Farelerde Kullanılmayan Sepsis ile İndüklenen Miyopatinin Preklinik Modeli

Özet

Bu murin modeli, tipik septik hastanın yatalak özelliğini özetlemek için septik bir hakareti arka bacak kaslarının kullanılmaması ile birleştirir. Model, sepsiste kas disfonksiyonunu incelemek için önceki modellerden önemli bir ayrılmayı temsil eder ve bu durumu tedavi etmek için terapötik stratejileri ele almak için tekrarlanabilir bir yaklaşımdır.

Özet

Sepsis, hastane içi ölümlerin önemli bir nedenidir. Tedavideki gelişmeler daha fazla sayıda sepsis mağduru ile sonuçlanır. Hayatta kalanların yaklaşık% 75'inde kas güçsüzlüğü ve atrofisi gelişir, bu da hastaneye yatış ve mortalite insidansını artırır. Bununla birlikte, mevcut preklinik sepsis modelleri, sepsise bağlı miyopati gelişimi için önemli bir bileşen olan iskelet kası eksikliğini ele almamaktadır. Bu protokoldeki amacımız, yatalak bir septik hastanın yaşadığı klinik ortamı yeniden üreten bir fare modeli için adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Bu modeli geliştirmek için erkek C57Bl / 6 fareleri kullanıldı. Farelere sepsise neden olmak için çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) uygulandı. CLP'den dört gün sonra, fareler yedi gün boyunca arka bacak süspansiyonuna (HLS) tabi tutuldu. Sonuçlar, sahte uyumlu ameliyatlar ve / veya normal ambulasyonu (NA) olan hayvanlarla karşılaştırıldı. Kaslar in vitro kas mekaniği ve morfolojik değerlendirmeler için diseke edildi. Model, septik hastalarda gözlenen benzer bir fenotip olan belirgin kas atrofisi ve güçsüzlüğü ile sonuçlanır. Model, sepsis kaynaklı miyopatinin azaltılması için potansiyel terapötik stratejileri test etmek için bir platformu temsil eder.

Giriş

Sepsis, birden fazla organ sistemini olumsuz etkileyen ve dünya çapında sağlık sistemleri üzerinde büyük bir yüke neden olan aşırı aktif bir bağışıklık tepkisi nedeniyle yaşamı tehdit eden bir durumdur¹. Daha yakın zamanlarda, sepsise bağlı hastane içi mortalite, yoğun bakım ünitesi (YBÜ) yönetiminin iyileştirilmesi nedeniyle azalmıştır ^1,2. Bununla birlikte, ilk septik hakaretten kurtulan hastaların yaklaşık% 75'inde iskelet kası atrofisi (ör., kesit alanında azalma) ve güçsüzlük (ör., kuvvet üretim kapasitesinde azalma)^3,4. Bu fenomen, sepsise bağlı miyopati olarak karakterize edilmiştir, bozulmuş fiziksel aktivite ve günlük yaşam görevlerini yerine getirme bağımsızlığı eksikliği ile yüksek oranda bağlantılıdır ve ilk bölüm^5'ten sonraki beş yıl içinde yeniden hastaneye yatış ve mortaliteye yol açmıştır.

Agresif ve yaygın bir enfeksiyon nedeniyle, septik hastalar yoğun bakım ünitesinde iyileşirken uzun süreli yatak istirahatine maruz kalırlar. Bu bağlamda, iskelet kası, muhtemelen kas atrofisi ve zayıflığını şiddetlendiren ciddi bir şekilde kullanılmaz^{hale gelir 3,4}. Şu anda, hiçbir tedavi sepsis kaynaklı miyopatiyi etkili bir şekilde ele almamıştır. Miyopatiyi ele almak için tasarlanmış mevcut preklinik modeller, çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP)⁶, çekal bulamaç⁷ veya gram negatif bakterilerde hücresel duvarın bir bileşeni olan saflaştırılmış lipopolisakkarit (LPS) enjeksiyonu kullanmıştır⁸. Bu modeller enfeksiyon sağlamada başarılı olsalar da, septik konakçılarda gözlenen kas kullanımsızlığını, septik hayvanlarda gözlenen fiziksel aktivitede doğal bir azalmanın ötesinde düzgün bir şekilde yeniden üretmezler⁹.

