JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מודל מורין זה משלב עלבון ספטי עם חוסר שימוש בשרירי הגפיים האחוריות כדי לשחזר את התכונה המרותקת למיטה של חולה ספיגה טיפוסי. המודל מייצג סטייה משמעותית ממודלים קודמים לחקר תפקוד לקוי של שרירים באלח דם והוא גישה ניתנת לשחזור לטיפול באסטרטגיות טיפוליות לטיפול במצב זה.

Abstract

אלח דם הוא גורם עיקרי למוות בבית החולים. שיפורים בטיפול מביאים למספר גדול יותר של ניצולי אלח דם. כ-75% מהמחלימים מפתחים חולשת שרירים וניוון, מה שמגביר את שכיחות האשפוזים החוזרים והתמותה בבתי החולים. עם זאת, המודלים הפרה-קליניים הזמינים של אלח דם אינם מטפלים בחוסר שימוש בשרירי השלד, מרכיב מפתח להתפתחות מיופתיה הנגרמת מאלח דם. מטרתנו בפרוטוקול זה היא לספק הנחיה שלב אחר שלב למודל עכבר המשחזר את הסביבה הקלינית שחווה מטופל ספטי המרותק למיטה. עכברי C57Bl/6 זכרים שימשו לפיתוח מודל זה. עכברים עברו קשירה וניקוב צקאלי (CLP) כדי לגרום לאלח דם. ארבעה ימים לאחר CLP, עכברים היו נתונים להשעיית גפיים אחוריות (HLS) במשך שבעה ימים. התוצאות הושוו עם ניתוחים מותאמי דמה ו/או בעלי חיים עם אמבולציה רגילה (NA). השרירים נותחו לצורך מכניקת שרירים חוץ גופית והערכות מורפולוגיות. המודל גורם לניוון שרירים ניכר ולחולשה, פנוטיפ דומה שנצפה בחולים ספיגה. המודל מייצג פלטפורמה לבחינת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות להפחתת מיופתיה הנגרמת מאלח דם.

Introduction

אלח דם הוא מצב מסכן חיים עקב תגובה חיסונית פעילה יתר על המידה המשפיעה לרעה על מערכות איברים מרובות, וכתוצאה מכך נטל גדול על מערכות בריאות ברחבי העולם1. לאחרונה, התמותה בבית החולים הקשורה לאלח דם ירדהעקב ניהול משופר של יחידות טיפול נמרץ 1,2. עם זאת, כ-75% מהמטופלים ששרדו את הפגיעה הספטית הראשונית מפתחים ניוון שרירי השלד (למשל, ירידה בשטח החתך) וחולשה (למשל, ירידה בכושר ייצור הכוח)3,4. תופעה זו מאופיינת כמיופתיה הנגרמת מאלח דם, קשורה מאוד לפעילות גופנית לקויה וחוסר עצמאות בביצוע מטלות יומיומיות, מה שמוביל לאשפוז חוזר ולתמותה תוך חמש שנים מפרק5 הראשוני.

בשל זיהום אגרסיבי וכללי, חולים ספטיים נחשפים לתקופות ממושכות של מנוחה במיטה בזמן שהם מתאוששים בטיפול נמרץ. בהקשר זה, שריר השלד עובר חוסר שימוש חמור, אשר ככל הנראה מחמיר ניוון שרירים וחולשה 3,4. נכון לעכשיו, אף טיפול לא טיפל ביעילות במיופתיה הנגרמת מאלח דם. המודלים הפרה-קליניים הזמינים שנועדו לטפל במיופתיה השתמשו בקשירה וניקוב cecal (CLP)6, cecal slurry7, או הזרקה של lipopolysaccharide מטוהר (LPS), שהוא מרכיב של דופן התא בחיידקים גראם-שליליים8. למרות שמודלים אלה מצליחים לספק זיהום, הם אינם משחזרים כראוי את חוסר השימוש בשרירים שנצפה בפונדקאים ספטיים מעבר לירידה טבעית בפעילות גופנית שנצפתה בבעלי חיים ספטיים9.

המטרה העיקרית של מחקר זה היא לספק תיאור מפורט של איך לבצע כראוי את המודל של מיופתיה הנגרמת על ידי אלח דם עם חוסר שימוש בעכברים. אנו מדגימים את ההיתכנות של שילוב CLP כמודל של אלח דם עם מתלה גפיים אחוריות (HLS) כמודל של חוסר שימוש לחקר מיופתיה הנגרמת מאלח דם בעכברים3. יתר על כן, תוצאות מייצגות של מכניקת שרירים ושינויים מורפולוגיים אופייניים בתגובה למודל מסופקות גם כן.

