TD Drive: параметрический имплантат с открытым исходным кодом для многозонной электрофизиологической регистрации у ведущих себя и спящих крыс

Резюме

В этой статье мы представляем уникальный имплантат для крыс, который можно напечатать на 3D-принтере, названный TD Drive, способный вести симметричную двустороннюю запись электродов, в настоящее время в десяти распределенных областях мозга одновременно.

Аннотация

Сложные взаимодействия между несколькими областями мозга лежат в основе большинства функций, приписываемых мозгу. Процесс обучения, а также формирование и консолидация воспоминаний — два примера, которые в значительной степени зависят от функциональных связей в мозге. Кроме того, изучение сходств и/или различий в полушариях идет рука об руку с этими многопрофильными взаимодействиями. Таким образом, электрофизиологические исследования, направленные на дальнейшее выяснение этих сложных процессов, зависят от регистрации активности мозга в нескольких местах одновременно и часто двусторонним образом. Здесь представлен 3D-печатный имплантат для крыс под названием TD Drive, способный вести симметричную двустороннюю запись электродов, в настоящее время в десяти распределенных областях мозга одновременно. Проект с открытым исходным кодом был создан с использованием принципов параметрического проектирования, что позволяет потенциальным пользователям легко адаптировать конструкцию привода к своим потребностям, просто настроив высокоуровневые параметры, такие как передне-задние и медиолатеральные координаты расположения записывающих электродов. Дизайн имплантата был валидирован на n = 20 крысах Lister Hooded, которые выполняли различные задачи. Имплантат был совместим с привязанными записями сна и записями в открытом поле (Object Exploration), а также с беспроводной записью в большом лабиринте с использованием двух различных коммерческих систем записи и головных сцен. Таким образом, здесь представлена адаптируемая конструкция и сборка нового электрофизиологического имплантата, способствующая быстрой подготовке и имплантации.

Введение

Многопрофильный характер взаимодействий мозга во время бодрствования и сна затрудняет исчерпывающее изучение происходящих физиологических процессов. В то время как такие подходы, как функциональная МРТ (фМРТ) и функциональное ультразвуковое исследование (УЗИ), позволяют измерять активность мозга всего мозга ^1,2, они используют нейроваскулярную связь для вывода об активности мозга по гемодинамической активности, ограничивая их временное разрешение^. Кроме того, фМРТ требует помещения испытуемого в МРТ-сканер, запрещая эксперименты со свободно передвигающимися животными. Оптическая визуализация динамики кальция с помощью однофотонной или многофотонной визуализации позволяет одновременно регистрировать сотни нейронов по типу клеток³. Тем не менее, наголовные микроскопы, такие как Miniscope³, которые позволяют свободно двигаться, обычно ограничены визуализацией поверхностных областей коры^{головного мозга} в интактном мозге. В то время как диаметр их поля зрения на коре головного мозга может составлять порядка 1 мм, требования к пространству этих микроскопов, устанавливаемых на головке, могут затруднить нацеливание на несколько, особенно соседних, областей. Таким образом, для точного захвата многозонной динамики мозга в бодрствовании и сне внеклеточная электрофизиология, записанная с помощью электродов, имплантированных в интересующие области мозга, является одним из методов выбора благодаря высокому временному разрешению и пространственной точности^. Кроме того, это позволяет охарактеризовать динамику сна у животных, совместимую с анализами, полученными с помощью ЭЭГ человека, повышая трансляционную ценность этого метода⁶.

Классически в исследованиях, регистрирующих активность мозга с помощью внеклеточных электродов, использовались отдельные проволочные электроды или пучки электродов, такие как тетроды⁷. Современные зонды, такие как зонд Neuropixels⁸ , позволяют воздействовать на несколько областей одновременно, учитывая, что они выровнены по оси, что позволяет имплантировать зонд вдоль этой оси без причинения вреда животному. Тем не менее, точная одновременная запись нескольких пространственно разделенных областей по-прежнему остается сложной задачей, а существующие методы являются либо дорогостоящими, либо трудоемкими.

В последние годы методы аддитивного производства, такие как стереолитография, стали широко доступны. Это позволило исследователям разработать новые электродные имплантаты, которые можно было адаптировать к их^{экспериментальным требованиям9}, например, упростить повторяемое нацеливание на несколько областей мозга. Часто эти конструкции имплантатов также распространяются в академическом сообществе в качестве оборудования с открытым исходным кодом, что позволяет другим исследователям адаптировать их к своим целям. Степень адаптивности конкретных имплантатов варьируется как в зависимости от того, как спроектирован имплантат, так и в зависимости от того, как он используется. Параметрическое моделирование¹⁰ является популярным подходом в системе автоматизированного проектирования, в котором различные компоненты конструкции связаны взаимозависимыми параметрами и определенной историей проектирования. Реализация параметрического подхода к проектированию имплантатов повышает их повторное использование и^{адаптивность10}, так как изменение отдельных параметров автоматически обновляет полные конструкции без необходимости сложного повторного моделирования конструкции. Как следствие, необходимостью, чтобы сам проект был опубликован в редактируемом формате, который сохраняет параметрические отношения и историю проекта. Форматы файлов, представляющие только геометрические примитивы, такие как STL или STEP, делают невозможным последующее параметрическое изменение опубликованных моделей.

