Выделение первичных глиальных клеток Мюллера сетчатки мыши

Резюме

В данной рукописи описан подробный протокол выделения глиальных клеток Мюллера сетчатки из глаз мышей. Протокол начинается с энуклеации и диссекции глаз мыши, за которыми следует выделение, посев и культивирование клеток Мюллера.

Аннотация

Первичной опорной клеткой сетчатки является глиальная клетка Мюллера сетчатки. Они покрывают всю поверхность сетчатки и находятся в непосредственной близости как к кровеносным сосудам сетчатки, так и к нейронам сетчатки. Из-за своего роста клетки Мюллера выполняют несколько важных задач в здоровой сетчатке, включая поглощение и переработку нейротрансмиттеров, соединений ретиноевой кислоты и ионов (например, калия K+). Помимо регуляции кровотока и поддержания гемато-ретинального барьера, они также регулируют обмен веществ и поступление питательных веществ к сетчатке. В данной рукописи представлена установленная процедура выделения первичных мышиных клеток Мюллера. Чтобы лучше понять молекулярные процессы, лежащие в основе различных моделей глазных заболеваний у мышей, выделение клеток Мюллера является отличным подходом. В данной рукописи подробно описана процедура выделения клеток Мюллера от мышей. От энуклеации до посева весь процесс длится около нескольких часов. В течение 5-7 дней после посева среду не следует менять, чтобы выделенные клетки могли беспрепятственно расти. Далее следует характеристика клеток с использованием морфологии и различных иммунофлуоресцентных маркеров. Максимальные проходы для клеток – 3-4 раза.

Введение

Клетки Мюллера (МЦ) являются основными и наиболее распространенными глиальными клетками, обнаруженными в ткани сетчатки. Они играют ключевую роль в обеспечении структурной целостности и метаболических функций в сетчатке¹. Стратегическая структура МК распределена по всей толщине сетчатки, тем самым обеспечивая поддержку сетчатки. В дополнение к своим скаффолдоподобным свойствам, они выполняют метаболические функции для нейронов сетчатки, снабжая их энергетическими субстратами, включая глюкозу и лактат. Эти функции имеют решающее значение для поддержания здоровой функции нейронов. Сообщалось, что нарушенные МК способствуют развитию различных заболеваний сетчатки, включая возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию и глаукому ^2,3. МК могут быть эндогенными клеточными источниками для регенеративной терапии в сетчатке¹. Они также составляют значительную часть сетчатки, и убедительные данные свидетельствуют о том, что у некоторых видов эти клетки могут быть стимулированы для замены отсутствующих^{нейронов.} Они благотворно взаимодействуют с нейронами, а конически ветвящиеся концевые ноги клеток Мюллера плотно обнажают кровеносные сосуды и соединяют нейронные компоненты сетчатки. Для того чтобы поддерживать развитие нейронов и их пластичность, клетки Мюллера выступают в качестве мягкого субстрата для нейронов, защищая их от механических травм³. Кроме того, при патологических обстоятельствах клетки Мюллера могут дифференцироваться в нейральные предшественники или стволовые клетки, которые реплицируют или регенерируют утраченные фоторецепторы и нейроны ^2,3,4. Клетки Мюллера сохраняют характеристики стволовых клеток сетчатки, включая различные уровни потенциала к самообновлению и дифференцировке ^5,6. Глиальная клетка Мюллера имеет значительную линию сетчатки, которая продуцирует нейротрофические факторы, поглощает и перерабатывает нейротрансмиттеры, пространственно буферизует ионы и поддерживает гематематический барьер для поддержания сетчатки в гомеостазе ^7,8,9. Это подчеркивает потенциал клеток Мюллера в качестве многообещающего инструмента в клеточной терапии для лечения заболеваний, связанных с дегенерацией сетчатки. Клетки Мюллера — это первичная глия, распределенная по всей сетчатке, соединяющаяся как с нейронами, так и с кровеносными сосудами. Они играют решающую защитную роль, обеспечивая необходимую структурную и метаболическую поддержку для поддержания жизнеспособности и стабильности клеток сетчатки. К сожалению, в литературе найдено очень мало протоколов для первичного выделения клеток Мюллера из сетчатки^10,11.

