A Preclinical model of Sepsis-Induced Myopathy with Disuse in mouse(마우스에서 사용하지 않는 패혈증 유발 근병증의 전임상 모델)

요약

이 쥐 모델은 패혈증 모욕과 뒷다리 근육 사용을 결합하여 전형적인 패혈증 환자의 병상 특징을 요약합니다. 이 모델은 패혈증의 근육 기능 장애를 연구하기 위한 이전 모델에서 크게 벗어난 것이며 이 상태를 치료하기 위한 치료 전략을 다루기 위한 재현 가능한 접근 방식입니다.

초록

패혈증은 병원 내 사망의 주요 원인입니다. 치료법이 개선되면 패혈증 생존자의 수가 늘어납니다. 생존자의 약 75%는 근육 약화와 위축으로 인해 병원 재입원 및 사망률이 증가합니다. 그러나 사용 가능한 패혈증의 전임상 모델은 패혈증 유발 근병증 발병의 핵심 구성 요소인 골격근 소실을 다루지 않습니다. 이 프로토콜의 목표는 병상에 누워있는 패혈증 환자가 경험한 임상 환경을 재현하는 마우스 모델에 대한 단계별 지침을 제공하는 것입니다. 이 모델을 개발하기 위해 수컷 C57Bl/6 마우스가 사용되었습니다. 마우스는 패혈증을 유발하기 위해 두부 결찰 및 천자(CLP)를 받았습니다. CLP 4일 후, 마우스는 7일 동안 뒷다리 현탁액(HLS)을 받았습니다. 결과는 가짜 매칭 수술 및/또는 정상적인 보행(NA)을 가진 동물과 비교되었습니다. 체외 근육 역학 및 형태학적 평가를 위해 근육을 절개했습니다. 이 모델은 패혈증 환자에서 관찰되는 유사한 표현형인 현저한 근육 위축과 약화를 초래합니다. 이 모델은 패혈증 유발 근병증의 완화를 위한 잠재적인 치료 전략을 테스트하기 위한 플랫폼을 나타냅니다.

서문

패혈증은 여러 장기 시스템에 악영향을 미치는 과민성 면역 반응으로 인해 생명을 위협하는 상태로, 전 세계 의료 시스템에 큰 부담을 줍니다¹. 보다 최근에는 패혈증과 관련된 병원 내 사망률이 개선된 집중 치료실(ICU) 관리로 인해 감소했습니다 ^1,2. 그러나 초기 패혈증에서 살아남은 환자의 약 75%는 골격근 위축(예: 단면적 감소) 및 쇠약(예: 힘 생산 능력 ^감소)이 발생합니다^3,4. 이 현상은 패혈증에 의한 근육병증으로 특징지어졌으며, 신체 활동의 장애와 일상 생활 작업을 수행할 수 있는 독립성의 부족과 밀접한 관련이 있으며, 이는 최초 발병 후 5년 이내에 재입원 및 사망률로 이어진다⁵.

공격적이고 전신화된 감염으로 인해 패혈증 환자는 ICU에서 회복하는 동안 장기간 침상 안정에 노출됩니다. 이러한 맥락에서, 골격근은 심각하게 사용되지 않게 되며, 이는 근육 위축과 약화를 악화시킬 가능성이 있다 ^3,4. 현재로서는 패혈증으로 인한 근육병증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료법이 없습니다. 근육병증을 해결하기 위해 고안된 사용 가능한 전임상 모델은 CLP(cecal ligation and puncture)⁶, cecal slurry7 또는 그람 음성 박테리아8에서 세포벽의 구성 요소인 정제된 LPS(lipopolysaccharide) 주입을^{사용했습니다.} 이러한 모델은 감염을 전달하는 데 성공하지만, 정화조 동물에서 관찰되는 신체 활동의 자연적인 감소를 넘어 정화조 숙주에서 관찰되는 근육 소모를 적절하게 재현하지 못한다⁹.

이 연구의 주요 목적은 마우스에서 사용하지 않는 패혈증 유발 근육병증 모델을 적절하게 실행하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다. 생쥐에서 패혈증 유발 근병증을 연구하기 위해 패혈증 모델로서의 CLP와 불용성 모델로서의 뒷다리 현탁액(HLS)을 결합하는 타당성을 입증합니다³. 또한 근육 역학의 대표 결과와 모델에 대한 반응에 따른 전형적인 형태학적 변화도 제공됩니다.