В то время как гипердвигатели тетродов 11,12,13 позволяют записывать данные с десятков тетродов, их сборка и имплантация занимают много времени, а их качество во многом зависит от мастерства и опыта отдельного исследователя. Кроме того, они обычно объединяют направляющие трубки, которые направляют записывающие электроды к их целевому местоположению, в один или два больших пучка, тем самым ограничивая количество и распространение областей, на которые можно эффективно воздействовать.

Другие имплантаты^14,15 обнажают весь череп и позволяют свободно размещать несколько отдельных микродисков, несущих записывающие электроды. В то время как установка независимых микродисков¹⁶ во время операции обеспечивает максимальную гибкость, она увеличивает время операции и может затруднить нацеливание на несколько смежных областей из-за требований к пространству отдельных микродисков. Кроме того, несмотря на то, что имплантаты имеют открытый исходный код, они публикуются только в виде файлов STL, что затрудняет модификацию.

Примером диска с более присущей ему параметрической философией является RatHat¹⁷. Благодаря хирургическому трафарету, который покрывает всю дорсальную поверхность черепа, он позволяет точно нацеливаться на несколько головных мишеней без использования стереотаксической рамки во время операции. Доступно несколько вариантов имплантатов для канюль, оптродов или тетродов. Однако, несмотря на то, что диск можно использовать бесплатно в академических целях, он не опубликован в открытом исходном коде, что создает препятствия для исследователей при оценке и использовании имплантата.

В этой статье представлен TD Drive (см. Рисунок 1), новый 3D-печатный имплантат для записи внеклеточных электродов у крыс. TD Drive призван преодолеть некоторые недостатки существующих решений: он позволяет воздействовать на несколько областей мозга, зеркально отражающихся в обоих полушариях, с помощью независимых проволочных электродов одновременно. Благодаря своей простой конструкции, он может быть собран за несколько часов по относительно низкой стоимости менее опытными исследователями. TD Drive опубликован с открытым исходным кодом в легко изменяемых форматах файлов, что позволяет исследователям адаптировать его к своим конкретным потребностям. Использование параметрического 3D-моделирования с самого начала процесса проектирования TD Drive позволяет абстрагировать необходимые параметры: чтобы изменить целевые местоположения, исследователи могут просто отредактировать параметры, представляющие их дорсовентральные и переднезадние координаты, без необходимости перепроектирования самого диска. Файлы для модификации и производства TD Drive можно найти по адресу https://github.com/3Dneuro/TD_Drive.

Рисунок 1: Обзор TD Drive. (A) Рендеринг TD Drive с защитным колпачком. (B) Рендеринг с отображением внутренних частей. TD Drive оснащен (a) несколькими параметрически настраиваемыми местами записи для фиксированных и подвижных электродных проводов, EIB с (b) разъемом Omnetics высокой плотности, совместимым с распространенными привязными и беспроводными системами сбора данных, и (c) интуитивно понятным сопоставлением каналов, оптимизированным для записи с помощью систем Intan/Open Ephys (см. дополнительный рисунок 1) и (d) колпачок для защиты имплантата во время привязной записи и когда не подключен подставной станок. (C) Направляющий трафарет в нижней части TD Drive облегчает размещение направляющих канюль и служит в качестве резервной проверки расположения имплантатов во время операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дизайн имплантата был опробован при n = 4, валидирован при n = 8 и подтвержден при n= 8 крысах Lister Hooded, которые выполняли различные задачи. Первые 4 животных были использованы для разработки привода и регулировки параметров. Затем был запущен полный пилотный проект с 8 животными (показано в результатах). Была проведена вторая когорта из 8 животных, которая была включена в анализ выживаемости имплантатов. Имплантат был совместим с привязной записью сна и записью в открытом поле (Object Exploration), а также с беспроводной записью в большом лабиринте (HexMaze 9 м x 5 м) с использованием двух различных коммерческих систем записи и головных сцен. Две когорты по 8 человек были зарегистрированы с помощью двух разных систем сбора данных - привязанной для более длительных записей сна и беспроводной для больших записей исследования лабиринта. Можно сделать вывод, что этот простой проводной диск позволяет проводить длительные эксперименты с большими группами менее опытных исследователей, чтобы обеспечить анализ стадии сна, а также анализ колебаний в нескольких областях мозга. Это контрастирует с большинством электрофизиологических имплантатов на сегодняшний день, которые из-за сложности и трудоемкости позволяют использовать меньшие когорты животных и обычно нуждаются в очень опытных экспериментаторах. Тем не менее, с помощью этого привода невозможно зарегистрировать индивидуальную активность нейронов; таким образом, использование ограничено исследованиями локального полевого потенциала (LFP) и суммирующей активности.

