Ein präklinisches Modell der Sepsis-induzierten Myopathie mit Nichtanwendung bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Mausmodell kombiniert einen septischen Insult mit dem Ausfall der Hintergliedmaßenmuskulatur, um das bettlägerige Merkmal des typischen septischen Patienten zu rekapitulieren. Das Modell stellt eine deutliche Abkehr von früheren Modellen zur Untersuchung von Muskelfunktionsstörungen bei Sepsis dar und ist ein reproduzierbarer Ansatz zur Behandlung dieser Erkrankung.

Zusammenfassung

Sepsis ist eine der Hauptursachen für Todesfälle im Krankenhaus. Verbesserungen in der Behandlung führen zu einer größeren Anzahl von Sepsis-Überlebenden. Etwa 75 % der Überlebenden entwickeln Muskelschwäche und -atrophie, was die Häufigkeit von Krankenhauseinweisungen und die Mortalität erhöht. Die verfügbaren präklinischen Modelle der Sepsis befassen sich jedoch nicht mit der Nichtbenutzung der Skelettmuskulatur, einer Schlüsselkomponente für die Entwicklung der Sepsis-induzierten Myopathie. Unser Ziel in diesem Protokoll ist es, eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für ein Mausmodell zu erstellen, das die klinische Umgebung eines bettlägerigen septischen Patienten reproduziert. Für die Entwicklung dieses Modells wurden männliche C57Bl/6-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden einer Zölligatur und -punktion (CLP) unterzogen, um eine Sepsis zu induzieren. Vier Tage nach der CLP-Behandlung wurden die Mäuse sieben Tage lang einer Suspension der Hintergliedmaßen (HLS) unterzogen. Die Ergebnisse wurden mit scheingleichen Operationen und/oder Tieren mit normaler Ambulation (NA) verglichen. Die Muskeln wurden für in vitro Muskelmechanik und morphologische Untersuchungen präpariert. Das Modell führt zu ausgeprägter Muskelatrophie und -schwäche, ein ähnlicher Phänotyp, der bei septischen Patienten beobachtet wird. Das Modell stellt eine Plattform dar, um potenzielle therapeutische Strategien zur Linderung der Sepsis-induzierten Myopathie zu testen.

Einleitung

Sepsis ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, die auf eine überaktive Immunantwort zurückzuführen ist, die sich negativ auf mehrere Organsysteme auswirkt und zu einer großen Belastung für die Gesundheitssysteme weltweit führt¹. In jüngster Zeit ist die mit Sepsis verbundene Mortalität im Krankenhaus aufgrund eines verbesserten Managements der Intensivstation (ICU) gesunken ^1,2. Etwa 75 % der Patienten, die den anfänglichen septischen Insult überleben, entwickeln jedoch eine Atrophie der Skelettmuskulatur (z. B. Verkleinerung der Querschnittsfläche) und Schwäche (z. B. Verringerung der Kraftproduktionskapazität)^3,4. Dieses Phänomen wurde als Sepsis-induzierte Myopathie charakterisiert, die in hohem Maße mit einer Beeinträchtigung der körperlichen Aktivität und einem Mangel an Unabhängigkeit bei der Ausführung von Aufgaben des täglichen Lebens verbunden ist und innerhalb von fünf Jahren nach der ersten Episode zu einem erneuten Krankenhausaufenthalt und zur Mortalität führt⁵.

Aufgrund einer aggressiven und generalisierten Infektion sind septische Patienten während der Genesung auf der Intensivstation längeren Bettruhe ausgesetzt. In diesem Zusammenhang erfährt der Skelettmuskel eine starke Nichtbeanspruchung, was wahrscheinlich die Muskelatrophie und -schwäche verschlimmert ^3,4. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung der Sepsis-induzierten Myopathie. Die verfügbaren präklinischen Modelle, die zur Behandlung der Myopathie entwickelt wurden, verwendeten die Zäkalligatur und -punktion (CLP)⁶, die Zäkalaufschlämmung⁷ oder die Injektion von gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS), das ein Bestandteil der Zellwand bei gramnegativen Bakterien ist⁸. Obwohl es diesen Modellen gelingt, eine Infektion zu übertragen, reproduzieren sie die bei septischen Wirten beobachtete Muskelnichtbeanspruchung nicht richtig, abgesehen von einer natürlichen Verringerung der körperlichen Aktivität, die bei septischen Tieren beobachtet wurde⁹.

Das Hauptziel dieser Studie ist es, eine detaillierte Beschreibung zu liefern, wie das Modell der Sepsis-induzierten Myopathie bei Mäusen richtig ausgeführt werden kann. Wir zeigen die Machbarkeit der Kombination von CLP als Modell der Sepsis mit der Hintergliedmaßensuspension (HLS) als Modell der Nichtverwendung, um die Sepsis-induzierte Myopathie bei Mäusen^{zu untersuchen 3}. Darüber hinaus werden repräsentative Ergebnisse der Muskelmechanik und typischer morphologischer Veränderungen als Reaktion auf das Modell zur Verfügung gestellt.