Мы представляем усовершенствованный подход к надежной изоляции и культивированию первичных клеток Мюллера у мышей. Этот протокол был использован в нашей группе для выделения клеток Мюллера от мышей дикого типа C57BL/6 и трансгенных мышей^12,13. Для этого протокола используются мыши в возрасте от 5 до 11 дней, не имеющие предпочтений по половому признаку. Клетки были пройдены до 4 раз; однако на Р4 они перестают прилипать к колбе, и выращивать здоровую культуру становится сложно. Культура часто контаминируется клетками пигментированного эпителия сетчатки (РПЭ), поэтому клетки должны быть пропущены по крайней мере один раз перед проведением каких-либо дополнительных экспериментов на клеточной линии. Пассаж обеспечивает дальнейшую изоляцию от загрязняющих веществ. Таким образом, представленный протокол предлагает быстрый и эффективный способ выделения мышиных клеток Мюллера, которые затем могут быть использованы в качестве надежной платформы для исследования терапевтических мишеней и оценки потенциальных методов^{лечения заболеваний} сетчатки.

протокол

Все эксперименты на животных соответствовали заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и проводились в соответствии с нашим протоколом для животных, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) и политикой Оклендского университета (протокол No 2022-1160)

1. Подготовка сред и растворов

1. Приготовьте раствор для глаз с клетками Мюллера, добавив модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM, подробности в таблице материалов) пенициллином/стрептомицином в разведении 1:1000. Например, на 10 мл DMEM добавьте 10 мкл пенициллина/стрептомицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это простая среда, приготовленная без сыворотки. Кроме того, нагрейте готовую среду на водяной бане при температуре 37 °C перед использованием для работы с клеточными культурами.
2. Приготовьте полную первичную питательную среду для клеток Мюллера, добавив в DMEM 10% фетальную сыворотку крупного рогатого скота (FBS, инактивированную при нагревании) и 1% пенициллин/стрептомицин. Например (500 мл среды DMEM + 50 мл FBS + 5 мл пенициллина/стрептомицина).
3. Приготовьте 0,05% раствор Трипсин-ЭДТА с Коллагеназой IV в концентрации 200 Ед/мл (Трипсин-ЭДТА используется для растворения рассчитанного количества порошка Коллагеназы IV для достижения необходимой концентрации).

2. Энуклеация

1. Этично усыпьте мышь с помощью ингаляции_CO2 в соответствии с рекомендациями IACUC.
   1. Вкратце, поместите животное (животных) в камеру с_СО2 , чтобы ввести 100%_СО2 со скоростью заполнения 30-70% объема/мин камеры с_СО2 для достижения цели быстрой потери сознания в течение 2-3 минут с минимальным дискомфортом для мышей.
   2. Поскольку мыши находятся в молодом возрасте (~10 дней), выполняйте вывих шейки матки в качестве вторичного метода, чтобы обеспечить надлежащую эвтаназию.
2. После стерилизации рабочей зоны 70% этанолом поместите мышь на стерильную подкладку.
3. Извлеките глаза, поместив дужки пинцета в заднюю часть глаза, осторожно потянув за орбитальную область, и энуклеируйте глаза, надавливая пинцетом в стиле 5/45 на орбитальную область, чтобы вызвать проптоз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед вскрытием стерилизуйте инструменты для вскрытия 70% этанолом с последующим добавлением фосфатного буферного раствора.
4. Убедитесь, что зрительный нерв все еще соединен с глазом, путем медленной энуклеации глаза. Обязательно потяните зрительный нерв (визуально идентифицируемый как белый шнур) за глазом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не обязательно должен выполняться под микроскопом, и может быть выполнен на стерилизованном столе.