протокол

Настоящее исследование было одобрено Голландской центральной комиссией Dierproeven (CCD) и проведено в соответствии с Законом об экспериментах на животных (протокольные коды: 2020-0020-006 и 2020-0020-010). Использовались самцы крыс Lister Hooded в возрасте 9-12 недель по прибытии. Реагенты и оборудование, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов. На дополнительном рисунке 1 и дополнительном рисунке 2 приведены этапы процесса создания диска.

1. Настройка и создание 3D-моделей и данных интерфейсной платы электродов (EIB)

1. Откройте конструкцию корпуса диска в Autodesk Fusion. Нажмите « Изменить параметры » на вкладке «Изменить ». Настройте координаты для первого места записи, введя переднезаднюю координату в anteroPosteriorSite1 и медиолатеральную координату в medioLateralSite1. Диаметр отверстия для направляющей трубки или электродов можно отрегулировать, отрегулировав diameterSite1. Повторите эти действия для записи мест 2 и 3, и дизайн модели будет автоматически скорректирован.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для текущего протокола используются три места: гиппокамп (HPC), содержащий подвижные пучки проводов, а также префронтальная (PFC) и ретроспленальная (RSC) кора, обе с фиксированными пучками проводов (пучок проводов PFC нацелен как на прелимбическую (PRL), так и на переднюю поясную кору (ACC)). В таблице 1 приведены вручную наложенные ограничения на параметры, контролирующие медиолатеральные координаты мест записи.
2. Экспортируйте обновленный корпус диска, щелкнув по нему правой кнопкой мыши в браузере и выбрав «Сохранить как сетку». Выберите тип STL (двоичный), единицы измерения мм и высокую степень измельчения.
3. Выберите либо подготовленные файлы STL для обычного конденсатора, либо, при необходимости (например, когда целевые показатели расположены очень горизонтально), подготовленные файлы STL для больших конденсаторов.
4. В зависимости от того, какой колпачок вы выберете, выберите обычный или большой EIB для производства. Производственные файлы Gerber для обоих EIB предоставляются в виде zip-архивов, которые могут быть отправлены непосредственно в производственную службу.

2. Печать 3D-моделей и изготовление ЕИБ

ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании для изготовления деталей использовался коммерчески доступный 3D-принтер (см. Таблицу материалов). При использовании разных принтеров или передаче производства на аутсорсинг может потребоваться использование разных, сопоставимых смол для производства деталей.

1. Печать корпуса дисковода и челноков с помощью стереолитографии⁹ с высоким разрешением в обычной или биосовместимой смоле (например, прозрачной, черной или белой) с высотой слоя 25 мкм. Напечатайте детали для колпачка с помощью прочной и прочной смолы (например, Tough 2000).
2. Либо изготовьте ЕИБ самостоятельно, либо поручите его внешнему поставщику услуг. Припаяйте разъем высокой плотности к EIB с помощью методов пайки SMD (устройство поверхностного монтажа).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если у вас нет опыта пайки тонких электронных компонентов, рекомендуется провести пайку на стороне, например, в университетской мастерской электроники или у коммерческого поставщика. Укрепите припаянный разъем высокой плотности, нанеся прочную эпоксидную смолу вокруг разъема. Будьте осторожны, чтобы не замазать отверстия для электродов эпоксидной смолой.

3. Постобработка напечатанного на 3D-принтере кузова

ПРИМЕЧАНИЕ: Колпачок и челноки не должны нуждаться в постобработке. В зависимости от качества 3D-отпечатков их может потребоваться слегка отшлифовать или удалить оставшиеся следы поддержки. При шлифовании и сверлении следите за тем, чтобы не сломать стенки корпуса привода. При необходимости очистите обработанные детали изопропанолом и, мягкой тканью, и/или сжатым воздухом.

1. Просверлите отверстия для направляющих труб сверху и снизу корпуса привода с помощью сверла диаметром 0,5 мм, установленного в штифтовых тисках. Это гарантирует, что размеры будут правильными и согласованными на всех сайтах.
2. Просверлите два зенковочных отверстия (как показано на Иллюстрации 2E) на корпусе привода для вкладыша челночной латуни с помощью сверла диаметром 2 мм в штифтовых тисках.
3. Очистите отверстия зенковки от бурового мусора сжатым воздухом. Затем постучите метчиком M1 по направляющим отверстиям для челночных винтов, которые являются продолжением отверстий зенковки. Выполняйте нарезание резьбы в два или более этапов, очищая кран от мусора и отверстий между итерациями. По желанию смажьте кран каплей минерального масла.
4. Очистите корпус привода от сверления и нарезания мусора сжатым воздухом.