Bu çalışmanın temel amacı, farelerde kullanılmayan sepsis kaynaklı miyopati modelinin nasıl düzgün bir şekilde yürütüleceğine dair ayrıntılı bir açıklama sağlamaktır. Farelerde sepsise bağlı miyopatiyi incelemek için bir sepsis modeli olarak CLP'yi arka bacak süspansiyonu (HLS) ile bir kullanım modeli olarak birleştirmenin fizibilitesini gösteriyoruz³. Ayrıca, kas mekaniğinin temsili sonuçları ve modele yanıt olarak tipik morfolojik değişiklikler de sağlanmaktadır.

Protokol

Prosedürler Florida Üniversitesi IACUC (#202200000227) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu çalışma için vücut kütlesi 27 g ila 34 g arasında değişen 17 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Bu protokolde belirtilen deneysel prosedürler ve zaman çizelgesi Şekil 1'de gösterilmiştir. Belirtildiği gibi, protokol toplam 11 günü kapsar. Hayvanlara 0. günde hayatta kalma ameliyatı (CLP/Sham) uygulanır, ardından dört gün sıvı ve analjezik desteği verilir. 4. Günde, hayvanlar 7 günlük bir süre boyunca HLS'ye başlar. Terminal deneyler 11. günde yapılır. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Çekum ligasyonu ve ponksiyon (CLP)

1. Hayvanları ticari kaynaktan elde ettikten sonra, CLP (veya sahte) ameliyatları yapmadan önce en az 1 hafta hayvan tesisinde alışmalarına izin verin. Bu, ulaşımla ilgili stresi en aza indirmeye yardımcı olacaktır.
2. Yerel IACUC yönergelerine bağlı kalarak fareleri gruplandırın.
   NOT: Genel bir yönlendirme olarak, hayvanlar ameliyat gününe kadar kafes başına en fazla 5 farede barındırılır. 7.25 inç genişliğinde, 11.75 inç uzunluğunda ve 5 inç yüksekliğinde standart kafesler kullanılmakta ve mısır koçanı yatakları ile döşenmektedir. Işıklar sabah 7'de açık ve akşam 7'de kapalı olacak şekilde 12 saat: 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü korunur. Muhafaza sıcaklığı 20-22 °C'de tutulur ve bağıl nem (RH) %30 ile %60 arasında tutulur. Ad libitum ile standart yemek diyeti ve suya erişim sağlanır.
3. CLP'yi gerçekleştirmek için, hayvanı bir indüksiyon odasında izofluran (% 2.5, 500 mL / dak) ile uyuşturun. Pençeyi cımbızla sıkıştırarak anesteziyi onaylayın. Derin anesteziye girdikten sonra, pençe kıstırmadan refleks çekilme olmamasıyla onaylandığı gibi, hayvanı bir burun konisi (% 2.5, 100-125 mL / dak) kullanarak devam eden anesteziye aktarın.
   NOT: Tüm prosedür boyunca aseptik teknikler kullanılmalıdır.
4. Ameliyat sırasında hayvanın gözlerini burun konisinin neden olduğu olası hasar veya yaralanmalardan korumak için veteriner göz kayganlaştırıcı merhem sürün.
5. Cerrahi bölgeyi temizlemek için piyasada bulunan saç çıkarıcıyı kullanın. Cildin aşırı maruz kalmasını önleyerek kürkü yalnızca alt karın bölgesinden çıkarın.
   NOT: Alternatif olarak, hayvan saç kesme makineleri kullanılabilir, ancak cilt hasarını önlemek için özen gösterilmelidir.
6. Cerrahi bölge açığa çıktıktan sonra, alanı üç uygulama povidon-iyot (veya eşdeğer bir mikrop öldürücü ovma) ile temizleyin ve ardından her uygulama arasında% 70 alkol ile durulayın.
7. Yerel IACUC tarafından onaylanan analjezik tedaviye göre, tek bir doz 3.25 mg / kg sürekli salimli buprenorfin veya eşdeğeri uygulayın.
8. Fareyi cerrahi alana aktarın. Yapışkan bir örtü kullanarak cerrahi bölgeyi izole edin. Derin anestezi altında, bir neşter bıçağı kullanarak deride ventral orta hat insizyonu (~ 2 cm) yapın.
   1. Cildi kas tabakasından ayırmak için makas kullanın. Neşter bıçağını kullanarak kas tabakasında daha küçük bir kesi (~ 1 cm) yapın. Bağırsaklar görüntülendikten sonra, künt forseps kullanarak, çekumu bulun ve dışsallaştırın.
9. Dış kısımdan çıkarıldıktan sonra, steril bir 5-0 poliglaktin emilebilir sütür kullanarak çekumu bağlayın. Enfeksiyonun ciddiyetine katkıda bulunacağı için, çekumun distal ucundan ligasyon noktasına kadar olan mesafe olarak tanımlanan bağlanmış çekum alanını düşünün. Burada sunulan sonuçları çoğaltmak için, çekumu distal noktasından 1 cm bağlayın.
   NOT: Daha büyük bir çekum alanının bağlanması, şiddetin^{artmasına neden olacaktır 10}.
10. 27 G'lik bir iğne kullanarak, çekumu baştan sona delerek dışkı içeriğinin sızmasına izin verin. Dikkatle, dışkı içeriğini dışsallaştırmak için çekumu hafifçe sıkın. Sahte ameliyat yapmak için, hayvan çekumunu açığa çıkaran aynı adımları izleyin. Bununla birlikte, çekumu bağlamayın veya delmeyin.
    NOT: İğne ölçer enfeksiyonun şiddetini doğrudan etkiler. Düşük dereceli bir enfeksiyon oluşturmak için 26 G ila 28 G iğneler önerilir. Daha kalın iğne ölçerlerin kullanılmasının ölüm oranının artmasına neden olacağını ve hayvanların protokolün sonraki arka bacak süspansiyon aşamasını tolere edemeyebileceğini lütfen unutmayın.
11. Çekumu karın boşluğuna yerleştirin. Steril 5-0 emilebilir sütür ile kas tabakasını kapatın. Cildi 5-0 naylon, emilmeyen bir sütür ile kapatın. Deri sütürü tamamlandıktan sonra, hayvanın sırtına deri altı enjeksiyon yoluyla steril salin (erkekler için 1 mL ve dişiler için 0.5 mL) sağlayın.
    NOT: Kas tabakasının kapatılması için sürekli dikiş tekniği, cilt tabakası için ise kesikli dikiş tekniği önerilir. Hayatta kalma cerrahisinde dikiş atmak için yerel IACUC yönergelerinize danışın ve bunlara uyun.
12. Ameliyattan sonra, hayvanları bir ısıtma yatağı veya 35 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafeste tek başına barındırın. Anestezi iyileşmesini takip eden ilk saat boyunca her 15 dakikada bir fareyi gözlemleyin, ardından barınma tesisine geri gönderilebilir.
    NOT: Cerrahi bölgeyi etkilemeden hayvanların ad libitum yiyeceklerine izin vermek için kafes tabanında minimum miktarda yem bulundurun. Tesise döndükten sonra, septik hayvan değerlendirmesinin ardından hayvanlar günde iki kez kontrol edilir (aşama 3).
13. Cerrahi insizyonun iyileşmesini sağlamak için takip eden dört gün boyunca steril salin ve analjezik destek sağlayın.
    NOT: Ksifoid yüzey sıcaklığının ve vücut ağırlığının günlük olarak izlenmesi, sepsis şiddetinin¹¹ doğru kayıtlarının tutulmasına yardımcı olur.