프로토콜

이 절차는 University of Florida IACUC(#202200000227)에서 검토하고 승인했습니다. 본 연구에는 27g에서 34g 범위의 체질량을 가진 17주 된 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 이 프로토콜에 요약된 실험 절차와 일정은 그림 1에 나와 있습니다. 표시된 대로 프로토콜은 총 11일에 걸쳐 있습니다. 동물은 0일차에 생존 수술(CLP/Sham)을 받은 후 4일 동안 수액 및 진통제 지원을 받습니다. 4일째 되는 날, 동물은 7일 동안 HLS를 시작합니다. 터미널 실험은 11일째에 수행됩니다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 결장 결찰 및 천자(CLP)

1. 상업적인 출처에서 동물을 얻은 후에는 CLP(또는 가짜) 수술을 수행하기 전에 최소 1주일 동안 동물 시설에 적응하도록 하십시오. 이것은 운송과 관련된 스트레스를 최소화하는 데 도움이 될 것입니다.
2. 현지 IACUC 지침을 준수하여 마우스를 집단 수용합니다.
   참고: 일반적인 지침으로, 동물들은 수술 당일까지 케이지당 최대 5마리의 쥐에 수용됩니다. 너비 7.25인치, 길이 11.75인치, 높이 5인치의 표준 케이지가 사용되며 옥수수 속대 침구가 제공됩니다. 12h: 12h의 명암 주기가 유지되며 오전 7시에 조명이 켜지고 오후 7시에 꺼집니다. 하우징 온도는 20-22°C로 유지되고 상대 습도(RH)는 30%에서 60% 사이로 유지됩니다. 표준 차우 식단과 물에 대한 광고 접근 이 보장됩니다.
3. CLP를 수행하려면 유도 챔버에서 이소플루란(2.5%, 500mL/min)으로 동물을 마취합니다. 핀셋으로 발을 끼워 마취를 확인합니다. 발을 꼬집을 때 반사적 철수가 없는 것으로 확인된 바와 같이 깊은 마취가 이루어지면 노즈콘(2.5%, 100-125mL/분)을 사용하여 동물을 연속 마취로 옮깁니다.
   알림: 무균 기술은 전체 절차 전반에 걸쳐 사용해야 합니다.
4. 수술 중 코뿔로 인한 잠재적인 손상이나 부상으로부터 동물의 눈을 보호하기 위해 수의학 눈 윤활유 연고를 바르십시오.
5. 수술 부위를 청소하려면 시중에서 판매되는 제모제를 사용하십시오. 피부가 과도하게 노출되지 않도록 하복부에서만 털을 제거하십시오.
   알림: 또는 동물 이발기를 사용할 수 있지만 피부 손상이 발생하지 않도록 주의해야 합니다.
6. 수술 부위가 노출되면 포비돈-요오드(또는 이에 상응하는 살균 스크럽)를 세 번 도포하여 해당 부위를 세척한 다음 각 도포 사이에 70% 알코올로 헹굽니다.
7. 지역 IACUC에서 승인한 진통제 치료에 따라 3.25mg/kg의 서방형 부프레노르핀 또는 이에 상응하는 용량을 1회 투여합니다.
8. 마우스를 수술 부위로 옮깁니다. 접착 드레이프를 사용하여 수술 부위를 격리합니다. 깊은 마취 하에 메스 칼날을 사용하여 피부의 복부 정중선 절개(~2cm)를 합니다.
   1. 가위를 사용하여 근육층에서 피부를 분리합니다. 메스 칼날을 사용하여 근육층을 더 작게 절개(~1cm)합니다. 장이 시각화되면 뭉툭한 집게를 사용하여 맹장을 찾아 외부화합니다.
9. 외부화가 완료되면 멸균된 5-0 폴리글락틴 흡수성 봉합사를 사용하여 맹장을 결찰합니다. 맹장의 말단부에서 결찰점까지의 거리로 정의되는 결찰된 맹장의 면적을 고려하면 감염의 심각성에 기여할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과를 재현하려면 맹장을 원위점에서 1cm 떨어진 곳에 묶습니다.
   참고: 더 큰 맹장 면적을 결찰하면 중증도가 증가합니다¹⁰.
10. 27G 바늘을 사용하여 맹장을 전체적으로 천공하여 대변 내용물이 누출되도록 합니다. 주의해서 맹장을 부드럽게 짜서 대변 내용물을 외부화시킵니다. 가짜 수술을 수행하려면 동물의 배설물을 노출시키는 동일한 단계를 따르십시오. 그러나 맹장을 결찰하거나 구멍을 뚫지 마십시오.
    알림: 바늘 게이지는 감염의 심각성에 직접적인 영향을 미칩니다. 낮은 등급의 감염을 일으키려면 26G에서 28G 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 더 두꺼운 바늘 게이지를 사용하면 폐사율이 증가하며 동물은 프로토콜의 후속 뒷다리 중단 단계를 견디지 못할 수 있습니다.
11. 맹장을 복강 내로 재배치합니다. 멸균된 5-0 흡수성 봉합사로 근육층을 닫습니다. 5-0 나일론, 비흡수성 봉합사로 피부를 닫습니다. 피부 봉합이 완료된 후 동물의 등에 피하 주사 를 통해 멸균 식염수(수컷의 경우 1mL, 암컷의 경우 0.5mL)를 제공합니다.
    알림: 근육층을 닫기 위해서는 연속 봉합 기술을 사용하는 것이 좋지만, 피부층의 경우 단속 봉합 기술을 사용하는 것이 좋습니다. 생존 수술에서 봉합에 대한 현지 IACUC 지침을 상담하고 준수하십시오.
12. 수술 후, 35°C로 설정된 난방 매트리스 또는 난방 패드 위에 깨끗한 케이지에 동물을 단독으로 수용합니다. 마취 회복 후 처음 한 시간 동안 15분마다 쥐를 관찰한 후 주거 시설로 되돌릴 수 있습니다.
    알림: 수술 부위에 영향을 주지 않고 동물이 즉시 음식을 먹을 수 있도록 케이지 바닥에 최소한의 차우를 제공하십시오. 시설로 돌아온 후 동물은 정화조 동물 평가(3단계) 후 하루에 두 번 확인합니다.
13. 수술 절개 부위가 치유될 수 있도록 다음 4일 동안 멸균 식염수와 진통제 지원을 제공합니다.
    참고: xiphoid 표면 온도와 체중을 매일 모니터링하면 패혈증 중증도에 대한 정확한 기록을 유지하는 데 도움이 됩니다¹¹.