Рисунок 2: Рендеринг TD Drive. (A,B) TD Drive (A) без и (B) с защитным колпачком на модели черепа крысы. (C) Полиимидные направляющие трубки правильно вставлены в каждый из шести точек записи. (D) Изолированная, завершенная сборка челнока, состоящая из направляющего винта, напечатанного на 3D-принтере челнока и вставки из паяной латуни. (E) Корпус TD Drive со вставленными двумя челноками. Красным цветом обозначены: (а) отверстия для зенковки для челнока, (б) направляющая для челнока, (в) центральные пьедесталы корпуса привода, (г) трафарет для направляющих. (Ф,Г) Важные места в верхней части (F) и нижней части (G) корпуса диска, которые могут потребовать постобработки после 3D-печати, обозначены красной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Узлы шаттлов

1. Наденьте напечатанный на 3D-принтере челнок на винт M1x16. Используйте латунную вставку M1, чтобы удерживать напечатанный на 3D-принтере челнок на месте. Челнок должен иметь возможность свободно вращаться, не перемещаясь вверх или вниз после установки вставки.
   ВНИМАНИЕ: Следующие шаги содержат опасность ожога (пайка). В зависимости от используемого припоя и паяльного флюса они могут включать воздействие респираторных раздражителей и свинца. Всегда надевайте защитные очки для глаз во время пайки (так как припой может разбрызгиваться) и следуйте соответствующим рекомендациям по безопасному обращению с потенциально вредными веществами, включая надлежащую вентиляцию рабочего пространства для удаления паров пайки. Следуйте местным правилам и рабочим процедурам или ознакомьтесь с доступными материалами в Интернете^18,19.
2. С помощью небольшого количества паяльной пасты припаяйте латунную вставку к винту. Следите за тем, чтобы не перегреть вставку и винт, чтобы не расплавить напечатанный на 3D-принтере челнок. В зависимости от смолы, используемой для 3D-печати челнока, трудно избежать небольшого количества плавления (и, впоследствии, прилипания челнока к вкладышу).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании винтов из нержавеющей стали может потребоваться флюс для припоя. Рекомендуется использовать латунные или стальные винты, так как они легче припаиваются.
3. После того как сборка челнока остынет, аккуратно поверните напечатанный на 3D-принтере челнок несколько раз вокруг винта. Если челнок приплавился к вставке во время пайки, это должно освободить его.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что шаттл может свободно вращаться и что он не шатается. Если это так, выбросьте узел шаттла и начните новый. Осторожно попробуйте вращать латунную вставку. Если он вращается относительно винта, повторите процесс пайки.

5. Сборка диска

1. Отрежьте имеющиеся в продаже полиимидные трубки примерно до 25 мм в длину, но по крайней мере достаточную длину для того, чтобы пройти через весь корпус привода.
2. Вставьте полиимидные направляющие трубки в корпус привода. Каждая трубка должна быть вставлена через одно отверстие в верхней части дисковода и соответствующее отверстие в направляющем трафарете в нижней части дисковода («d» на рисунке 2E). Трубки следует вставлять так, чтобы они оказались на одном уровне с верхней частью корпуса привода.
3. С помощью тонкой иглы или зубочистки нанесите небольшое количество жидкого цианоакрилатного клея на отверстия в верхней части корпуса привода, чтобы зафиксировать направляющие трубки на месте. Наносите клей с нижней стороны корпуса, чтобы избежать попадания клея в направляющие трубки. Клей будет втягиваться в пространство между корпусом привода и направляющей трубой под действием капиллярных сил и таким образом соединять их.
4. Нанесите небольшое количество цианоакрилатного клея на границу раздела между направляющими трубками и направляющим трафаретом в нижней части корпуса привода. Опять же, следите за тем, чтобы направляющие трубки не засорились клеем. Дайте клею высохнуть в течение нескольких минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное необходимое время зависит от материала привода и зазора между корпусом привода и направляющими трубами. Как правило, 5-10 минут должно быть достаточно.
5. Переверните корпус привода вверх дном и разрежьте полиимидные направляющие трубки снизу так, чтобы они выступали примерно на 1 мм за пределы центральных опор корпуса привода («c» на рисунке 2E и дополнительном рисунке 2). В этой конфигурации конец направляющих трубок будет находиться на одном уровне с поверхностью мозга при имплантации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Привод был разработан для воздействия на более глубокие области мозга. Если нацелены на поверхностные области коры головного мозга, могут потребоваться более короткие полиимидные направляющие трубки, чтобы не повредить поверхность мозга в случае первоначального отека мозга.
6. Вставьте два челночных узла в корпус диска. Вкручивая их в резьбовые направляющие отверстия, убедитесь, что винты расположены параллельно направляющим челнока («b» на рисунке 2E). Пальцами аккуратно выровняйте челноки с направляющими челноков.
7. Полностью вкрутите челноки в отверстия зенковки, чтобы убедиться, что латунные вставки узла челнока не застревают в корпусе привода и не сталкиваются с полиимидными направляющими трубками. Для этого протокола требуется минимальная дистанция в 16 полных оборотов. Если это не достигнуто, разрежьте полиимидную трубку в верхней части корпуса привода, чтобы освободить больше места. Не затягивайте челнок в корпусе привода слишком сильно - это может привести к разрушению застрявших резьб на корпусе диска и паяного соединения узла челнока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если челночный узел застрял, полностью снимите его и проверьте, не ослабло ли паяное соединение. В этом случае используйте новый узел челнока. Если узел челнока сталкивается с направляющей трубой, укоротите направляющую трубу так, чтобы она не выходила за пределы корпуса привода.
8. Прикрутите EIB к корпусу привода полиимидными винтами M2,5x5. Нанесите несколько капель цианоакрилатного клея между корпусом диска и EIB. Следите за тем, чтобы не засорить сквозные отверстия для подключения электродов.

