כונן TD: שתל פרמטרי בקוד פתוח לרישומים אלקטרופיזיולוגיים רב-אזוריים בחולדות מתנהגים וישנים

Summary

כאן, אנו מציגים שתל ייחודי הניתן להדפסה בתלת-ממד עבור חולדות, בשם TD Drive, המסוגל להקליט אלקטרודות תיל סימטריות דו-צדדיות, כיום בעד עשרה אזורי מוח מבוזרים בו זמנית.

Abstract

אינטראקציות מורכבות בין אזורים מרובים במוח עומדות בבסיס רוב התפקודים המיוחסים למוח. תהליך הלמידה, כמו גם היווצרות וגיבוש של זיכרונות, הן שתי דוגמאות הנשענות במידה רבה על קישוריות תפקודית ברחבי המוח. בנוסף, חקירת קווי דמיון ו/או הבדלים בחצי האי הולכת יד ביד עם אינטראקציות רב-אזוריות אלה. מחקרים אלקטרופיזיולוגיים המנסים להבהיר עוד יותר את התהליכים המורכבים הללו תלויים אפוא ברישום פעילות מוחית במספר מקומות בו זמנית ולעתים קרובות באופן דו-צדדי. כאן מוצג שתל הניתן להדפסה תלת-ממדית עבור חולדות, בשם TD Drive, המסוגל להקליט אלקטרודות תיל סימטריות דו-צדדיות, כיום בעד עשרה אזורי מוח מבוזרים בו זמנית. עיצוב הקוד הפתוח נוצר תוך שימוש בעקרונות תכנון פרמטריים, המאפשרים למשתמשים פוטנציאליים להתאים בקלות את עיצוב הכונן לצרכיהם פשוט על ידי התאמת פרמטרים ברמה גבוהה, כגון קואורדינטות קדמיות-אחוריות ובינוניות של מיקומי אלקטרודות ההקלטה. עיצוב השתל אומת ב-n = 20 חולדות עם ברדס ליסטר שביצעו משימות שונות. השתל התאים להקלטות שינה קשורות והקלטות שדה פתוח (Object Exploration) וכן הקלטה אלחוטית במבוך גדול באמצעות שתי מערכות הקלטה מסחריות שונות ובמות ראש. לפיכך, מוצג כאן הוא עיצוב והרכבה הניתנים להתאמה של שתל אלקטרופיזיולוגי חדש, המאפשרים הכנה מהירה והשתלה.

Introduction

האופי הרב-אזורי של אינטראקציות מוחיות במהלך ערות ושינה מקשה על מחקר ממצה של התהליכים הפיזיולוגיים המתמשכים. בעוד גישות כגון MRI תפקודי (fMRI) ואולטרסאונד תפקודי (fUS) מאפשרות דגימה של פעילות המוח ממוחות שלמים ^1,2, הן מנצלות צימוד נוירו-וסקולרי כדי להסיק פעילות מוחית מפעילות המודינמית, ומגבילות את הרזולוציה הטמפורלית שלהם². בנוסף, fMRI דורש מיקום של נושא המחקר בסורק MRI, ואוסר על ניסויים עם בעלי חיים הנעים בחופשיות. הדמיה אופטית של דינמיקת סידן באמצעות הדמיה בודדת או מולטיפוטון מאפשרת הקלטות ספציפיות לסוג התא של מאות תאי עצב בו זמנית³. עם זאת, מיקרוסקופים המותקנים על הראש כגון המיניסקופ³, המאפשרים תנועה חופשית, מוגבלים בדרך כלל להדמיית אזורים שטחיים בקליפת המוח במוחות שלמים⁴. בעוד שקוטר שדה הראייה שלהם על קליפת המוח יכול להיות בסדר גודל של 1 מ"מ, דרישות השטח של מיקרוסקופים אלה המותקנים על הראש יכולות להקשות על מיקוד בכמה אזורים, במיוחד סמוכים. לכן, כדי ללכוד דינמיקה מוחית רב-אזורית בערות ובשינה בצורה מדויקת, אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית, המתועדת באמצעות אלקטרודות המושתלות באזורי העניין במוח, היא אחת השיטות המועדפות בשל הרזולוציה הטמפורלית הגבוהה והדיוק המרחבי^{שלה 5}. בנוסף, היא מאפשרת אפיון של דינמיקת שינה בבעלי חיים התואמת לניתוחים המתקבלים מ- EEG אנושי, ומגדילה את הערך התרגומי של שיטה זו⁶.

באופן קלאסי, מחקרים המתעדים פעילות מוחית עם אלקטרודות חוץ-תאיות השתמשו באלקטרודות חוט בודדות או בצרורות אלקטרודות, כגון טטרודים⁷. גשושיות חדישות כגון Neuropixels probe⁸ מאפשרות להתמקד במספר אזורים בו זמנית, בהתחשב בכך שהם מיושרים על ציר המאפשר להשתיל את הגשושית לאורך ציר זה מבלי לפגוע בחיה. עם זאת, הקלטות סימולטניות מדויקות של אזורים מרובים ומופרדים מרחבית עדיין נותרות מאתגרות, כאשר השיטות הקיימות הן יקרות או גוזלות זמן.