Protocol

הנהלים נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת פלורידה IACUC (#202200000227). עכברי C57BL/6J זכרים, בני 17 שבועות, עם מסת גוף שנעה בין 27 גרם ל-34 גרם, שימשו במחקר הנוכחי. הליכי הניסוי וציר הזמן המתוארים בפרוטוקול זה מתוארים באיור 1. כפי שצוין, הפרוטוקול משתרע על פני 11 ימים בסך הכל. בעלי חיים עוברים ניתוח הישרדות (CLP/Sham) ביום 0, ואחריו ארבעה ימים של תמיכה בנוזלים ובמשככי כאבים. ביום הרביעי, בעלי חיים מתחילים HLS למשך 7 ימים. ניסויי טרמינל נערכים ביום ה-11. פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. קשירה וניקוב ססלי (CLP)

  1. לאחר קבלת בעלי החיים מהמקור המסחרי, תן להם להתאקלם במתקן בעלי החיים לפחות 1 שבוע לפני ביצוע ניתוחי CLP (או דמה). זה יעזור למזער את הלחץ הקשור תחבורה.
  2. קבץ את העכברים, תוך שמירה על הנחיות IACUC המקומיות.
    הערה: כהנחיה כללית, החיות שוכנות במקסימום 5 עכברים לכלוב עד ליום הניתוח. כלובים סטנדרטיים, ברוחב 7.25 אינץ', באורך 11.75 אינץ' ובגובה 5 אינץ', מנוצלים ומרוהטים במצעי קלחי תירס. מחזור אור-חושך של 12 שעות: 12 שעות נשמר, עם אורות דולקים בשעה 07:00 וכבויים בשעה 19:00. טמפרטורת הדיור נשמרת ב 20-22 מעלות צלזיוס, והלחות היחסית (RH) נשמרת בין 30% ל -60%. מובטחת גישה לדיאטת צ'או סטנדרטית ולמים.
  3. כדי לבצע CLP, יש להרדים את בעל החיים עם איזופלורן (2.5%, 500 מ"ל/דקה) בתא אינדוקציה. יש לאשר את ההרדמה על ידי צביטת הכף בפינצטה. לאחר הרדמה עמוקה, כפי שאושר על ידי היעדר נסיגה רפלקס מצביטת כפות, להעביר את החיה להמשך הרדמה באמצעות חרוט האף (2.5%, 100-125 מ"ל / דקה).
    הערה: יש להשתמש בטכניקות אספטיות לאורך כל ההליך.
  4. יש למרוח משחה וטרינרית לכיסוי העיניים כדי להגן על עיני בעל החיים מפני נזק או פציעה פוטנציאליים הנגרמים על ידי חרוט האף במהלך הניתוח.
  5. כדי לנקות את אתר הניתוח, השתמש במסיר שיער זמין מסחרית. הסר את הפרווה מהבטן התחתונה בלבד, תוך הימנעות מחשיפת יתר של העור.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בקוצצי שיער של בעלי חיים, אך יש להקפיד להימנע מנזק לעור.
  6. לאחר חשיפת אתר הניתוח, נקו את האזור עם שלושה מריחה של פובידון-יוד (או פילינג חיידקי שווה ערך), ולאחר מכן שטיפה עם 70% אלכוהול בין כל מריחה.
  7. יש לתת מנה אחת של 3.25 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין בשחרור מושהה או שווה ערך, בהתאם לטיפול משכך כאבים שאושר על ידי IACUC המקומי שלך.
  8. העבר את העכבר לאזור הניתוח. בודד את אתר הניתוח באמצעות דבק. בהרדמה עמוקה, בצע חתך קו אמצע גחוני (~ 2 ס"מ) בעור באמצעות להב אזמל.
    1. השתמש מספריים כדי להפריד את העור משכבת השריר. באמצעות להב אזמל, לבצע חתך קטן יותר (~ 1 ס"מ) בשכבת השריר. לאחר הדמיה של המעיים, באמצעות מלקחיים קהים, אתר את הצקום והפוך אותו החוצה.
  9. לאחר היציאה החוצה, לקשור את הצקום באמצעות תפר סטרילי 5-0 פוליגלקטין נספג. קחו בחשבון את אזור הצקום הקשור, המוגדר כמרחק מהקצה הדיסטלי של הצקום לנקודת הקשירה, שכן הוא יתרום לחומרת הזיהום. כדי לשחזר את התוצאות המוצגות כאן, לקשור את cecum 1 ס"מ מן הנקודה הדיסטלית שלה.
    הערה: קשירת שטח צקום גדול יותר תגרום לחומרה מוגברת10.
  10. באמצעות מחט 27 גרם, לנקב את הצקום דרך ודרך, המאפשר לתוכן הצואה לדלוף. בזהירות, לסחוט בעדינות את cecum כדי להחצין את התוכן צואה. כדי לבצע ניתוח דמה, בצע את אותם השלבים החושפים את צקום החיה. עם זאת, אין לנקב ולא לנקב את cecum.
    הערה: מד המחט משפיע ישירות על חומרת הזיהום. כדי לייצר זיהום בדרגה נמוכה, 26 גרם עד 28 מחטים מומלץ. שים לב ששימוש במדי מחטים עבים יותר יגרום לשיעור תמותה מוגבר, ובעלי חיים עשויים שלא לסבול את שלב השעיית הגפיים האחוריות של הפרוטוקול.
  11. מקם מחדש את הצקום לתוך חלל הבטן. סוגרים את שכבת השריר בתפר סטרילי נספג 5-0. סגרו את העור בתפר 5-0 ניילון, שאינו נספג. לאחר שתפר העור הושלם, ספקו מי מלח סטריליים (1 מ"ל לזכרים ו-0.5 מ"ל לנקבות) באמצעות הזרקה תת עורית בחלק האחורי של החיה.
    הערה: לסגירת שכבת השריר מומלצת טכניקת תפירה רציפה, ואילו לשכבת העור מומלצת טכניקת תפירה קטועה. התייעץ והתאם להנחיות IACUC המקומיות שלך לתפירה בניתוח הישרדות.
  12. לאחר הניתוח, יחיד לשכן את החיות בכלוב נקי על גבי מזרן חימום או כרית חימום להגדיר על 35 מעלות צלזיוס. התבונן בעכבר כל 15 דקות במהלך השעה הראשונה לאחר התאוששות ההרדמה, ולאחר מכן ניתן להחזיר אותו למתקן הדיור.
    הערה: ספקו כמות מינימלית של צ'או על רצפת הכלוב כדי לאפשר לבעלי חיים מזון ללא השפעה על אתר הניתוח. לאחר החזרה למתקן, בעלי החיים נבדקים פעמיים ביום לאחר הערכת בעלי החיים הספטיים (שלב 3).
  13. ספק תמיכה סטרילית במי מלח ומשככי כאבים במהלך ארבעת הימים הבאים כדי לאפשר לחתך הניתוחי להחלים.
    הערה: ניטור טמפרטורת פני השטח של הקסיפואיד ומשקל הגוף מדי יום מסייע לשמור רשומות מדויקות של חומרת אלח דם11.

