눈을 천천히 적출하여 시신경이 여전히 눈과 연결되어 있는지 확인하십시오. 시신경(시각적으로 흰색 끈으로 식별됨)을 눈 뒤로 당겨야 합니다.
   참고: 이 단계는 현미경으로 수행할 필요가 없으며 멸균된 벤치에서 수행할 수 있습니다.

3. 적출된 눈의 치료

1. 15mL 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 튜브에 10mL의 Müller cell eye 용액을 채웁니다.
2. 절개된 눈을 Müller 세포 안구 용액이 들어 있는 15mL 튜브에 넣고 실온에서 하룻밤 또는 약 18시간 동안 그대로 둡니다.
3. 18시간 후 아이 용액을 디캔팅하고 따뜻한(37°C) 인산염 완충 식염수(PBS) 2-3mL로 눈을 잠시 헹굽니다.
4. PBS를 디캔팅하고 눈을 10mL의 트립신 용액이 들어 있는 100mm 페트리 접시로 이동합니다. (1.3 단계에서 준비).
   참고: 트립신은 적출된 눈 전체에 사용되며, 박리 중에 망막층에서 세포를 분리하는 것을 용이하게 하는 해리제 역할을 합니다. 절개된 망막에는 RPE 세포를 포함한 많은 세포가 있는데, 이 세포들은 끈적거리고 Müller 세포 배양을 오염시킬 가능성이 가장 높다¹⁴. 현미경 검사는 5일 동안 분리한 후(첫 번째 배지 교체 중) RPE 세포가 플레이트에서 분리되어 죽었다는 것을 명확하게 보여주었습니다¹³. RPE 분리에 사용되는 배지는 DMEM/F-12이며, DMEM(Müller 세포 분리에 사용)과 조성이 다르며 피루브산나트륨과 저포도당을 함유하고 있습니다.
5. 접시를 인큐베이터에 넣고 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 1.5-2 시간 동안 배양합니다.
6. 배양 후 약 5mL의 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 눈을 옮깁니다.

4. 해부

참고: 이 절차는 배양 후드의 멸균 환경에서 수행해야 합니다. 따라서 모든 도구 및 해부 현미경과 함께 후드 표면을 70% 알코올로 철저히 살균하는 것이 중요합니다. 비디오는 더 나은 가시성과 더 명확한 시연 목적을 위해 후드 외부에서 녹화되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다.

1. 멸균된 실험실 등급 조직의 작은 조각을 접시에 넣어 해부 중에 눈을 안정시키는 데 도움이 됩니다. 눈을 해부 현미경 아래에 놓고 해부를 시작합니다.
   알림: 실험실 등급의 조직을 사용하면 액체가 채워진 접시(완전한 미디어)에서 눈의 움직임을 용이하게 하여 정확한 절개를 보장합니다.
2. Vannas 가위와 M5S 스타일 핀셋을 사용하여 결합 조직, 외안근 및 시신경을 제거합니다.
   1. M5S 스타일 핀셋으로 눈을 잡고 Vannas 가위 또는 주사기 바늘로 ora serrata 부분을 절개합니다.
      참고: 눈의 앞쪽과 뒤쪽 부분 사이에는 오라 세라타(ora serrata)라고 하는 연한 파란색 원형 선이 있으며, 이는 절개 중 정확한 방향을 위한 랜드마크로 사용할 수 있습니다.
   2. M5S 스타일의 핀셋으로 절개 부위를 잡고 눈의 뒤쪽에서 각막을 당기거나 찢습니다. 망막의 무결성이 손상되지 않도록 조금씩 당깁니다.
      참고: 이 단계는 안구의 뒤쪽 부분(신경 및 색소 망막)에서 눈의 앞부분(각막, 홍채 및 수정체)을 제거하는 것입니다.
   3. 망막층의 온전함을 유지하려면 신경 망막에서 망막 색소 상피를 부드럽게 당겨 제거합니다. 신경 망막은 가능한 한 격리의 순도를 보장하기 위해 검은 반점이 없어야 하는데, RPE 층은 일반적으로 끈적거리고 신경 망막에 붙어 있기 때문입니다.
   4. 절개된 신경 망막을 작은 조각으로 잘라 접시에 모아 접시에 세포가 균일하게 퍼지도록 합니다.
3. 4mL의 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지가 들어 있는 T25 플라스크에 신경 망막을 플레이트합니다.
4. 마지막으로 플라스크를 인큐베이터에 넣고 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 배양합니다.

5. primary Müller glial cell의 배양

1. 세포 성장을 촉진하기 위해 3-5일 동안 플라스크를 움직이지 마십시오.
2. 5일째 되는 날과 그 이후에는 세포가 90% 합류할 때까지 격일로 매체를 교체합니다.