בשנים האחרונות, שיטות ייצור תוספים כגון סטריאוליתוגרפיה הפכו זמינות באופן נרחב. זה איפשר לחוקרים לפתח שתלי אלקטרודות חדשניים שהיו ניתנים להתאמה לדרישות הניסוי שלהם⁹, למשל, פישוט פשוט יותר שניתן לחזור על עצמו של אזורים מרובים במוח. לעתים קרובות, עיצובי שתלים אלה משותפים גם עם הקהילה האקדמית כחומרת קוד פתוח, המאפשרת לחוקרים אחרים להתאים אותם למטרותיהם. מידת ההסתגלות של שתלים ספציפיים משתנה הן כתוצאה מאופן תכנון השתל והן מאופן השיתוף שלו. מידול פרמטרי¹⁰ היא גישה פופולרית בתכנון בעזרת מחשב, שבה רכיבים שונים של העיצוב מקושרים על ידי פרמטרים התלויים זה בזה והיסטוריית תכנון מוגדרת. יישום גישה פרמטרית לתכנון שתלים מגדיל את יכולת השימוש החוזר וההתאמה שלהם¹⁰, שכן שינוי פרמטרים בודדים מעדכן אוטומטית את העיצובים המלאים ללא צורך במידול מחדש מורכב של העיצוב. הכרח תוצאתי הוא שהעיצוב עצמו משותף בפורמט ניתן לעריכה המשמר את היחסים הפרמטריים ואת ההיסטוריה של העיצוב. תבניות קובץ המייצגות רק פרימיטיבים גיאומטריים, כגון STL או STEP, הופכות את השינויים הפרמטריים הבאים של מודלים שפורסמו לבלתי אפשריים.

בעוד שהיפר-כוננים טטרודים 11,12,13 מאפשרים הקלטות מעשרות טטרודים, הרכבתם והשתלתם גוזלים זמן, ואיכותם תלויה במידה רבה במיומנות ובניסיון של החוקר הבודד. בנוסף, הם בדרך כלל משלבים את צינורות ההנחיה המכוונים את אלקטרודות ההקלטה למיקום היעד שלהם בצרור אחד או שניים גדולים יותר, ובכך מגבילים את מספר והתפשטות האזורים שניתן לכוון אליהם ביעילות.

שתלים אחרים ^14,15 חושפים את הגולגולת המלאה ומאפשרים מיקום חופשי של מיקרו-כוננים נפרדים מרובים הנושאים את אלקטרודות ההקלטה. בעוד המיקום של מיקרו-כוננים עצמאיים¹⁶ במהלך זמן הניתוח ממקסם את הגמישות, הוא מאריך את זמן הניתוח ויכול להקשות על מיקוד באזורים סמוכים מרובים בשל דרישות השטח של המיקרו-כוננים הבודדים. בנוסף, בעוד השתלים הם קוד פתוח, הם מתפרסמים רק כקבצי STL, מה שמקשה על השינוי.

דוגמה לכונן עם פילוסופיה פרמטרית מובנית יותר היא RatHat¹⁷. על ידי מתן שבלונה כירורגית המכסה את כל פני השטח הגבי של הגולגולת, היא מאפשרת מיקוד מדויק של מטרות מוח מרובות ללא שימוש במסגרת סטריאוטקטית במהלך הניתוח. קיימות וריאציות מרובות של שתלים עבור צינוריות, אופטרודות או טטרודים. עם זאת, בעוד שהכונן חופשי לשימוש למטרות אקדמיות, הוא אינו מפורסם בקוד פתוח, מה שיוצר מכשול לחוקרים להעריך את השתל ולהשתמש בו.

במאמר זה מוצג TD Drive (ראו איור 1), שתל חדשני הניתן להדפסה בתלת-ממד עבור רישומי אלקטרודות חוץ-תאיות בחולדות. כונן TD נועד להתגבר על כמה מהחסרונות של פתרונות קיימים: הוא מאפשר להתמקד באזורים מרובים במוח, המשתקפים על פני שתי ההמיספרות, עם אלקטרודות חוט עצמאיות בו זמנית. בשל העיצוב הפשוט שלו, ניתן להרכיב אותו תוך מספר שעות בעלות נמוכה יחסית על ידי חוקרים פחות מנוסים. כונן TD מתפרסם בקוד פתוח, בפורמטים של קבצים הניתנים לשינוי בקלות כדי לאפשר לחוקרים להתאים אותו לצרכים הספציפיים שלהם. שילוב גישת מידול תלת-ממדית פרמטרית מתחילת תהליך התכנון של TD Drive מאפשר הפשטה של הפרמטרים הדרושים: כדי לשנות את מיקומי היעד, החוקרים יכולים פשוט לערוך את הפרמטרים המייצגים את הקואורדינטות הגב-ונטרליות והאנטרופוסטריוריות שלהם, ללא צורך בעיצוב מחדש של הכונן בעצמם. ניתן למצוא את הקבצים לשינוי וייצור כונן TD בכתובת https://github.com/3Dneuro/TD_Drive.

איור 1: סקירה כללית של כונן TD. (A) עיבוד של כונן TD עם מכסה מגן. (B) עיבוד עם חלקים פנימיים מוצגים. כונן TD כולל (א) מיקומי הקלטה מרובים הניתנים לכוונון פרמטרי עבור חוטי אלקטרודות קבועים וניתנים להזזה, EIB עם (ב) מחבר Omnetics בצפיפות גבוהה התואם למערכות איסוף נתונים נפוצות, ו-(ג) מיפוי ערוצים אינטואיטיבי הממוטב להקלטות עם מערכות Intan/Open Ephys (ראה איור משלים 1) ו-(d) כובע להגנה על השתל במהלך הקלטות קשורות וכאשר אין במת ראש מחוברת. (C) שבלונה מנחה בתחתית כונן TD מאפשרת את מיקום צינוריות ההנחיה ומשמשת כאימות מיותר של מיקומי השתלים במהלך הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תכנון השתל נוסה ב-n = 4, אומת ב-n = 8 ואושר בחולדות עם ברדס ליסטר שביצעו משימות שונות. 4 בעלי החיים הראשונים שימשו לפיתוח הכונן והתאמת הפרמטרים. לאחר מכן, נערך פיילוט מלא עם 8 בעלי חיים (מוצג בתוצאות). קבוצה שנייה של 8 בעלי חיים הופעלה ונכללה בניתוח הישרדות השתלים. השתל התאים להקלטות שינה קשורות והקלטות שדה פתוח (Object Exploration) וכן להקלטה אלחוטית במבוך גדול (HexMaze 9 m x 5 m) באמצעות שתי מערכות הקלטה מסחריות שונות ובמות ראש. שתי הקבוצות של 8 הוקלטו בשתי מערכות רכישה שונות - קשורות להקלטות שינה ארוכות יותר ואלחוט להקלטות חקר מבוכים גדולים. אנו יכולים להסיק כי כונן תיל פשוט זה מאפשר ניסויים ארוכי טווח עם קבוצות גדולות יותר על ידי חוקרים פחות מנוסים כדי לאפשר ניתוח שלב השינה כמו גם ניתוח תנודות באזורים מרובים במוח. זאת בניגוד לרוב השתלים האלקטרופיזיולוגיים עד כה, אשר בשל קושי ועוצמת זמן, מאפשרים קבוצות בעלי חיים קטנות יותר ובדרך כלל זקוקים לנסיינים מנוסים מאוד. עם זאת, עם כונן זה, לא ניתן לרשום פעילות נוירונים בודדים; לפיכך, השימוש מוגבל לחקירות של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) ופעילות סיכום.