2. מתלה גפיים אחוריות (HLS)

  1. כדי לבצע את ה-HLS, על החוקרים לפעול בהתאם להנחיות האתיקה המקומיות של IACUC. זה כולל הבטחת שימוש במידות כלוב וריצוף מתאימים, שהם היבטים חיוניים להתאמת הרגלי תנועה, אכילה ושתייה של בעלי חיים בתנאי HLS.
    הערה: 4 ימי החלמה לאחר CLP מומלצים לריפוי פצעים.
  2. לאחר 4 ימי החלמה מניתוח CLP או דמה, יש להרדים את בעל החיים תחת זרימת איזופלורן קלה (2.5%, 100-125 מ"ל/דקה). חבר את זנב העכבר לשרשרת מתכת קצרה באמצעות סרט קצף. הניחו את שרשרת המתכת במקביל לזנב בעוד סרט הקצף חובק בחוזקה את הזנב והשרשרת יחד.
  3. כדי להבטיח את השעיית הגפיים האחוריות, חברו את שרשרת המתכת לוו המחובר למוט לאורך מרכז הכלוב. בנוסף, הדביקו מוט קטן נוסף שיכול לנוע לאורך המוט כדי לאפשר יכולת תנועה גדולה יותר לחיה.
    הערה: בעלי חיים חייבים להיות מסוגלים לנוע דרך הגפיים הקדמיות שלהם על ידי שימוש ברשת המתכת על רצפת הכלוב.
  4. התאימו את גובה הגפיים התלויות כדי למנוע מגע של הכפות עם כדורי הצ'או. יש לעקוב אחר בעלי החיים ולנקות את האזור המגולח סביב העור התפור ביד עם צמר גפן ספוג מים לפחות פעמיים ביום במהלך תקופת התרחיף.
    הערה: ניקוי הוא חיוני כדי למנוע זיהום באתר הניתוח, במיוחד מ שתן קשקשת עקב תנוחת הגוף מורם.
  5. כדי לשחזר את התוצאות, ודא כי בעלי החיים עוברים 7 ימים של השעיה הגפיים האחוריות. משך הזמן נקבע על סמך מחקרי קורס קודמים שהראו את הזמן המינימלי הדרוש למתלה בגפיים האחוריות כדי לעורר השפעות משמעותיות על שרירי השלד בתנאים לא ספטיים12,13.
    הערה: הישרדות בעלי חיים, אי נוחות או מצוקה יגדלו בהתאם לחומרת הזיהום.