6. Подготовка защитного чехла

1. Вставьте гайку М2 из нержавеющей стали в выдавливание на левой половине колпачка и зафиксируйте ее цианоакрилатным клеем.
2. При необходимости просверлите отверстие в передней части левого колпачка сверлом M1 в штифтовых тисках. Постучите метчиком M1 по отверстию на передней части правой половины крышки.

7. Подготовка проволочных электродов

1. Подготовьте две металлические пластины в качестве поверхности для создания пучков электродной проволоки. Пластины служат плоской, устойчивой, но подвижной поверхностью, на которой будет происходить сборка, склеивание и резка пучка проводов. Прикрепите плоттерную бумагу к первой пластине и завяжите два липкого малярного скотча на вторую пластину липкой поверхностью вверх.
2. Три из четырех проводов в жгутах HPC будут обрезаны под углом 60 градусов для создания смещения в дорсовентральном направлении. Это позволит разместить проволоку выше, внутри и ниже пирамидального слоя гиппокампа соответственно. Чтобы облегчить резку, проведите на плоттерной бумаге четкую линию с углом 60 градусов (линия 60 градусов).
3. Для каждой пучка электродов HPC отрежьте 4 куска электродной проволоки длиной 4,5 см каждый. Для каждой связки электродов ПФУ и РСК отрежьте 4 куска электродной проволоки длиной 3,5 см каждый.
4. Аккуратно поднимите 4 провода, коснувшись их кончиком пальца (они прилипнут к нему) и расположите их как можно ближе друг к другу на малярном скотче. Следите за тем, чтобы не класть их друг на друга.
5. Под микроскопом с помощью щипцов расположите провода как можно ближе. Нанесите тонкий слой жидкого цианоакрилатного клея на первые 2 см верха жгута. Для связки HPC приклейте > 2 см и < 3,5 см проволоки. Подождите, пока клей высохнет.
6. Осторожно коснитесь проводов щипцами под микроскопом. Если они не отделяются, то склеиваются правильно. В качестве проверки здравого смысла убедитесь, что слой клея блестит под светом микроскопа.
7. После полного высыхания снимите пучок проводов с ленты и перенесите его на пластину с плоттерной бумагой. Под микроскопом проверьте пучок проволоки на предмет излишков клея сверху или по бокам, и аккуратно удалите его лезвием скальпеля.
8. Для жгутов RSC сделайте прямой разрез в нижней части массива, перпендикулярно направлению проводов.
9. Для пучков HPC поместите массив на плоттерную бумагу так, чтобы он пересекал линию под углом 60 градусов, и используйте линию в качестве направляющей, чтобы сделать разрез под углом 60 градусов к направлению проводов.
   1. Затем с помощью лезвия скальпеля осторожно отсоедините самый короткий из 4 проводов от пучка. Обрежьте проволоку перпендикулярно направлению проволоки, укоротив ее примерно до 0,75 мм по сравнению со второй по длине проволокой в пучке.
10. Для пучков PFC разделите нижнюю часть массива на два 2-проводных пучка. Убедитесь, что два провода хорошо склеены друг с другом. Укоротите один из пучков 2-х проводов на 1 мм, разрезав его перпендикулярно направлению провода. На дополнительном рисунке 1 (внизу) и дополнительном рисунке 2b приведены изображения перерезанных пучков проводов.