3. Лечение энуклеированных глаз

1. Накройте пробирку центрифуги объемом 15 мл алюминиевой фольгой и заполните пробирку 10 мл раствора для глаз клеток Мюллера.
2. Поместите рассеченные глаза в пробирку объемом 15 мл с раствором для глаз из клеток Мюллера и оставьте их на ночь или около 18 часов при комнатной температуре.
3. Через 18 ч сцедите глазной раствор и кратковременно промойте глаза 2-3 мл подогретого (37 °C) фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).
4. Сцедите PBS и переместите глаза в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 10 мл раствора трипсина. (подготовлено на шаге 1.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин используется на всем энуклеированном глазу, действуя как диссоциативный агент для облегчения отделения клеток от слоев сетчатки во время диссекции. Вскрытая сетчатка содержит множество клеток, в том числе клетки RPE, которые являются липкими и, скорее всего, загрязняют культуру клеток Мюллера¹⁴. Микроскопическое исследование наглядно показало, что после 5 дней изоляции (при первой смене среды) клетки РПЭ отделились от пластины и погибли¹³ человек. Средой, используемой для выделения РПЭ, является DMEM/F-12, с составом, отличным от DMEM (используемого при выделении клеток Мюллера), содержащей пируват натрия и низкое содержание глюкозы.
5. Поместите чашку в инкубатор и инкубируйте от 1,5 до 2 часов при 37 °C и 5% CO₂.
6. После инкубации перенесите глаза в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую примерно 5 мл полной первичной среды для роста клеток Мюллера.

4. Вскрытие

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна проводиться в стерильной среде капюшона. Следовательно, важно тщательно простерилизовать поверхности вытяжки 70% спиртом, а также все инструменты и микроскоп для вскрытия. Стоит отметить, что видео было записано вне капота для лучшей видимости и более четких демонстрационных целей.

1. Положите в чашку небольшой кусочек стерилизованной лабораторной салфетки, чтобы стабилизировать глаза во время вскрытия. Поместите глаза под препарирующий микроскоп, чтобы начать вскрытие.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование лабораторной ткани облегчает маневрирование глаз в наполненной жидкостью чашке (полная среда), обеспечивая точное рассечение.
2. Используйте ножницы Vannas и пинцет в стиле M5S, чтобы удалить соединительную ткань, экстраокулярные мышцы и зрительный нерв.
   1. Захватите глаз пинцетом в стиле M5S и сделайте надрез в области ora пильчатой с помощью ножниц Vannas или иглы шприца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует светло-голубая круговая линия между передней и задней частями глаза, называемая ora serrata, которая может быть использована в качестве ориентира для точного направления во время вскрытия.
   2. Захватите разрез пинцетом в стиле M5S и вытяните или оторвите роговицу от задней части глаза. Потяните с небольшим шагом, чтобы целостность сетчатки оставалась неповрежденной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги направлены на удаление передней части глаза (роговицы, радужной оболочки и хрусталика) из задней части наглазника (нервная и пигментированная сетчатка).
   3. Чтобы сохранить целостность слоев сетчатки, осторожно потяните и удалите пигментный эпителий сетчатки из нервной сетчатки. Нервная сетчатка должна быть свободна от каких-либо черных пятен, чтобы обеспечить максимальную чистоту изоляции, так как слой RPE обычно липкий и прикреплен к нейрональной сетчатке.
   4. Разрежьте рассеченную нервную сетчатку на мелкие кусочки перед тем, как собрать ее в пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток на пластине.
3. Поместите нервную сетчатку в колбу T25, содержащую 4 мл полной первичной среды для роста клеток Мюллера.
4. Наконец, поместите колбу в инкубатор и инкубируйте при 37 °C и 5%_CO2.

5. Культивирование первичных глиальных клеток Мюллера

1. Не перемещайте колбу в течение 3-5 дней, чтобы способствовать росту клеток.
2. Меняйте среду после пятого дня и через день после этого до тех пор, пока клетки не слияются на 90%.