3. הערכת בעלי חיים ספטיים

הערה: הערכת המצב הקליני של בעל החיים היא היבט מרכזי במעקב אחר חומרת ניתוחי CLP/דמה. כמו כן, כנדרש על ידי IACUC, יש להקים נקודות קצה אנושיות לרווחת בעלי חיים. כדי להתמודד עם חששות אלה ולספק סטנדרטים לטיפול יומיומי בבעלי חיים, נעשה שימוש בהנחיות לביצוע הערכה של בעלי חיים באמצעות ציון אלח דם מורין שונה (MMSS)14.

  1. השתמש ב-MMSS (קובץ משלים 1) כדי להעריך את החיה. שימו לב שעבור כל קטגוריה, ציון 0 מייצג חיה בריאה. ציון החיה פעמיים ביום מ 0 עד 3 על פי חומרת הזיהום.
  2. כדי לשפר את הדיוק, מדדו את טמפרטורת פני השטח ומשקל הגוף פעמיים ביום11,15 והקליטו יחד עם גיליון הניקוד של MMSS.
    הערה: תנודות אופייניות בטמפרטורת פני השטח ובמשקל הגוף מסופקות באיור משלים 1.
  3. התייעץ עם IACUC המקומי לקבלת נקודות קצה אנושיות.
    הערה: כדי לשחזר את התוצאות, הקריטריונים הבאים שימשו כנקודות קצה: (1) ירידה במשקל הגוף >40% מנקודת ההתחלה. (2) טמפרטורה <30°C או הפחתה של >5°C מערך קודם. (3) ציון 3 באלה: תגובה לגירוי, רמת הכרה או איכות נשימה. (4) סה"כ MSSS יומי ≥17. ההערכה המתוארת כאן מיועדת להתבצע לאחר הניתוח ובבעלי חיים העוברים אמבולציה תקינה. מומלץ להימנע מטיפול בבעלי חיים העוברים HLS כדי למנוע מגע בין הגפיים האחוריות למשטחים. לאחר ההערכה הסופית, יש להרדים את בעל החיים בהתאם להמלצות הוועדה המקומית לאתיקה של בעלי חיים.

תוצאות

עבור הנתונים המייצגים המוצגים בתוצאות, עכברים זכרים C57BL/6J, בני 17 שבועות, עם מסת גוף הנעה בין 27 ל -34 גרם, שימשו. השלמת הפרוטוקול כולו אורכת אחד עשר ימים והיא כוללת את התערבות הניתוח (CLP או דמה), תמיכה במי מלח ומשככי כאבים (ימים 0 עד 4), והפסקת השימוש ב- HLS (ימים 4 עד 11). ניתן לבצע ניסו...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מספק הנחיות טכניות ליישום מודל פרה-קליני חדש של מיופתיה הנגרמת מאלח דם. כל החומרים והצעדים החשובים מתוארים בפירוט לשכפול המודל. גישה זו יכולה לשחזר את תפקוד שרירי השלד הלקוי שנצפה בחולים ספיגה, ולהדגיש את התפקיד של חוסר שימוש כמרכיב מכריע בהחמרת מיופתי?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21 AG072011 ל-OL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-0 Ethicon Coated VicrylEthiconD5792Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18" Ethicon662GNon absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 GBD305136 for 27g needleNeedle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice Jackson Laboratory strain #000664
Cotton Tipped ApplicatorsPuritanS-18991Swabs for topical application of iodine.
Cryostat(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep SolutionDynarex1415Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)Fisher ScientificTo make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension CagesCustom MadeN/AThese custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye LubeOptixcareEye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11Fine ScienceBlade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-TracZimmer736579Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital VaporizerKent Scientific CorporationSS-01Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus Aurora ScientificModel 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C