8. Подготовка провода заземления и проводов ЭЭГ

1. Вытолкните не менее 10 контактов SIP/DIP из соединительной соединительной полосы гнезда SIP/DIP с шагом 1,27 мм.
2. Отрежьте 2 куска длиной 6 см для заземляющего (GND) провода. Отрежьте 8 кусков длиной 6 см для провода ЭЭГ. С помощью лезвия скальпеля осторожно снимите часть изоляции с обоих концов всех проводов.
3. Поместите винт M1x3 из нержавеющей стали в третью руку, оставив как можно больше места под головкой винта. Оберните неизолированную сторону провода GND или EEG вокруг хвостовика винта, прямо под головкой винта.
4. Нанесите небольшое количество паяльного флюса с помощью небольшой иглы или зубочистки. Припаяйте провод к винту. Следите за тем, чтобы случайно не засорить паз головки винта.
5. Поместите штифт SIP/DIP в третью руку так, чтобы была доступна внутренняя сторона. Вставьте обеззоленную часть с противоположной стороны провода в контакт SIP/DIP. Нанесите небольшое количество паяльного флюса и припаяйте провод к контакту.
6. Снимите припаянный винт-проволочный узел с держателя. Эта сборка будет имплантирована в череп во время операции по имплантации.
7. Поместите еще один контакт SIP/DIP в держатель, повернутый на 180 градусов (т. е. доступ со стороны вилки). Нанесите небольшое количество паяльного флюса и припаяйте неизолированную сторону другого провода к наружной стороне контакта.
8. Снимите припаянный узел проволоки и контакта с держателем. Эта сборка позже будет подключена к EIB, а винтовая проволочная сборка, а также проволочная сборка будут соединены друг с другом во время операции по имплантации с помощью двух контактов.
9. Чтобы укрепить паяные соединения, нанесите небольшое количество цианоакрилатного клея на соединение между проводами и контактами.
10. После того как клей высохнет, убедитесь, что контакты SIP/DIP двух сборок могут быть соединены плавно. Используйте опцию «Проверить непрерывность» мультиметра, чтобы убедиться в наличии непрерывного соединения между винтом и неизолированным концом провода в сборе контактов, когда обе сборки соединены. По желанию, пометьте каждый комплект проводов лаком для ногтей цветом (см. Таблицу материалов), чтобы упростить правильное соединение во время операции по имплантации.

9. Загрузка пучков проводов в привод

1. Прикрепите диск к держателю. Будьте осторожны, чтобы не оказать слишком большого давления на EIB и не повредить разъем высокой плотности на этом этапе.
2. Как только корпус привода окажется в устойчивом положении, возьмите один из пучков проводов и осторожно вставьте его в соответствующую полиимидную трубку вручную или с помощью пары тонких щипцов. Убедитесь, что массив проводов расположен в правильной ориентации (например, для массива PFC два более длинных провода массива должны быть обращены медиально), и будьте осторожны, чтобы не согнуть массив проводов.
3. Повторите последний шаг для всех остальных пучков проводов.
4. С помощью тонких щипцов возьмите одну из проволок и осторожно согните ее в сторону отверстия, в которое вы хотите ее вставить. После вставки используйте золотую булавку, чтобы вставить ее в отверстие EIB. Повторите это для всех проводов пучка и для всех пучков.
   1. Убедитесь, что на этом этапе провода образуют красивую петлю над EIB (таким образом, все еще остается место для перемещения пучка вверх и вниз по полиимидной трубке, чтобы отрегулировать длину в нижней части трубки) и что массив, торчащий из нижней части полиимидной трубки, случайно не согнут. Обязательно запишите, какой провод каждого пучка проводов подключается к каждому каналу на EIB. На дополнительном рисунке 1 приведена подробная информация о отображении каналов TD Drive.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, после загрузки каждого пучка проводов (шаг 9.2), можно напрямую подключить провода к EIB (шаг 9.4), а затем перейти к шагу 9.2 + 9.4 для остальных пучков проводов. Это может варьироваться в зависимости от личных предпочтений экспериментаторов. На дополнительном рисунке 2b приведен пример загруженного TD Drive.
5. Отрегулируйте длину пучков проводов, чтобы правильно определить места записи, осторожно надавливая или вытягивая пучки проводов внутрь или из направляющей трубки (см. дополнительный рисунок 2d).
   Примечание: Поскольку направляющие трубки разрезаются так, чтобы они располагались на одном уровне с поверхностью мозга, расстояние, на которое пучок проволоки выходит за пределы направляющей трубки, соответствует дорсовентральному расположению целевой области. Подвижные пучки проводов HPC должны быть заподлицо с нижней частью направляющей трубы, неподвижные пучки RSC должны выступать на 1,5 мм, а неподвижные пучки PFC должны выступать за пределы направляющих труб на 3,5 мм. При проталкивании или вытягивании проводов в сборе будьте осторожны, чтобы не вытянуть отдельные провода из EIB сверху и не согнуть нижнюю часть пучка проводов.
6. Когда неподвижные массивы проводов (RSC и PFC) будут выровнены, нанесите небольшое количество прочного эпоксидного клея на верхнюю часть направляющих трубок, приклеивая пучки на место. Пока эпоксидная смола затвердевает, убедитесь, что пучки проводов все еще правильно выровнены внизу.
7. Чтобы зафиксировать подвижные массивы проводов HPC, сначала переместите шаттл в максимально необходимое положение (в экспериментах, описанных в этой статье, не менее чем на 16 полных оборотов/4 мм выше самого низкого положения). Затем протолкните пучки проводов в U-образное отверстие челнока и приклейте их на место небольшим количеством крепкого эпоксидного клея.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эпоксидная смола не стекает по пучку в полиимидную трубку. Когда эпоксидная смола затвердеет, нанесите второй слой эпоксидной смолы на то же место, чтобы укрепить соединение и снизить вероятность разрыва соединения при перемещении челнока.
8. Осторожно вставьте открытый конец контактного узла провода GND через одно из сквозных отверстий с маркировкой GND. Закрепите его с помощью золотого штифта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании главного каскада, в котором каналы GND и опорные каналы (REF) закорочены, также можно использовать канал REF, если это более удобно.
9. Извлеките привод из держателя; Будьте осторожны, чтобы не согнуть ни один из проводных узлов. Снова прикрепите переднюю часть накопителя в тот же держатель и вставьте 4 узла проводных контактов ЭЭГ в сквозные отверстия для каналов ЭЭГ (обозначены 2,4, 29, 31) и зафиксируйте их золотым штифтом каждый.
10. Для всех проводов GND и EEG используйте мультиметр на настройке непрерывности, чтобы проверить непрерывное соединение между золотым контактом на EIB и контактом подключенного узла провода-контакта.
11. Сохраните диск. Это можно сделать, например, прикрепив колпачок к корпусу дисковода и храня его вверх ногами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед хирургической имплантацией простерилизуйте дно диска с помощью этанола. Все костные винты и сборки проводов GND/EEG должны быть стерилизованы в этаноле. Хирургические инструменты должны быть стерилизованы с помощью автоклава.