6. Пассирование первичных глиальных клеток Мюллера

1. Аспирируйте питательную среду для клеточных культур Мюллера, а затем 2 мл промывки в PBS и аспирируйте PBS. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА (1x) или достаточно, чтобы покрыть пластину.
2. Выдерживать 5-10 минут при комнатной температуре.
3. Убедитесь, что клетки отделены от планшета под микроскопом. Затем соберите клеточную суспензию и добавьте в пробирку для сбора 4 мл предварительно подогретой (37 °C) полной первичной среды для выращивания клеток Мюллера (приготовленной на шаге 1.2).
4. Центрифуга в течение 7 мин при 300 x g. После аспирации надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 10 мл полной первичной питательной среды для клеток Мюллера. Поскольку количество клеток может варьироваться в зависимости от количества рассекаемых глазков, поэтому лучше подсчитывать клетки перед посевом и инкубацией. Рекомендуемая плотность высева составляет 3,0 х 10⁶ ячеек в колбе Т75.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно пропускать до 4-5 раз. Однако наиболее последовательные результаты эксперимента обнаруживаются после 1-2 проходов.

7. Иммунофлюоресценция

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте протокол иммунофлюоресценции для окрашивания и подтверждения специфичности клеток Мюллера. Вот краткий обзор иммунофлюоресцентного протокола. Этот шаг выполняется после первого прохода¹².

1. Засейте клетки в предметное стекло камеры для клеточных культур (30 000 клеток на лунку для предметного стекла с 8-луночной камерой).
2. Культивируют выделенные клетки в течение 24-48 ч в полной среде для культивирования клеток Мюллера (приготовленной на стадии 1.2) при 37 °C и 5%_CO2.
3. Отсадите среду и промойте предметное стекло камеры 250-300 мкл 1x PBS на каждую лунку, когда ячейки сливаются на 80-90%.
4. Зафиксируйте предметное стекло на 10-15 минут в 250-300 мкл 4% параформальдегида на каждую лунку, после чего промойте PBS/TX-100 (по 5 мин каждая/3x).
5. Добавьте блокирующий буфер на 1 ч при 37 °C (см. Таблицу материалов).
6. Аспирируйте блокирующий раствор, затем добавьте первичные антитела, специфичные для клеток Мюллера, чтобы подтвердить чистоту выделенных клеток с помощью глутаминсинтетазы и виментина ^5,12. Инкубировать в течение 3 ч при 37 °C (используя концентрацию антител 1:100-1:200 в блокирующем буфере в объеме 150-200 мкл/слайд). Вымойте предметное стекло с помощью смывок PBS/TX-100 (по 5 и 10 минут).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти антитела были выбраны потому, что они являются отличительными признаками для идентификации клеток Мюллера и обеспечения успеха и чистоты клеточной культуры Мюллера.
7. Добавьте вторичное антитело (с концентрацией антитела в диапазоне от 1:1000 в блокирующем буфере в концентрации 150-200 мкл/слайд) и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °С. Затем постирайте PBS/Triton X-100 три раза (по 5-10 минут каждый).
8. Нанесите каплю монтажной среды DAPI для маркировки ядер, прежде чем накрыть предметное стекло покровным стеклом. Избегайте образования пузырьков воздуха при размещении покровного стекла.
9. Используйте флуоресцентный микроскоп для проверки предметного стекла и получения изображений (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки расположены с помощью DAPI в точке ex/em 359/461 при 10-кратном увеличении для определения местоположения ячеек; Большее увеличение может захватывать клетки. Другие длины волн будут зависеть от выбранного цвета. Зеленый цвет (GFP) - ex/em 488/510. Красный цвет (Cy3) - ex/em 555/569.

Результаты

Валидация специфичности, чистоты и барьерной функции изолированных клеток Мюллера
Чтобы подтвердить жизнеспособность, морфологию и отличительные качества выделенных клеток Мюллера, клетки исследовали под световым микроскопом. Были записаны изображения P0 и P1 (р...

Обсуждение

Выделение первичного пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) у мышей ранее было задокументировано нашей лабораторией. В данной рукописи подробно описан демонстрационный протокол выделения первичных клеток Мюллера. Эта процедура включает в себя энуклеацию, лечение, диссекцию, сбор, посев,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM (1X)	Thermo Scientific	11885084	Media to grow Müller cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase	Cell signalling	80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS)	Thermo Scientific	J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Vimentin	invitrogen	MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a