2. 뒷다리 현탁액(HLS)

1. HLS를 수행하려면 조사관은 현지 IACUC 윤리 지침을 따라야 합니다. 여기에는 적절한 케이지 치수와 바닥재의 사용을 보장하는 것이 포함되며, 이는 HLS 조건에서 동물의 이동, 식사 및 음주 습관을 수용하는 데 중요한 측면입니다.
   참고: 상처 치유를 위해 CLP 후 4일간의 회복이 권장됩니다.
2. CLP 또는 가짜 수술에서 4일 동안 회복한 후 가벼운 이소플루란 흐름(2.5%, 100-125mL/min) 하에 동물을 마취합니다. 폼 테이프를 사용하여 마우스 꼬리를 짧은 금속 체인에 부착합니다. 폼 테이프가 꼬리와 체인을 단단히 감싸는 동안 금속 체인을 꼬리와 평행하게 놓습니다.
3. 뒷다리가 매달려 있는지 확인하려면 케이지 중앙을 따라 크로스바에 연결된 고리에 금속 체인을 부착하십시오. 또한 동물의 이동 능력을 높일 수 있도록 크로스바를 따라 이동할 수 있는 두 번째 작은 막대를 부착하십시오.
   참고: 동물은 케이지 바닥의 금속 그리드를 활용하여 앞다리를 통해 이동할 수 있어야 합니다.
4. 발이 차우 펠릿과 접촉하지 않도록 매달린 팔다리의 높이를 조정하십시오. 동물을 모니터링하고 현탁 기간 동안 하루에 두 번 이상 물에 적신 면봉으로 봉합된 피부 주변의 면도 부위를 손으로 청소하십시오.
   참고: 수술 부위의 감염, 특히 들어 올려진 몸의 위치로 인한 소변 화상을 방지하기 위해 세척이 중요합니다.
5. 결과를 재현하려면 동물이 7일 동안 뒷다리 정지를 받도록 하십시오. 지속 시간은 비패혈성 상태에서 골격근에 의미 있는 효과를 이끌어 내기 위해 뒷다리 현탁액이 필요한 최소 시간을 보여주는 이전 시간 코스 연구를 기반으로 결정되었습니다^12,13.
   참고: 동물의 생존, 불편함 또는 고통은 감염의 심각성에 따라 증가합니다.