References

  1. Prescott, H. C., Angus, D. C. Enhancing recovery from sepsis. JAMA. 319 (1), 62-75 (2018).
  2. Stortz, J. A., et al. Benchmarking clinical outcomes and the immunocatabolic phenotype of chronic critical illness after sepsis in surgical intensive care unit patients. J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 342-349 (2018).
  3. Laitano, O., et al. The impact of hindlimb disuse on sepsis-induced myopathy in mice. Physiological Rep. 9 (14), e14979 (2021).
  4. Callahan, L. A., Supinski, G. S. Sepsis-induced myopathy. Crit Care Med. 37, S354-S367 (2009).
  5. Cuthbertson, B. H., et al. Mortality and quality of life in the five years after severe sepsis. Crit Care. 17 (2), R70 (2013).
  6. Schmitt, R. E., et al. Muscle stem cells contribute to long-term tissue repletion following surgical sepsis. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 14 (3), 1424-1440 (2023).
  7. Owen, A. M., et al. Chronic muscle weakness and mitochondrial dysfunction in the absence of sustained atrophy in a preclinical sepsis model. eLife. 8, e49920 (2019).
  8. Chen, J., et al. Cellular senescence implicated in sepsis-induced muscle weakness and ameliorated with metformin. Shock. 59 (4), 646 (2023).
  9. Granger, J. I., Ratti, P. L., Datta, S. C., Raymond, R. M., Opp, M. R. Sepsis-induced morbidity in mice: effects on body temperature, body weight, cage activity, social behavior and cytokines in brain. Psychoneuroendocrinology. 38 (7), 1047-1057 (2013).
  10. Ruiz, S., et al. Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture. Intensive Care Med Exp. 4 (1), 22 (2016).
  11. Laitano, O., et al. Xiphoid surface temperature predicts mortality in a murine model of septic shock. Shock (Augusta, Ga). 50 (2), 226-232 (2018).
  12. Park, S., Brisson, B. K., Liu, M., Spinazzola, J. M., Barton, E. R. Mature IGF-I excels in promoting functional muscle recovery from disuse atrophy compared with pro-IGF-IA. J App Physiol. 116 (7), 797-806 (2013).
  13. Spradlin, R. A., et al. Deletion of muscle Igf1 exacerbates disuse atrophy weakness in mice. J App Physiol. 131 (3), 881-894 (2021).
  14. Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7 (1), 233 (2014).
  15. Mai, S. H. C., et al. Body temperature and mouse scoring systems as surrogate markers of death in cecal ligation and puncture sepsis. Intensive Care Med Exp. 6 (1), 20 (2018).
  16. Vankrunkelsven, W., et al. Development of muscle weakness in a mouse model of critical illness: does fibroblast growth factor 21 play a role. Skelet Muscle. 13 (1), 12 (2023).
  17. Supinski, G., Stofan, D., Nethery, D., Szweda, L., DiMarco, A. Apocynin improves diaphragmatic function after endotoxin administration. J Appl Physiol. 87 (2), 776-782 (1999).
  18. Li, X., et al. Sepsis leads to impaired mitochondrial calcium uptake and skeletal muscle weakness by reducing the micu1:mcu protein ratio. Shock (Augusta, Ga). 60 (5), 698-706 (2023).
  19. Wang, C., et al. Targeting NAT10 protects against sepsis-induced skeletal muscle atrophy by inhibiting ROS/NLRP3. Life Sci. 330, 121948 (2023).
  20. Mankowski, R. T., Laitano, O., Clanton, T. L., Brakenridge, S. C. Pathophysiology and treatment strategies of acute myopathy and muscle wasting after sepsis. J Clinical Med. 10 (9), 1874 (2021).
  21. Oliveira, J. R. S., Mohamed, J. S., Myers, M., Brooks, M. J., Alway, S. E. Effects of hindlimb suspension and reloading on gastrocnemius and soleus muscle mass and function in geriatric mice. Exp Gerontol. 115, 19-31 (2019).
  22. Ashare, A., et al. Insulin-like growth factor-1 improves survival in sepsis via enhanced hepatic bacterial clearance. Am J Respir Crit Care Med. 178 (2), 149-157 (2008).
  23. Starr, M. E., Saito, H. Age-related increase in food spilling by laboratory mice may lead to significant overestimation of actual food consumption: implications for studies on dietary restriction, metabolism, and dose calculations. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1043-1048 (2012).
  24. Crowell, K. T., Soybel, D. I., Lang, C. H. Restorative mechanisms regulating protein balance in skeletal muscle during recovery from sepsis. Shock. 47 (4), 463-473 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

208Disuse

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved