マウスにおけるDisuseを伴う敗血症誘発性ミオパチーの前臨床モデル

要約

このマウスモデルは、敗血症性侮辱と後肢の筋肉の不使用を組み合わせて、典型的な敗血症患者の寝たきりの特徴を再現しています。このモデルは、敗血症の筋機能障害を研究するための以前のモデルからの大幅な逸脱を表しており、この状態を治療するための治療戦略に取り組むための再現可能なアプローチです。

要約

敗血症は院内死亡の主な原因です。治療の改善により、敗血症生存者の数が増えます。生存者の約75%が筋力低下と筋萎縮を発症し、再入院の発生率と死亡率が増加します。しかし、利用可能な敗血症の前臨床モデルは、敗血症誘発性ミオパチーの発症の主要な要素である骨格筋の不使用に対処していません。このプロトコルの目的は、寝たきりの敗血症患者が経験する臨床環境を再現するマウスモデルの段階的なガイドラインを提供することです。このモデルの開発には、雄のC57Bl/6マウスを使用しました。マウスは、敗血症を誘発するために盲腸結紮および穿刺(CLP)を受けました。CLPの4日後、マウスに7日間後肢懸濁液(HLS)を投与した。結果は、偽の一致手術および/または正常な歩行(NA)の動物と比較されました。 in vitro の筋肉力学と形態学的評価のために、筋肉を解剖しました。このモデルは、敗血症患者で観察される同様の表現型である顕著な筋萎縮と衰弱をもたらします。このモデルは、敗血症誘発性ミオパチーの緩和のための潜在的な治療戦略をテストするためのプラットフォームを表しています。

概要

敗血症は、免疫反応が過剰に働き、複数の臓器系に悪影響を及ぼし、世界中の医療システムに大きな負担をかけているため、生命を脅かす疾患です¹。最近では、インテンシティ・ケア・ユニット(ICU)の管理が改善されたことにより、敗血症に関連する院内死亡率が減少しています^1,2。しかし、最初の敗血症性障害を生き延びた患者の約75%は、骨格筋の萎縮(例:断面積の減少)と脱力感(例:力生産能力の減少)^を発症します^3,4。この現象は敗血症誘発性ミオパチーとして特徴付けられており、身体活動の障害や日常生活のタスクを実行するための独立性の欠如と強く関連しており、最初のエピソード⁵から5年以内に再入院と死亡につながります。

侵攻性で全身性感染症のため、敗血症患者はICUで回復している間、長期間の安静にさらされます。この文脈では、骨格筋は重度の不使用を受け、それが筋萎縮と衰弱を悪化させる可能性が高い^3,4。現在、敗血症誘発性ミオパチーに効果的に対処した治療法はありません。ミオパチーに対処するために設計された利用可能な前臨床モデルでは、盲腸結紮および穿刺(CLP)⁶、盲腸ス^ラリー7、またはグラム陰性菌⁸の細胞壁の成分である精製リポ多糖(LPS)の注射が使用されています。これらのモデルは感染を届けることに成功していますが、敗血症動物で観察される身体活動の自然な減少を超えて、敗血症の宿主で観察される筋肉の不使用を適切に再現していません⁹。

この研究の主な目的は、マウスで敗血症誘発性ミオパチーのモデルを適切に実行する方法を詳細に説明することです。敗血症のモデルとしてのCLPと不使用のモデルとして後肢懸濁液(HLS)を組み合わせることの実現可能性を実証し、マウスの敗血症誘発性ミオパチーを研究します³。さらに、筋力学の代表的な結果と、モデルに応じた典型的な形態学的変化も提供されます。

プロトコル

手順は、フロリダ大学IACUC(#202200000227)によってレビューされ、承認されています。本研究では、体重が27 gから34 gの範囲の17週齢の雄C57BL / 6Jマウスが使用されました。このプロトコルで概説されている実験手順とタイムラインを 図1に示します。示されているように、プロトコルは合計11日間に及びます。動物は0日目に生存手術(CLP / Sham)を受け、その後4日間の水分と鎮痛のサポートを受けます。4日目に、動物は7日間HLSを開始します。11日目に終末実験を行います。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 盲腸結紮および穿刺(CLP)

1. 動物を市販の供給元から入手した後、CLP(または偽物)手術を行う前に、少なくとも1週間動物施設に順応させます。これにより、輸送に伴うストレスを最小限に抑えることができます。
2. 地域のIACUCガイドラインを遵守して、マウスをグループハウス化します。
   注:一般的な方向として、動物は手術の日までケージごとに最大5匹のマウスに収容されます。幅7.25インチ、長さ11.75インチ、高さ5インチの標準ケージが利用され、コーンコブ寝具が備えられています。12時間:12時間の明暗サイクルが維持され、午前7時にライトが点灯し、午後7時に消灯します。ハウジングの温度は20〜22°Cに保たれ、相対湿度(RH)は30%〜60%に維持されます。標準的な食事と水への 自由な アクセスが保証されます。
3. CLPを行うには、誘導チャンバー内でイソフルラン(2.5%、500mL/分)で動物に麻酔をかけます。ピンセットで足をつまんで麻酔を確認します。深い麻酔に入ったら、足のつまみ込みによる反射的な離脱がないことから確認されるように、ノーズコーン(2.5%、100-125mL /分)を使用して動物を継続麻酔に移します。
   注:無菌技術は、手順全体を通じて採用する必要があります。
4. 手術中にノーズコーンによる損傷や怪我の可能性から動物の目を保護するために、獣医用眼潤滑剤軟膏を塗布してください。
5. 手術部位の洗浄には、市販の脱毛剤を使用してください。皮膚の露出過多を避けるために、下腹部のみから毛皮を取り除きます。
   注:または、動物のバリカンを使用することもできますが、皮膚の損傷を避けるために注意を払う必要があります。
6. 手術部位が露出したら、ポビドンヨード(または同等の殺菌スクラブ)を3回塗布してその領域を洗浄し、その後、各塗布の間に70%アルコールですすいでください。
7. 地元の IACUC によって承認された鎮痛治療に従って、3.25 mg/kg の徐放性ブプレノルフィンまたは同等物の単回投与を投与します。
8. マウスを手術領域に移します。接着剤のドレープを使用して手術部位を分離します。深い麻酔下で、メスの刃を使用して皮膚の腹側正中線切開(~2 cm)を行います。
   1. はさみを使用して、皮膚を筋肉層から分離します。メスの刃を使用して、筋肉層に小さな切開(~1cm)を行います。鈍い鉗子を使用して腸を視覚化したら、盲腸を見つけて外部化します。
9. エクステリア化したら、滅菌済みの5-0ポリグラクチン吸収性縫合糸を使用して盲腸を結紮します。結紮された盲腸の領域は、盲腸の遠位端から結紮点までの距離として定義され、感染の重症度に寄与するため、考えてみましょう。ここで示した結果を再現するには、盲腸を遠位点から1cm結びます。
   注:より大きな盲腸領域を結紮すると、重症度^{が増加します10}。
10. 27Gの針を使用して、盲腸全体に穴を開け、糞便の内容物が漏れるのを防ぎます。注意して、盲腸をそっと絞って、糞便の内容物を外部化します。偽の手術を行うには、動物の盲腸を露出させるのと同じ手順に従います。ただし、盲腸を結紮したり、穴を開けたりしないでください。
    注:針ゲージは感染の重症度に直接影響します。軽度の感染症を引き起こすには、26Gから28Gの針が推奨されます。より厚い針ゲージを使用すると、死亡率が増加し、動物はプロトコルのその後の後肢懸濁段階に耐えられない可能性があることに注意してください。
11. 盲腸を腹腔内に移します。滅菌済みの5-0吸収性縫合糸で筋肉層を閉じます。5-0ナイロンの非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。皮膚縫合が完了したら、動物の背中に皮下注射 により 滅菌生理食塩水(雄の場合は1 mL、雌の場合は0.5 mL)を提供します。
    注:筋肉層を閉じるには、連続縫合技術が推奨されますが、皮膚層には、中断縫合技術が推奨されます。サバイバル手術における縫合については、地域のIACUCガイドラインを参照し、それに準拠してください。
12. 手術後、35°Cに設定されたヒーティングマットレスまたはヒーティングパッドの上にある清潔なケージに動物をシングルハウスで収容します。 麻酔回復後の最初の1時間、マウスを15分ごとに観察し、その後、マウスを飼育施設に戻すことができます。
    注:ケージの床には最小限の量のチャウを用意して、手術部位に影響を与えることなく動物 が自由に 餌を食べられるようにします。施設に戻った後、敗血症動物の評価(ステップ3)に続いて、1日2回の動物検査が行われます。
13. 外科的切開が治癒するのを防ぐために、次の4日間にわたって滅菌生理食塩水と鎮痛剤のサポートを提供します。
    注:剣状突起の表面温度と体重を毎日監視すると、敗血症の重症度¹¹の正確な記録を保持するのに役立ちます。

2.後肢サスペンション(HLS)

1. HLS を実行するには、研究者は地域の IACUC 倫理ガイドラインに従う必要があります。これには、HLS条件での動物の移動、食事、飲酒の習慣に対応するための重要な側面である適切なケージの寸法と床材の使用を確保することが含まれます。
   注:創傷治癒には、CLP後の4日間の回復が推奨されます。
2. CLPまたは偽手術から4日間回復した後、軽いイソフルランの流れ(2.5%、100-125 mL / min)で動物に麻酔をかけます。.マウステールをフォームテープを使用して短い金属チェーンに取り付けます。金属製のチェーンをテールと平行に置き、フォームテープがテールとチェーンをしっかりと包み込みます。
3. 後肢の吊り下げを確実にするために、金属チェーンをケージの中央に沿ってクロスバーに接続されたフックに取り付けます。さらに、クロスバーに沿って移動できる2番目の小さなバーを取り付けて、動物の移動能力を高めます。
   注:動物は、ケージの床にある金属製のグリッドを利用して、前肢を介して移動できなければなりません。
4. 吊り下げられた手足の高さを調整して、足がチャウペレットに接触しないようにします。動物を監視し、縫合した皮膚の周りの剃った部分を、水に浸した綿棒で手作業で清掃します。
   注:手術部位での感染、特に体位の上昇による尿の火傷を避けるためには、清掃が重要です。
5. 結果を再現するには、動物が7日間の後肢懸垂を受けることを確認してください。期間は、非敗血症状態の骨格筋に意味のある影響を引き出すために後肢懸濁液に必要な最小時間を示す以前の時間経過研究に基づいて決定されました^12,13。
   注:動物の生存、不快感、または苦痛は、感染の重症度に応じて増加します。

3.敗血症動物の評価

注:動物の臨床状態を評価することは、CLP/偽手術後の重症度を追跡するための重要な側面です。また、IACUCの要求に応じて、動物福祉のための人道的なエンドポイントを確立する必要があります。これらの懸念に対処し、日常の動物飼育の基準を提供するために、Modified Murine Sepsis Score(MMSS)を使用して動物評価を実施するための指示が使用された¹⁴。

1. MMSS(Supplementary File 1)を使用して動物を評価します。各カテゴリで、スコア 0 は健康な動物を表すことに注意してください。感染の重症度に応じて、動物を1日2回0から3まで採点します。
2. 精度を高めるために、剣状突起の表面温度と体重を1日2回測定し、^11,15 MMSSスコアシートと一緒に記録します。
   注:典型的な剣状突起の表面温度と体重の変動は、 補足図1に記載されています。
3. 人道的なエンドポイントについては、地域の IACUC にご相談ください。
   注: 結果を再現するために、エンドポイントとして次の基準が使用されました: (1) 体重減少 >ベースラインから 40%)。(2)温度が<30°Cまたは前回値より>5°C低下する。(3)次のスコア3:刺激に対する反応、意識レベル、または呼吸の質。(4)1日の合計MSSS≥17。ここで説明する評価は、手術後および通常の歩行を受けている動物で実施するように設計されています。HLSを受けている動物は、後肢と表面が接触しないように取り扱いを控えることをお勧めします。最終評価後、地元の動物倫理委員会の推奨事項に従って動物を安楽死させます。

結果

結果に示されている代表的なデータには、体重が27〜34gの17週齢の雄C57BL/6Jマウスを使用しました。プロトコル全体は完了するまでに 11 日かかり、手術介入 (CLP または偽)、生理食塩水と鎮痛薬のサポート(0 日目から 4 日目)、および HLS の不使用 (4 日目から 11 日目) で構成されています。最終実験は、懸濁相の任意の時点で実行できます。モデルが骨格筋機能に与える...

ディスカッション

現在のプロトコルは、敗血症誘発性ミオパチーの新しい前臨床モデルの実装に関する技術ガイドラインを提供します。モデルの再現のために、すべての材料と重要な手順が詳細に説明されています。このアプローチは、敗血症患者に観察される骨格筋の機能障害を再現することができ、ミオパチーの悪化における重要な要素としての不使用の役割を強調しています。...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Ethicon Coated Vicryl	Ethicon	D5792	Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"	Ethicon	662G	Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G	BD	305136 for 27g needle	Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #000664
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	Swabs for topical application of iodine.
Cryostat	(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415	Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)	Fisher Scientific		To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages	Custom Made	N/A	These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube	Optixcare		Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11	Fine Science		Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac	Zimmer	736579	Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific Corporation	SS-01	Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus	Aurora Scientific	Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C