3. 정화조 동물 평가

참고: 동물의 임상 상태를 평가하는 것은 CLP/가짜 수술 후 중증도를 추적하는 데 중요한 측면입니다. 또한 IACUC의 요구에 따라 동물 복지를 위한 인도적 종점을 설정해야 합니다. 이러한 우려를 해소하고 일상적인 동물 관리에 대한 기준을 제공하기 위해, 수정된 쥐 패혈증 점수(MMSS)를 이용한 동물 평가 수행 지침이 사용되었다¹⁴.

1. MMSS(보충 파일 1)를 사용하여 동물을 평가합니다. 각 범주에 대해 점수 0은 건강한 동물을 나타냅니다. 감염의 심각성에 따라 하루에 두 번 0에서 3까지 동물의 점수를 매기십시오.
2. 정확도를 높이려면 하루에 두 번 xiphoid 표면 온도와 체중을 측정하고^11,15 MMSS 점수표와 함께 기록하십시오.
   알림: 일반적인 xiphoid 표면 온도 및 체중 변동은 보충 그림 1에 나와 있습니다.
3. 인도적 엔드포인트에 대해서는 현지 IACUC에 문의하십시오.
   참고: 결과를 재현하기 위해 다음 기준을 종점으로 사용했습니다: (1) 체중 감량 >기준선 대비 40%. (2) 온도 <30 °C 또는 이전 값에서 >5 °C 감소. (3) 자극에 대한 반응, 의식 수준 또는 호흡의 질에서 3점. (4) 총 일일 MSSS ≥17. 여기에 설명된 평가는 수술 후 및 정상적인 보행을 받는 동물에서 수행되도록 설계되었습니다. HLS를 앓고 있는 동물의 뒷다리와 표면 사이의 접촉을 방지하기 위해 취급을 삼가는 것이 좋습니다. 최종 평가 후 지역 동물 윤리 위원회의 권고에 따라 동물을 안락사시킵니다.

결과

결과에 나타난 대표 데이터로는 생후 17주령의 체질량이 27 내지 34g인 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. 전체 프로토콜은 완료하는 데 11일이 소요되며 수술 개입(CLP 또는 가짜), 식염수 및 진통제 지원(0-4일) 및 HLS 폐기(4-11일)로 구성됩니다. 터미널 실험은 중단 단계의 어느 시점에서나 수행할 수 있습니다. 이 모델이 골격근 기능에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해, 우?...

토론

현재 프로토콜은 패혈증 유발 근병증의 새로운 전임상 모델을 구현하기 위한 기술 지침을 제공합니다. 모든 재료와 중요한 단계는 모델 재현을 위해 자세히 설명되어 있습니다. 이 접근법은 패혈증 환자에서 관찰되는 골격근 기능 장애를 재현할 수 있으며, 근육병증을 악화시키는 중요한 구성 요소로서 사용 중단의 역할을 강조할 수 있습니다. 지금까지 패혈증 유발 근?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Ethicon Coated Vicryl	Ethicon	D5792	Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"	Ethicon	662G	Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G	BD	305136 for 27g needle	Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #000664
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	Swabs for topical application of iodine.
Cryostat	(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415	Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)	Fisher Scientific		To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages	Custom Made	N/A	These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube	Optixcare		Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11	Fine Science		Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac	Zimmer	736579	Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific Corporation	SS-01	Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus	Aurora Scientific	Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C