Protocol

המחקר הנוכחי אושר על ידי הקומיסי המרכזי ההולנדי Dierproeven (CCD) ונערך על פי חוק הניסויים בבעלי חיים (קודי פרוטוקול: 2020-0020-006 ו-2020-0020-010). נעשה שימוש בחולדות ליסטר עם ברדס זכר של 9-12 שבועות עם הגעתם. הריאגנטים והציוד המשמש בפרוטוקול מפורטים בטבלת החומרים. ראו איור משלים 1 ותרשים משלים 2 לשלבי תהליך בניית ההנעה.

1. התאמה ויצירה של מודלים תלת ממדיים ונתוני לוח ממשק אלקטרודות (EIB)

1. פתח את עיצוב גוף הכונן ב- Autodesk Fusion. לחץ על שנה פרמטרים תחת הכרטיסייה שינוי . התאם את הקואורדינטות עבור מיקום ההקלטה הראשון על ידי הזנת הקואורדינטות הקדמיות ב- anteroPosteriorSite1 והקואורדינטות הבינוניות ב- medioLateralSite1. ניתן להתאים את קוטר החור לצינור המנחה או לאלקטרודות על ידי התאמת קוטר1. חזור על הפעולה להקלטת מיקומים 2 ו- 3, ועיצוב הדגם יותאם אוטומטית.
   הערה: שלושת המיקומים המשמשים לפרוטוקול הנוכחי הם היפוקמפוס (HPC), המכיל צרורות חוטים נעים, וקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) והרטרוספלניאלית (RSC), שניהם עם צרורות חוטים קבועים (קליפת המוח של צרור חוטי ה-PFC מכוונת הן לקליפת המוח הפרה-לימבית (PRL) והן לחגורה הקדמית (ACC). טבלה 1 מספקת את המגבלות המוטלות באופן ידני על הפרמטרים השולטים בקואורדינטות הבינוניות של אתרי ההקלטה.
2. יצא את גוף הכונן המעודכן על-ידי לחיצה ימנית עליו בדפדפן ובחירה באפשרות שמור כרשת שינוי. בחר סוג STL (בינארי), יחידות מ"מ ומיקוד גבוה.
3. בחר את קובצי STL המוכנים עבור האות הרגילה או, במידת הצורך (לדוגמה, כאשר המטרות הן צדדיות מאוד), את קובצי STL המוכנים עבור האותיות הגדולות.
4. בהתאם למכסה שנבחר, בחר את ה- EIB הרגיל או הגדול לייצור. תיקי הייצור של Gerber עבור שני ה-EIBs מסופקים כארכיוני zip שניתן לשלוח ישירות לשירות ייצור.

2. הדפסת המודלים התלת-ממדיים וייצור ה-EIB

הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש במדפסת תלת-ממד מסחרית לייצור החלקים (ראה טבלת חומרים). בעת שימוש במדפסות שונות או מיקור חוץ של הייצור, ייתכן שיהיה צורך להשתמש בשרפים שונים ודומים להפקת החלקים.

1. הדפס את גוף הכונן והמעבורות באמצעות סטריאוליתוגרפיה⁹ ברזולוציה גבוהה בשרף רגיל או תואם ביולוגית (לדוגמה, שרף שקוף, שחור או לבן) עם גובה שכבה של 25 מיקרומטר. הדפס את חלקי המכסה עם שרף חזק וחזק (לדוגמה, Tough 2000).
2. או לייצר את ה-EIB בתוך החברה או לייצר אותו על ידי ספק שירות חיצוני. הלחמת את המחבר בצפיפות גבוהה ל-EIB באמצעות טכניקות הלחמה מסוג SMD (Surface Mounted Device).
   הערה: כאשר לא מנוסים בהלחמה של רכיבים אלקטרוניים עדינים, מומלץ לבצע את ההלחמה באופן חיצוני, למשל, בסדנת האלקטרוניקה של האוניברסיטה או אצל ספק מסחרי. חזק את המחבר המולחם בצפיפות גבוהה על-ידי החלת אפוקסי חזק סביב המחבר. היזהר לא לכסות את החורים עבור האלקטרודות עם אפוקסי.

3. עיבוד לאחר עיבוד של הגוף המודפס בתלת-ממד

הערה: כובע ומעבורות לא צריכים להזדקק לעיבוד שלאחר העיבוד. בהתאם לאיכות הדפסות התלת-ממד, ייתכן שיהיה צורך ללטש אותן קלות או להסיר מהן שאריות תמיכה. בעת שיוף וקידוח, יש להקפיד לא לשבור את קירות גוף הכונן. במידת הצורך, נקו חלקים לאחר עיבוד עם איזופרופנול, מטלית רכה ו/או אוויר דחוס.