2. Arka bacak süspansiyonu (HLS)

1. HLS'yi gerçekleştirmek için, araştırmacılar yerel IACUC etik yönergelerini takip etmelidir. Bu, HLS koşullarında hayvan hareketi, yeme ve içme alışkanlıklarını barındırmak için çok önemli unsurlar olan uygun kafes boyutlarının ve döşemenin kullanılmasının sağlanmasını içerir.
   NOT: Yara iyileşmesi için CLP sonrası 4 günlük iyileşme önerilir.
2. CLP veya sahte cerrahiden 4 günlük iyileşmenin ardından, hayvanı hafif izofluran akışı (% 2.5, 100-125 mL / dak) altında anestezi altına alın. Fare kuyruğunu köpük bant kullanarak kısa bir metal zincire takın. Köpük bant kuyruğu ve zinciri sıkıca sararken metal zinciri kuyruğa paralel olarak yerleştirin.
3. Arka ayakların askıya alınmasını sağlamak için, metal zinciri kafesin ortası boyunca bir çapraz çubuğa bağlı bir kancaya takın. Ek olarak, hayvanın daha fazla hareket kabiliyeti sağlamak için çapraz çubuk boyunca hareket edebilen ikinci bir küçük çubuk yapıştırın.
   NOT: Hayvanlar, kafes tabanındaki metal ızgarayı kullanarak ön ayakları üzerinden hareket edebilmelidir.
4. Pençelerin yemek peletleri ile temasını önlemek için asılı uzuvların yüksekliğini ayarlayın. Hayvanları izleyin ve süspansiyon süresi boyunca günde en az iki kez suya batırılmış bir pamuklu çubukla dikişli derinin etrafındaki traşlı alanı elle temizleyin.
   NOT: Ameliyat bölgesinde, özellikle yükseltilmiş vücut pozisyonu nedeniyle idrar haşlanmasından kaynaklanan enfeksiyonu önlemek için temizlik çok önemlidir.
5. Sonuçları çoğaltmak için, hayvanların 7 gün arka bacak süspansiyonuna maruz kaldığından emin olun. Süre, septik olmayan koşullarda iskelet kasları üzerinde anlamlı etkiler ortaya çıkarmak için arka bacak süspansiyonu için gereken minimum süreyi gösteren önceki zaman kursu çalışmalarına göre belirlendi^12,13.
   NOT: Hayvanların hayatta kalması, rahatsızlığı veya sıkıntısı, enfeksiyonun ciddiyetine göre artacaktır.