10. Операция по имплантации привода

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе кратко описываются хирургические процедуры по имплантации TD Drive. Более подробный протокол имплантации, включающий описание инструментов, а также дозы и концентрации препаратов, можно найти в Дополнительном файле 1.

1. Стерилизуйте хирургические инструменты, очистите и продезинфицируйте операционную зону в соответствии с местными рекомендациями учреждения. Чтобы стерилизовать имплантаты, поместите части электродных проводов, которые будут контактировать с мозгом, в этанол не менее чем на одну минуту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие этанола или его паров может ослабить цианоакрилатный клей. Если пары не задерживаются, продлите время погружения проводов в этанол. Для того чтобы убедиться в целостности клея, рекомендуется найти оптимальное время с помощью тестового имплантата, который не используется в реальном эксперименте.
2. Обеспечить необходимую упреждающую анальгезию, антибиотики и газовую анестезию (изофлуран) в соответствии с институциональными и местными рекомендациями.
3. Поместите крысу в стереотаксический аппарат. Выбрейте макушку головы и продезинфицируйте кожу повидон-йодом. Подкожно нанесите местный анестетик (лидокаин) и сделайте небольшой разрез на черепе сверху по средней линии.
4. Обнажите череп, оттянув кожу в сторону. Удалите соединительную ткань на верхней части черепа, высушите и очистите поверхность черепа. Аккуратно отделите мышцы на боковой стороне черепа, чтобы можно было разместить анкерные винты.
5. Измерьте координаты брегмы и лямбды. Для точного нацеливания убедитесь, что поверхность черепа параллельна переднезадне-медиолатеральной плоскости стереотаксиса, измерив разницу в дорсовентральном положении брегмы и лямбды. Если координаты отличаются, отрегулируйте положение крысы в стереотаксисе, подняв или опустив мундштук.
6. Отметьте краниотомии вокруг целевых мест (прелимбическая кора (AP +3,5 мм и ML +-1 мм), ретросплениальная (AP +5,8 мм и ML +-1 мм и гиппокамп (AP -3,8 мм и ML +-2,5 мм)).
7. Просверлите отверстия для винтов GND/EEG и анкерных винтов. Вставьте винты и покройте их жидким стоматологическим акрилом. Просверлите краниотомию и аккуратно удалите твердую мозговую оболочку. Не допускайте пересыхания краниотомии, применяя стерильный физиологический раствор.
8. Осторожно расположите TD Drive в верхней части краниотомии, убедившись, что направляющие трубки находятся на одном уровне с черепом. Защитите направляющие трубки вазелином и прикрепите TD Drive к черепу стоматологическим акрилом.
9. Медленно опустите проволочные массивы, нацеленные на HPC, от их исходного местоположения (~1,5 мм DV от поверхности мозга) к пирамидальному слою гиппокампа CA1. Пирамидальный слой был достигнут постепенно в последующие дни во время проверки сигналов в период восстановления крыс.
10. Наденьте защитный колпачок на дисковод.
11. Выключите газовую анестезию и извлеките крысу из стереотаксической рамки. Поместите крысу в чистую клетку внутри отапливаемой камеры и обеспечьте ее влажным кормом и водой для восстановления. Следите за крысой, пока она снова не станет активной, передвигаясь по клетке, едя и пья.
12. Верните крысу обратно в комнату для проживания. Обеспечьте послеоперационное обезболивание и уход в соответствии с рекомендациями учреждения. Например, см. пример протокола операции в Дополнительном файле 1.