1. קדח את החורים עבור צינורות ההנחיה בחלק העליון והתחתון של גוף הכונן עם מקדח 0.5 מ"מ המותקן בזווית פינים. פעולה זו מבטיחה שהממדים נכונים ועקביים בכל האתרים.
2. קדחו את שני הבולענים הנגדיים (כמו באיור 2E) על גוף ההינע עבור כניסת הפליז של המעבורת באמצעות מקדח 2 מ"מ בוויזה של פינים.
3. נקו את הבולענים הנגדיים מקידוח פסולת עם אוויר דחוס. לאחר מכן הקש על חורי ההנחיה של ברגי המעבורת, שהם הרחבה של חורי הבולען הנגדי, עם ברז M1. בצע את ההקשה בשתי חזרות או יותר, תוך ניקוי לכלוך מהברז והחור בין חזרות. לחלופין, יש לשמן את הברז בטיפת שמן מינרלי.
4. נקה את גוף הכונן מקידוח והקשה על פסולת עם אוויר דחוס.

איור 2: עיבוד של כונן TD. (A,B) כונן TD (A) ללא ו-(B) עם מכסה מגן על דגם גולגולת חולדה. (C) צינורות הנחיית פולימיד שהוכנסו כהלכה לכל אחד מששת אתרי ההקלטה. (D) מכלול מעבורת מבודד ושלם הכולל את בורג המנחה, מעבורת מודפסת בתלת-ממד ותוספת הפליז המולחמת. (E) גוף כונן TD עם שני שאטלים מוכנסים. מסומן באדום: (א) בולענים נגדיים למעבורת, (ב) מדריך הסעות, (ג) כנים מרכזיים של גוף הכונן, (ד) שבלונה של מדריך. (ו,ז) מיקומים חשובים בחלק העליון (F) והתחתון (G) של גוף הכונן שעשויים לדרוש עיבוד לאחר הדפסה בתלת-ממד מסומנים בחץ אדום כל אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. מכלולי הסעות

1. החלק מעבורת מודפסת בתלת-ממד על בורג M1x16. השתמש בתושבת פליז M1 כדי להחזיק את המעבורת המודפסת בתלת-ממד במקומה. המעבורת צריכה להיות מסוגלת להסתובב בחופשיות מבלי לזוז למעלה או למטה לאחר הצבת העלון.
   התראה: השלבים הבאים מכילים סיכוני כוויות (הלחמה). בהתאם לשטף ההלחמה וההלחמה שבו נעשה שימוש, הם עשויים לכלול חשיפה לחומרים מגרים נשימתיים ועופרת. יש ללבוש תמיד הגנה על העיניים בעת הלחמה (מכיוון שהלחמה עלולה להתפוצץ) ולפעול בהתאם להנחיות המתאימות לטיפול בטוח בחומרים שעלולים להזיק, כולל אוורור מתאים של סביבת העבודה כדי לחלץ אדי הלחמה. פעל בהתאם לתקנות ולנהלי ההפעלה המקומיים או עיין בחומר זמין באינטרנט^18,19.
2. בעזרת כמות קטנה של משחת הלחמה, מרדכים את פלדת הפליז לבורג. היזהר לא לחמם יתר על המידה את הכנס והבורג כדי לא להמיס את המעבורת המודפסת בתלת-ממד. בהתאם לשרף המשמש להדפסת תלת מימד של המעבורת, קשה להימנע מכמות קטנה של התכה (וכתוצאה מכך, מהמעבורת שנדבקת לעלון).
   הערה: בעת שימוש בברגי נירוסטה, ייתכן שיהיה צורך בשטף הלחמה. מומלץ להשתמש בברגי פליז או פלדה מכונה, מכיוון שאלה קלים יותר להלחמה.
3. לאחר קירור מכלול המעבורת, סובבו בעדינות את המעבורת המודפסת בתלת-ממד מספר פעמים סביב הבורג. אם המעבורת התמזגה לאינסרט במהלך ההלחמה, פעולה זו אמורה לשחרר אותו.
   הערה: ודא שהמעבורת יכולה להסתובב בחופשיות ושהיא אינה מתנדנדת. אם כן, השליכו את מכלול המעבורת והתחילו הרכבה חדשה. בזהירות לנסות לסובב את תוספת פליז. אם הוא מסתובב ביחס לבורג, חזור על תהליך ההלחמה.