3. Septik hayvan değerlendirmesi

NOT: Hayvanın klinik durumunu değerlendirmek, CLP/sahte ameliyatlar sonrası şiddeti takip etmenin önemli bir yönüdür. Ayrıca, IACUC'un gerektirdiği gibi, hayvan refahı için insancıl uç noktalar oluşturulmalıdır. Bu endişeleri gidermek ve günlük hayvan bakımı için standartlar sağlamak için, Modifiye Murin Sepsis Skoru (MMSS) kullanılarak hayvan değerlendirmesi yapmak için talimatlar kullanılmıştır¹⁴.

1. Hayvanı değerlendirmek için MMSS'yi (Ek Dosya 1) kullanın. Her kategori için 0 puanın sağlıklı bir hayvanı temsil ettiğini unutmayın. Enfeksiyonun ciddiyetine göre hayvanı günde iki kez 0'dan 3'e kadar puanlayın.
2. Doğruluğu artırmak için, ksifoid yüzey sıcaklığını ve vücut ağırlığını günde iki kez^11,15 ölçün ve MMSS skor tablosu ile birlikte kaydedin.
   NOT: Tipik ksifoid yüzey sıcaklığı ve vücut ağırlığı dalgalanmaları Ek Şekil 1'de verilmiştir.
3. İnsancıl uç noktalar için yerel IACUC'ye danışın.
   NOT: Sonuçları yeniden oluşturmak için aşağıdaki kriterler son nokta olarak kullanılmıştır: (1) Vücut ağırlığı kaybı taban çizgisinden %>40. (2) Sıcaklık <30 °C veya önceki değerden >5 °C azalma. (3) Aşağıdakilerde 3 puan: Uyarana tepki, bilinç düzeyi veya solunum kalitesi. (4) Toplam günlük MSSS ≥17. Burada açıklanan değerlendirme, ameliyat sonrası ve normal ambulasyon geçiren hayvanlarda yapılmak üzere tasarlanmıştır. Arka ayakları ve yüzeyleri arasındaki teması önlemek için HLS uygulanan hayvanlara dokunmaktan kaçınılması önerilir. Son değerlendirmeden sonra, yerel hayvan etik komitesi tavsiyelerine göre hayvana ötenazi yapın.

Sonuçlar

Sonuçlarda gösterilen temsili veriler için, vücut kütlesi 27 ila 34 g arasında değişen 17 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Tüm protokolün tamamlanması on bir gün sürer ve cerrahi müdahale (CLP veya sahte), salin ve analjezik destek (0 ila 4. günler) ve HLS'nin kullanılmamasından (4 ila 11. günler) oluşur. Terminal deneyleri, süspansiyon fazı boyunca herhangi bir noktada gerçekleştirilebilir. Modelin iskelet kası fonksiyonu üzerindeki etkisini dah...

Tartışmalar

Mevcut protokol, sepsis kaynaklı miyopatinin yeni bir preklinik preklinik modelinin uygulanması için teknik kılavuzlar sunmaktadır. Modelin çoğaltılması için tüm malzemeler ve önemli adımlar ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yaklaşım, septik hastalarda gözlenen iskelet kası disfonksiyonunu yeniden üretebilir ve miyopatinin kötüleşmesinde çok önemli bir bileşen olarak kullanılmamasının rolünü vurgular. Şimdiye kadar, sepsise bağlı miyopatiyi ele al...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Ethicon Coated Vicryl	Ethicon	D5792	Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"	Ethicon	662G	Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G	BD	305136 for 27g needle	Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #000664
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	Swabs for topical application of iodine.
Cryostat	(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415	Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)	Fisher Scientific		To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages	Custom Made	N/A	These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube	Optixcare		Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11	Fine Science		Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac	Zimmer	736579	Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific Corporation	SS-01	Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus	Aurora Scientific	Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C