11. Восстановление ЕИБ

1. В конце эксперимента извлеките диск из коллекции и снимите защитную крышку.
2. Снимите золотые штифты и осторожно подсоедините электродные провода. Открутите EIB от корпуса диска. Осторожно протолкнув мягкий пинцет между EIB и корпусом диска или осторожно подняв EIB вручную, освободите оставшуюся цианоакрилатную связь, которая удерживает EIB к телу.
3. Очистите штифты EIB и золотые штифты для повторного использования на последующих имплантатах TD Drive. Перед повторным использованием EIB проверьте переходные отверстия с золотыми контактами и соединитель высокой плотности на предмет износа. Используйте EIB повторно только в том случае, если переходные отверстия достаточно целы, чтобы обеспечить хорошее соединение между золотыми контактами, электродными проводами и EIB, и если соединение разъема высокой плотности с верхней частью сцены все еще достаточно стабильно.

Результаты

Используя инструкции, предоставленные в протоколе, TD Drive может быть легко собран несколькими экспериментаторами. После развития драйва (n = 4) был запущен полный пилот с восемью животными. Была имплантирована дополнительная партия из восьми животных, а также проведен э?...

Обсуждение

В этой статье представлен адаптируемый имплантат для двусторонней, симметричной многозонной записи проволочных электродов для свободно движущихся крыс.

Возможность простой регулировки имплантата путем изменения заданных параметров стала одной из м...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm drill bit	McMaster	2951A38
1.27 mm pitch interconnected SIP/DIP socket (Mill-Max)	Mouser Electronic	575-003101	For essembling and connection of EEG & GND screws
5 minute epoxy	Bison	Commercially available	regular off-the-shelf epoxy
cyanoacrylate glue	Loctite		Super Glue-3
EEG wire	Science Products GmbH	7SS-2T
Electrode wire	Science Products GmbH	NC7620F
Ethanol	LC		For standard pre-operative sterilization procedure of drive
Fine forceps (5)	FST	91150-20	For wire bundle preperation and handling
Form 3B	Formlabs		3D printer used to 3D print the self-printed parts of the TD drive
Gold pins (small)	Neuralynx, Inc.	9885	Attachment of electorde wires to EIB board
Ground wire	Science Products GmbH	SS-3T/A
High-density connector	LabMaker GmbH/Omnetics	A79026-001
Lister Hodded rats	Charles River Laboratories	Crl:LIS	we used male rats, 9-12 weeks of age at arrival
M1 brass insert	AliExpress	Commercially available	https://aliexpress.com/item/33047616164.html
M1 tap	McMaster	2504A33
M1x16 screw	Bossard	1096613
M1x3 stainless steel screws	Screws and More	84213_14985
M2.5x5 polyimide screws	Screws and more	7985PA25S_50
mineral oil	McMaster	1244K14
Nail polish	Etos	Commercially available	For color coding EEG and GND wires
painter's tape	Gamma	Commercially available	For wire bundle preperation
Pin vise	McMaster	8455A16
plotting paper	Canson	Commercially available	For wire bundle preperation
polyimide tubes	Amazon / Small Parts	TWPT-0159-30-50	AWG, 0.0159" ID, 0.0219" OD, 0.0030" Wall, 30" Length
RHD 32-channel headstage with accelerometer	Intan Technologies, LLC	C3324	For tethered recordings in the sleepbox
RHD 3-ft (0.9 m) standard SPI cables	Intan Technologies, LLC	C3203	From commutator to headstage
RHD 6-ft (1.8 m) standard SPI cables	Intan Technologies, LLC	C3206	From OpenEphys box to commutator
Slip Ring with Flange	Adafruit	1196	Commutator: 22 mm diameter, 12 wires
Solder flux	Griffon S-39 50 ml	Commercially available	For soldering EEG & GND screws
soldering paste	Amazon	B08CBZ5HC5
stainless steel M2 nut	McMaster	93935A305
Tethered recording setup	OpenEphys	Acquasition Board
Wireless recording logger	SpikeGadgets	miniLogger 32	For wireless recordings in the task
Wireless recording setup	SpikeGadgets	Main Control Unit (MCU) incl. breakout board and RF transceiver	For wireless recordings in the task