5. הרכבת הכונן

1. חתכו צינורות פולימיד זמינים מסחרית לאורך של כ-25 מ"מ, אך לפחות מספיק זמן כדי להאריך את כל גוף ההנעה.
2. הכנס את צינורות מדריך הפולימיד לגוף הכונן. יש להכניס כל צינור דרך חור אחד בחלק העליון של הכונן ואת החור המתאים בסטנסיל המנחה בתחתית הכונן ("d" באיור 2E). יש להכניס את הצינורות עד שהם סומקים עם החלק העליון של גוף הכונן.
3. בעזרת מחט דקה או קיסם, מרחו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט נוזלי על החורים בחלק העליון של גוף הכונן כדי לקבע את צינורות ההנחיה במקומם. יש למרוח את הדבק מהצד התחתון של הגוף כדי למנוע מדבק לחדור לצינורות המנחה. הדבק יישאב לתוך החלל שבין גוף ההנעה לצינור המנחה על ידי כוחות נימים ובכך יחבר בין השניים.
4. יש למרוח כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט על הממשק שבין צינורות ההנחיה לשבלונה המנחה בתחתית גוף הכונן. שוב, יש להקפיד לא לסתום את צינורות המדריך בדבק. תנו לדבק להתייבש במשך כמה דקות.
   הערה: משך הזמן המדויק הדרוש תלוי בחומר הכונן ובמרווח בין גוף הכונן לצינורות המנחה. בדרך כלל, 5-10 דקות אמור להספיק.
5. הפוך את גוף ההינע וחתך את צינורות מדריך הפולימיד בתחתית, כך שהם נמתחים בערך 1 מ"מ מעבר לכנים המרכזיים של גוף הכונן ("c" באיור 2E ובאיור משלים 2). בתצורה זו, קצה צינורות ההנחיה יהיה סמוק עם פני השטח של המוח בעת ההשתלה.
   הערה: הכונן פותח כדי להתמקד באזורים עמוקים יותר במוח. אם אזורים שטחיים בקליפת המוח ממוקדים, ייתכן שיהיה צורך בצינורות מנחים פוליאמידים קצרים יותר כדי לא לפגוע בפני השטח של המוח במקרה של נפיחות מוחית ראשונית.
6. הכנס שני מכלולי מעבורת לגוף הכונן. בזמן שאתם מבריחים אותם לתוך חורי המדריך המהודקים, ודאו שהברגים מקבילים למדריכי המעבורת ("b" באיור 2E). השתמש באצבעות כדי ליישר בעדינות את ההסעות עם מדריכי ההסעות.
7. הברג את המעבורות במלואן לתוך חורי הבולען הנגדי כדי לוודא שתוספות הפליז של מכלול המעבורת אינן נתקעות בגוף הכונן או מתנגשות בצינורות המנחים של הפולימיד. עבור פרוטוקול זה, נדרש מרחק מינימלי של 16 סיבובים מלאים. אם זה לא הגיע, לחתוך את צינור polyimide על גבי גוף הכונן עוד יותר כדי ליצור יותר מקום. אין להדק יתר על המידה את המעבורת בגוף הכונן - זה יכול להרוס את החוטים הלכודים בגוף הכונן ואת חיבור ההלחמה של מכלול המעבורת.
   הערה: אם מכלול מעבורת נתקע, הסר אותו לחלוטין ובדוק אם חיבור ההלחמה התרופף. במקרה כזה, השתמש בהרכבה חדשה של מעבורת. אם מכלול המעבורת מתנגש בצינור מנחה, קצר את צינור ההנחיה כך שלא יתרחב מעבר לגוף הכונן.
8. הברג את ה-EIB לגוף הכונן באמצעות ברגי פולימיד M2.5x5. יש למרוח כמה טיפות של דבק ציאנואקרילט בין גוף הכונן לבין EIB. הקפד לא לסתום את החורים עבור חיבור אלקטרודות.

6. הכנת כיסוי המגן

1. הכנס אגוז M2 מנירוסטה לתוך האקסטרוזיה בחצי המכסה השמאלי וקבע אותו עם דבק ציאנואקרילט.
2. במידת הצורך, קדח את החור בחלק הקדמי של המכסה השמאלי עם מקדח M1 בוויזה של סיכה. הקש על החור בחלק הקדמי של חצי המכסה הימני באמצעות הקשה M1.

7. הכנת אלקטרודות חוט

1. הכינו שני לוחות מתכת כמשטח ליצירת צרורות חוטי האלקטרודות. הלוחות משמשים כמשטח שטוח, יציב אך ניתן להזזה שעליו יתרחשו הרכבה, הדבקה וחיתוך של צרור החוטים. הצמידו נייר שרטוט לצלחת הראשונה וקשרו שני סרטי צבע דביקים על הצלחת השנייה, כשהמשטח הדביק מצביע כלפי מעלה.
2. שלושה מתוך ארבעת החוטים בצרורות HPC ייחתכו בזווית של 60 מעלות כדי ליצור היסט בכיוון הגב. זה יאפשר הצבת חוט מעל, בתוך ומתחת לשכבה הפירמידלית של ההיפוקמפוס, בהתאמה. כדי להקל על החיתוך, ציירו קו ברור עם זווית של 60 מעלות על נייר התוויית (קו של 60 מעלות).
3. עבור כל צרור אלקטרודות HPC, לחתוך 4 חתיכות של חוט אלקטרודה באורך של 4.5 ס"מ כל אחד. עבור כל חבילת אלקטרודות PFC ו- RSC, חתכו 4 חתיכות של חוט אלקטרודה באורך של 3.5 ס"מ כל אחת.
4. הרימו בעדינות 4 חוטים על ידי נגיעה בהם עם קצה אצבע (הם יידבקו אליו) והניחו אותם קרוב ככל האפשר אחד ליד השני על סרט הציירים. הקפד לא לשים אותם אחד על השני.
5. תחת מיקרוסקופ, השתמש במלקחיים כדי למקם את החוטים יחד קרוב ככל האפשר. מרחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט נוזלי על 2 הס"מ הראשונים של החלק העליון של הצרור. עבור צרור HPC, דבק > 2 ס"מ ו < 3.5 ס"מ של החוט. המתינו עד שהדבק יתייבש.
6. גע בחוטים בעדינות עם כמה מלקחיים מתחת למיקרוסקופ. אם הם לא נפרדים, הם מודבקים כראוי. כבדיקת שפיות, יש לוודא ששכבת הדבק מאירה תחת הארת המיקרוסקופ.
7. לאחר ייבוש מלא, להסיר את צרור חוט מן הסרט ולהעביר אותו לצלחת עם נייר התווית. תחת מיקרוסקופ, בדוק את צרור החוטים עבור דבק עודף על גבי או בצדדים, והסר אותו בזהירות עם להב אזמל.
8. עבור חבילות RSC, בצע חיתוך ישר בתחתית המערך, בניצב לכיוון החוטים.
9. עבור חבילות HPC, מקם את המערך על נייר התוויית כך שיחצה את הקו של 60 מעלות, והשתמש בקו כקו מנחה לביצוע חיתוך בזווית של 60 מעלות לכיוון החוטים.
   1. לאחר מכן, השתמש בלהב אזמל כדי לפצל בזהירות את הקצר ביותר מבין 4 החוטים מהצרור. חותכים את החוט בניצב לכיוון החוט, ומקצרים אותו לכ-0.75 מ"מ בהשוואה לחוט השני באורכו בצרור.
10. עבור חבילות PFC, פצל את החלק התחתון של המערך לשני צרורות דו-חוטיים. ודא ששני החוטים מודבקים היטב זה לזה. קצרו את אחד מצרורות 2 החוטים ב-1 מ"מ על ידי חיתוכו בניצב לכיוון החוט. ראו איור משלים 1 (למטה) ואיור משלים 2b לתמונות של צרורות החוטים החתוכים.