6. 일차 Müller 신경교세포(primary Müller glial cells)의 passaging

1. Müller 세포 배양 배지를 흡인한 다음 PBS에서 2mL의 세척을 하고 PBS를 흡인합니다. 0.25% 트립신-EDTA(1x) 2mL 또는 플레이트를 덮을 만큼의 첨가합니다.
2. 실온에서 5-10분 동안 배양합니다.
3. 현미경 아래의 플레이트에서 셀이 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하고 4mL의 사전 따뜻한(37°C) 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지(1.2단계에서 준비)를 수집 튜브에 추가합니다.
4. 300 x g에서 7분 동안 원심분리기. 상층액을 흡인한 후 펠릿을 10mL의 완전한 1차 Müller 세포 성장 배지에 재현탁시킵니다. 세포 수는 절개된 눈의 수에 따라 달라질 수 있기 때문에 파종 및 배양 전에 세포를 세는 것이 좋습니다. 권장되는 파종 밀도는 T75 플라스크에서 3.0 x 10⁶ 셀입니다.
   알림: 세포는 최대 4-5회까지 통과할 수 있습니다. 그러나 가장 일관된 실험 결과는 1-2 구절 후에 발견됩니다.

7. 면역형광(Immunofluorescence)

참고: 면역형광 프로토콜을 사용하여 Müller 세포 특이성을 염색하고 검증하십시오. 다음은 immunofluorescent protocol에 대한 간략한 개요입니다. 이 단계는 첫 번째 구절¹² 이후에 수행됩니다.

1. 세포를 Cell Culture Chamber Slide(8웰 챔버 슬라이드의 경우 웰당 30,000개의 세포)에 파종합니다.
2. 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 완전한 Müller 세포 배양 배지 (단계 1.2에서 준비)에서 24-48 시간 동안 분리 된 세포를 배양합니다.
3. 매체를 흡인하고 셀이 250-300% 합류할 때 각 웰에 1x PBS의 250-90μL로 챔버 슬라이드를 세척합니다.
4. 각 웰의 250-300 μL에 4% 파라포름알데히드를 넣고 10-15분 동안 슬라이드를 고정한 다음 PBS/TX-100(각 5분/3회)으로 세척합니다.
5. 37°C에서 1시간 동안 차단 버퍼를 추가합니다( 재료 표 참조).
6. 차단 용액을 흡인한 다음 Müller 세포에 특이적인 1차 항체를 추가하여 글루타민 합성효소 및 비멘틴 ^5,12를 사용하여 분리된 세포의 순도를 확인합니다. 37 °C에서 3 시간 동안 배양합니다 (150-200 μL/slide 부피의 차단 완충액에서 1:100-1:200의 항체 농도 사용). PBS/TX-100 세척(각 5분 및 10분)으로 슬라이드를 세척합니다.
   참고: 이러한 항체는 Müller 세포를 식별하고 Müller 세포 배양의 성공과 순도를 보장하기 위한 특징이기 때문에 선택되었습니다.
7. 2차 항체(150-200 μL/슬라이드의 차단 완충액에서 1:1000 범위의 항체 농도)를 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS/Triton X-100으로 3회(각 5-10분) 세척합니다.
8. 커버슬립으로 슬라이드를 덮기 전에 DAPI 장착 매체 한 방울을 적용하여 핵에 라벨을 붙입니다. 커버슬립을 놓을 때 기포를 피하십시오.
9. 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인하고 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조).
   참고: 셀은 10x 배율에서 359/461 (예: 10x 배율)에서 DAPI로 위치합니다. 더 높은 배율은 세포를 캡처할 수 있습니다. 다른 파장은 선택한 색상에 따라 다릅니다. 녹색(GFP)- 예: 488/510. 붉은 색 (Cy3) - 예 / em 555/569.

결과

분리된 Müller 세포의 특이성, 순도 및 장벽 기능 검증
분리된 Müller 세포의 생존력, 형태 및 독특한 특성을 확인하기 위해 세포를 광학 현미경으로 검사했습니다. P0 및 P1 이미지가 기록되었습니다(그림 1A). RPE 세포로 분리된 Müller 세포의 오염을 확인하고 순도를 확인하기 위해 RPE 세포 마커인 RPE65에 특이적인 항체를 사용하여 면역형광 염색(IF)을 수행했습니?...

토론

생쥐에서 원발성 망막 색소 상피(RPE)를 분리하는 것은 이전에 우리 연구실에서 문서화되었습니다. 이 원고는 1차 Müller 세포 분리를 위한 자세한 시연 프로토콜을 설명합니다. 이 절차에는 쥐의 눈에서 분리한 Müller 세포의 적출, 치료, 절개, 수집, 파종, 배양 및 특성 분석이 포함됩니다. 이는 이전 간행물에서 발견된 이전에 성공한 프로토콜과 최근 간행물^{1 ...}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM (1X)	Thermo Scientific	11885084	Media to grow Müller cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase	Cell signalling	80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS)	Thermo Scientific	J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Vimentin	invitrogen	MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a