8. הכנת חוטי הארקה ו-EEG

1. דחפו לפחות 10 מפיני ה-SIP/DIP מתוך פס שקע SIP/DIP המחובר זה לזה בפסיעה של 1.27 מ"מ.
2. חותכים 2 חתיכות באורך 6 ס"מ עבור חוט הקרקע (GND). חותכים 8 חתיכות באורך 6 ס"מ עבור חוט EEG. השתמש בלהב אזמל כדי להסיר בזהירות חלק מהבידוד משני הקצוות של כל החוטים.
3. הניחו בורג נירוסטה M1x3 ביד שלישית, והשאירו כמה שיותר מקום נגיש מתחת לראש הבורג. כרוך צד מבודד של חוט GND או EEG סביב השוק של הבורג, ממש מתחת לראש הבורג.
4. יש למרוח כמות קטנה של שטף הלחמה בעזרת מחט קטנה או קיסם. הלחמת את החוט לבורג. ודא שלא לסתום בטעות את החריץ של ראש הבורג.
5. הניחו סיכת SIP/DIP ביד השלישית כך שהצד הנשי יהיה נגיש. הכנס את החלק הלא מבודד של הצד הנגדי של החוט לתוך פין SIP/DIP. יש למרוח כמות קטנה של שטף הלחמה ולרתך את החוט על הסיכה.
6. הסר את מכלול חוטי הבורג המולחמים מהמחזיק. מכלול זה יושתל בגולגולת במהלך ניתוח ההשתלה.
7. הניחו סיכת SIP/DIP נוספת במחזיק, מסובבת ב-180 מעלות (כלומר, נגישה לצד הגבר). יש למרוח כמות קטנה של שטף הלחמה ולהלחית צד לא מבודד של החוט השני על הצד הגברי של הסיכה.
8. הסר את מכלול סיכות התיל המולחמות מהמחזיק. מכלול זה יחובר מאוחר יותר ל- EIB, ומכלול חוטי הבורג, כמו גם מכלול סיכות התיל, יחוברו זה לזה במהלך ניתוח ההשתלה באמצעות שני הפינים שלהם.
9. כדי לחזק את החיבורים המולחמים, יש למרוח כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט על החיבור בין החוטים והפינים.
10. לאחר שהדבק התייבש, ודא שניתן לחבר את פיני ה-SIP/DIP של שני המכלולים בצורה חלקה. השתמש באפשרות רציפות הבדיקה של מולטימטר כדי לוודא שיש חיבור רציף בין הבורג לבין קצה החוט המבודד של מכלול פין התיל כאשר שני המכלולים מחוברים. לחלופין, קודדו בצבע כל סט חוטים בלק (ראו טבלת חומרים) כדי לפשט את החיבור הנכון במהלך ניתוח השתל.

9. טעינת חבילות החוטים לכונן

1. חבר את הכונן למחזיק. היזהר לא להפעיל לחץ רב מדי על ה- EIB או לפגוע במחבר בצפיפות גבוהה בשלב זה.
2. ברגע שגוף ההינע נמצא במצב יציב, קח את אחד מצרורות החוטים והחלק אותו בזהירות לתוך צינור הפולימיד המתאים, ביד או באמצעות זוג מלקחיים עדינים. ודא שמערך החוטים ממוקם בכיוון הנכון (לדוגמה, עבור מערך PFC, שני החוטים הארוכים יותר של המערך צריכים להיות פונים למדיאליים), והיזהר שלא לכופף את מערך החוטים.
3. חזור על השלב האחרון עבור כל חבילות החוטים האחרות.
4. השתמש במלקחיים דקים כדי לתפוס את אחד החוטים וכופף אותו בזהירות לכיוון החור שאתה רוצה להכניס אותו. לאחר הכנסתו, השתמש בסיכת זהב כדי לנעוץ אותו בחור EIB. חזור על פעולה זו עבור כל החוטים של הצרור ועבור כל הצרורות.
   1. ודא כי בשלב זה, החוטים יוצרים לולאה יפה מעל ה- EIB (בדרך זו, עדיין יש מקום להזיז את הצרור למעלה ולמטה בצינור הפולימיד על מנת להתאים את האורך בתחתית הצינור) וכי המערך הבולט מתחתית צינור הפולימיד אינו מתעקם בטעות. הקפד לרשום איזה חוט מכל חבילת חוטים מתחבר לכל ערוץ ב-EIB. ראה איור משלים 1 להרחבה על מיפוי הערוצים של כונן TD.
      הערה: לחלופין, לאחר טעינת כל חבילת חוטים (שלב 9.2), ניתן לחבר ישירות את החוטים ל- EIB (שלב 9.4) ולאחר מכן להמשיך לשלב 9.2 + 9.4 עבור חבילות החוטים הנותרות. זה יכול להיות מגוון בהתאם להעדפות האישיות של הנסיינים. ראו איור משלים 2b לדוגמה של כונן TD טעון.
5. התאימו את אורך צרורות החוטים כדי לכוון נכון את מיקומי ההקלטה על-ידי דחיפה או משיכה עדינה של צרורות החוטים פנימה או החוצה מהצינור המנחה (ראו איור משלים 2d).
   הערה: כאשר צינורות ההנחיה נחתכים כדי להיות צמודים לפני השטח של המוח, המרחק שאליו צרור חוטים משתרע מעבר לצינור המנחה מתאים למיקום הדורסו-ונטרלי של אזור המטרה. חבילות חוטי ה- HPC הניתנות להזזה צריכות להיות צמודות לתחתית הצינור המנחה, חבילות ה- RSC הקבועות צריכות להימשך 1.5 מ"מ, וצרורות ה- PFC הקבועים צריכים להימשך 3.5 מ"מ מעבר לצינורות המנחים. בעת דחיפה או משיכה של מכלולי החוטים, היזהר לא למשוך חוטים בודדים מה- EIB בחלק העליון או לכופף את החלק התחתון של צרור החוטים.
6. כאשר מערכי החוטים הקבועים (RSC ו-PFC) מיושרים, יש למרוח כמות קטנה של דבק אפוקסי חזק על החלק העליון של צינורות ההנחיה, ולהדביק את הצרורות למקומם. בזמן שהאפוקסי נרפא, ודא שחבילות החוטים עדיין מיושרות כראוי בתחתית.
7. כדי לתקן את מערכי חוטי ה-HPC הניתנים להזזה, הזז תחילה את המעבורת למיקום הגבוה ביותר הנדרש (בניסויים המתוארים במאמר זה, לפחות 16 סיבובים מלאים / 4 מ"מ מעל המיקום הנמוך ביותר). לאחר מכן דחפו את צרורות החוטים לתוך הפתח בצורת U של המעבורת והדביקו אותם במקומם עם כמות קטנה של דבק אפוקסי חזק.
   הערה: ודא שהאפוקסי אינו זולג במורד הצרור לתוך צינור הפולימיד. כאשר האפוקסי נרפא, יש למרוח שכבה שנייה של אפוקסי באותה נקודה כדי לחזק את החיבור ולהקטין את הסיכוי שהחיבור יתנתק בעת העברת המעבורת.
8. הכנס בזהירות את הקצה הפתוח של מכלול סיכות התיל של חוט GND דרך אחד החורים המסומנים GND. תקן אותו באמצעות סיכת זהב.
   הערה: בעת שימוש בכותרת שבה ערוצי GND והפניה (REF) מקוצרים, ניתן להשתמש בערוץ REF גם אם נוח יותר.
9. הסר את הכונן מהמחזיק; יש להקפיד לא לכופף אף אחד ממכלולי החוטים. חבר מחדש את החלק הקדמי של הכונן באותו מחזיק והכנס 4 מכלולי פיני תיל EEG לתוך חורי המעבר של תעלות ה- EEG (מסומנות 2,4, 29, 31) ותקן אותם עם סיכת זהב כל אחד.
10. עבור כל חוטי GND ו- EEG, השתמש במולטימטר בהגדרת הרציפות כדי לאמת את החיבור הרציף בין סיכת הזהב ב- EIB לבין הסיכה של מכלול סיכות החוט המחובר.
11. אחסן את הכונן. ניתן לעשות זאת, למשל, על ידי הצמדת המכסה לגוף הכונן ואחסונו.
    הערה: לפני השתלה כירורגית, יש לעקר את תחתית הכונן באמצעות אתנול. יש לעקר את כל ברגי העצם ומכלולי חוטי GND/EEG באתנול. כלי ניתוח צריך להיות מעוקר באמצעות autoclave.

10. להניע ניתוח שתלים

הערה: שלב זה מתאר בקצרה את ההליכים הכירורגיים להשתלת כונן TD. פרוטוקול השתלה נרחב יותר, הכולל תיאור כלים, כמו גם מינונים וריכוזים של תרופות, ניתן למצוא בקובץ משלים 1.

1. יש לעקר את כלי הניתוח ולנקות ולחטא את אזור הניתוח בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות. כדי לעקר את השתלים, הניחו את חלקי חוטי האלקטרודות שיהיו במגע עם המוח באתנול למשך דקה אחת לפחות.
   הערה: חשיפה ממושכת לאתנול או לאדיו עלולה להחליש את דבק הציאנואקרילט. אם האדים אינם לכודים, האריכו את זמן הטבילה של החוטים באתנול. על מנת לוודא את תקינות הדבק, מומלץ למצוא את הזמן האופטימלי עם שתל בדיקה שאינו משמש בניסוי אמיתי.
2. לספק משככי כאבים מונעים, אנטיביוטיקה והרדמת גז (isoflurane) בהתאם להנחיות מוסדיות ומקומיות.
3. הניחו את החולדה במנגנון הסטריאוטקטי. לגלח את החלק העליון של הראש ולחטא את העור עם יוד povidone. תת עורית להחיל הרדמה מקומית (לידוקאין) ולעשות חתך קטן על הגולגולת על גבי קו האמצע.
4. חשוף את הגולגולת על ידי משיכת העור הצידה. הסר רקמת חיבור על גבי הגולגולת, יבש ונקה את פני הגולגולת. נתקו בעדינות את השרירים בצד הגולגולת כדי לאפשר מיקום ברגי עיגון.
5. מדוד את קואורדינטות הברגמה והלמדא. למיקוד מדויק, ודא שפני הגולגולת מקבילים למישור הקדמי-בינוני-בינוני של הסטריאוטקס על ידי מדידת ההבדל במיקום הדורסו-ונטרלי של ברגמה ולמבדה. אם הקואורדינטות שונות, התאימו את מיקום החולדה בסטריאוטקס על ידי הגבהה או הורדה של השופר.
6. סמן את הקרניוטומיות סביב מיקומי המטרה (קליפת המוח הקדם-לימבית (AP +3.5 מ"מ ו-ML + -1 מ"מ), רטרוספלניאלית (AP+5.8 מ"מ ו-ML +-1mm וההיפוקמפוס (AP -3.8 מ"מ ו-ML + - 2.5 מ"מ)).
7. חורי קידוח עבור ברגי GND/EEG וברגי עיגון. הכנס את הברגים וכסה אותם באקריליק דנטלי נוזלי. מקדחים את craniotomies בזהירות להסיר את dura mater. למנוע התייבשות קרניוטומיות על ידי מריחת מי מלח סטריליים.
8. מקם בזהירות את כונן TD על גבי craniotomies, להבטיח את צינורות המדריך הם סומק עם הגולגולת. הגן על צינורות ההדרכה עם וזלין וחבר את כונן TD לגולגולת עם אקריליק דנטלי.
9. הנמיכו את מערכי החוטים המכוונים ל-HPC באיטיות ממיקומם הראשוני (~1.5 מ"מ DV מפני השטח של המוח) לכיוון השכבה הפירמידלית של CA1 בהיפוקמפוס. השכבה הפירמידלית הגיעה בהדרגה בימים שלאחר מכן במהלך בדיקות אותות בתקופת ההחלמה של החולדות.
10. הנח את מכסה המגן סביב הכונן.
11. כבו את ההרדמה בגז והוציאו את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקטית. הניחו את החולדה בכלוב נקי בתוך תא מחומם וספקו מזון ומים רטובים להתאוששות. עקבו אחר החולדה עד שהיא שוב פעילה, נעה בכלוב, אוכלת ושותה.
12. החזירו את החולדה לחדר הדיור. לספק שיכוך כאבים לאחר הניתוח וטיפול בהתאם להנחיות המוסדיות. ראו למשל פרוטוקול ניתוח בקובץ משלים 1.

11. שחזור EIB

1. בסוף הניסוי, לשחזר את הכונן ולהסיר את כיסוי המגן.
2. הסר את סיכות הזהב וחבר את חוטי האלקטרודות בזהירות. שחרר את הברגת ה-EIB מגוף הכונן. על ידי דחיפת פינצטה רכה בעדינות בין ה-EIB לגוף ההנעה או הרמה זהירה של ה-EIB ביד, שחררו את שארית קשר הציאנואקרילט שמחזיק את ה-EIB לגוף.
3. נקו את סיכות ה-EIB והזהב לשימוש חוזר בשתלי TD Drive הבאים. לפני שימוש חוזר ב-EIB, בדוק אם יש ללבוש את סיכת הזהב ואת מחבר הצפיפות הגבוהה. עשה שימוש חוזר ב-EIB רק אם הוויאס שלם מספיק כדי לאפשר חיבור טוב בין סיכות זהב, חוטי אלקטרודות ו-EIB ואם החיבור של המחבר בצפיפות גבוהה לראש הראש עדיין יציב מספיק.

תוצאות

באמצעות ההוראות המסופקות בפרוטוקול, כונן TD יכול להיבנות בקלות על ידי מספר נסיינים. לאחר פיתוח הכונן (n = 4), הופעל פיילוט מלא עם שמונה בעלי חיים. קבוצה נוספת של שמונה בעלי חיים הושתלה, ובוצע איסוף נתונים ניסיוני. מכיוון שניתוח הנתונים לא הושלם על בעלי חיים אלה, הם נכללו בניתו...

Discussion

במאמר זה מוצג שתל הניתן להתאמה עבור הקלטות אלקטרודות תיל דו-צדדיות וסימטריות מרובות אזורים עבור חולדות הנעות בחופשיות.

היכולת להתאים בקלות את השתל על ידי שינוי פרמטרים מוגדרים מראש הייתה אחד המניעים ליצירת כונן TD. בעוד שהמטרה היא למקסם את הגמישות לשינוי ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm drill bit	McMaster	2951A38
1.27 mm pitch interconnected SIP/DIP socket (Mill-Max)	Mouser Electronic	575-003101	For essembling and connection of EEG & GND screws
5 minute epoxy	Bison	Commercially available	regular off-the-shelf epoxy
cyanoacrylate glue	Loctite		Super Glue-3
EEG wire	Science Products GmbH	7SS-2T
Electrode wire	Science Products GmbH	NC7620F
Ethanol	LC		For standard pre-operative sterilization procedure of drive
Fine forceps (5)	FST	91150-20	For wire bundle preperation and handling
Form 3B	Formlabs		3D printer used to 3D print the self-printed parts of the TD drive
Gold pins (small)	Neuralynx, Inc.	9885	Attachment of electorde wires to EIB board
Ground wire	Science Products GmbH	SS-3T/A
High-density connector	LabMaker GmbH/Omnetics	A79026-001
Lister Hodded rats	Charles River Laboratories	Crl:LIS	we used male rats, 9-12 weeks of age at arrival
M1 brass insert	AliExpress	Commercially available	https://aliexpress.com/item/33047616164.html
M1 tap	McMaster	2504A33
M1x16 screw	Bossard	1096613
M1x3 stainless steel screws	Screws and More	84213_14985
M2.5x5 polyimide screws	Screws and more	7985PA25S_50
mineral oil	McMaster	1244K14
Nail polish	Etos	Commercially available	For color coding EEG and GND wires
painter's tape	Gamma	Commercially available	For wire bundle preperation
Pin vise	McMaster	8455A16
plotting paper	Canson	Commercially available	For wire bundle preperation
polyimide tubes	Amazon / Small Parts	TWPT-0159-30-50	AWG, 0.0159" ID, 0.0219" OD, 0.0030" Wall, 30" Length
RHD 32-channel headstage with accelerometer	Intan Technologies, LLC	C3324	For tethered recordings in the sleepbox
RHD 3-ft (0.9 m) standard SPI cables	Intan Technologies, LLC	C3203	From commutator to headstage
RHD 6-ft (1.8 m) standard SPI cables	Intan Technologies, LLC	C3206	From OpenEphys box to commutator
Slip Ring with Flange	Adafruit	1196	Commutator: 22 mm diameter, 12 wires
Solder flux	Griffon S-39 50 ml	Commercially available	For soldering EEG & GND screws
soldering paste	Amazon	B08CBZ5HC5
stainless steel M2 nut	McMaster	93935A305
Tethered recording setup	OpenEphys	Acquasition Board
Wireless recording logger	SpikeGadgets	miniLogger 32	For wireless recordings in the task
Wireless recording setup	SpikeGadgets	Main Control Unit (MCU) incl. breakout board and RF transceiver	For wireless recordings in the task