Protokoll

Die Verfahren wurden von der IACUC der University of Florida (#202200000227) überprüft und genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 17 Wochen mit einer Körpermasse von 27 g bis 34 g verwendet. Die experimentellen Verfahren und der Zeitplan, die in diesem Protokoll skizziert sind, sind in Abbildung 1 dargestellt. Wie bereits erwähnt, erstreckt sich das Protokoll über insgesamt 11 Tage. Die Tiere werden an Tag 0 einer Überlebensoperation (CLP/Sham) unterzogen, gefolgt von vier Tagen mit Flüssigkeit und schmerzstillender Unterstützung. An Tag 4 beginnen die Tiere mit HLS für eine Dauer von 7 Tagen. Terminalexperimente werden an Tag 11 durchgeführt. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zäkalligatur und -punktion (CLP)

1. Nachdem Sie die Tiere von der kommerziellen Quelle erhalten haben, lassen Sie sie mindestens 1 Woche lang in der Tiereinrichtung akklimatisieren, bevor Sie CLP-Operationen (oder Scheinoperationen) durchführen. Dies trägt dazu bei, den mit dem Transport verbundenen Stress zu minimieren.
2. Setzen Sie die Mäuse in einer Gruppe unter Einhaltung der lokalen IACUC-Richtlinien unter.
   HINWEIS: Generell gilt, dass die Tiere bis zum Tag der Operation in maximal 5 Mäusen pro Käfig untergebracht sind. Standardkäfige mit einer Breite von 7,25 Zoll, einer Länge von 11,75 Zoll und einer Höhe von 5 Zoll werden verwendet und mit Maiskolbeneinstreu ausgestattet. Es wird ein Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden eingehalten, wobei das Licht um 7 Uhr morgens eingeschaltet und um 19 Uhr ausgeschaltet wird. Die Gehäusetemperatur wird bei 20-22 °C gehalten und die relative Luftfeuchtigkeit (RH) zwischen 30 % und 60 % gehalten. Der Ad-libitum-Zugang zu Standardfutter und Wasser ist gewährleistet.
3. Um CLP durchzuführen, wird das Tier in einer Induktionskammer mit Isofluran (2,5 %, 500 ml/min) anästhesiert. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie die Pfote mit einer Pinzette einklemmen. Sobald sich das Tier in tiefer Narkose befindet, was durch das Fehlen eines Reflexrückzugs durch Pfotenkneifen bestätigt wird, wird das Tier mit einem Nasenkonus (2,5 %, 100-125 ml/min) in eine fortgesetzte Anästhesie überführt.
   HINWEIS: Während des gesamten Verfahrens sollten aseptische Techniken angewendet werden.
4. Tragen Sie Veterinär-Augenschmiersalbe auf, um die Augen des Tieres vor möglichen Nasenkonus-induzierten Schäden oder Verletzungen während der Operation zu schützen.
5. Verwenden Sie zur Reinigung der Operationsstelle einen handelsüblichen Haarentferner. Entfernen Sie das Fell nur vom Unterbauch, um eine Überbelichtung der Haut zu vermeiden.
   HINWEIS: Alternativ kann auch eine Tierhaarschneidemaschine verwendet werden, aber es muss darauf geachtet werden, dass die Haut nicht beschädigt wird.
6. Sobald die Operationsstelle freigelegt ist, reinigen Sie den Bereich mit drei Anwendungen von Povidon-Jod (oder einem gleichwertigen keimtötenden Peeling), gefolgt von einer Spülung mit 70% Alkohol zwischen jeder Anwendung.
7. Verabreichen Sie eine Einzeldosis von 3,25 mg/kg Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung oder ein Äquivalent gemäß der von Ihrer örtlichen IACUC zugelassenen analgetischen Behandlung.
8. Übertragen Sie die Maus in den Operationsbereich. Isolieren Sie die Operationsstelle mit einem Klebetuch. Machen Sie unter tiefer Narkose mit einer Skalpellklinge einen Schnitt (~2 cm) in der ventralen Mittellinie in der Haut.
   1. Trennen Sie mit einer Schere die Haut von der Muskelschicht. Machen Sie mit der Skalpellklinge einen kleineren Schnitt (~1 cm) in der Muskelschicht. Sobald der Darm sichtbar gemacht ist, lokalisieren Sie den Blinddarm mit einer stumpfen Pinzette und veräußeren Sie ihn.
9. Nach der Außenbehandlung wird der Blinddarm mit einem sterilen 5-0-Polyglactin-Resorbierbaren Naht ligiert. Betrachten Sie die Fläche des ligierten Blinddarms, definiert als der Abstand vom distalen Ende des Blinddarms zum Ligaturpunkt, da er zur Schwere der Infektion beiträgt. Um die hier vorgestellten Ergebnisse zu reproduzieren, binden Sie den Blinddarm 1 cm von seinem distalen Punkt ab.
   HINWEIS: Die Ligatur eines größeren Blinddarmbereichs führt zu einem erhöhten Schweregrad¹⁰.
10. Perforieren Sie den Blinddarm mit einer 27-G-Nadel durch und durch, so dass der Stuhlinhalt austreten kann. Drücken Sie den Blinddarm vorsichtig zusammen, um den Stuhlinhalt nach außen zu leiten. Um eine Scheinoperation durchzuführen, befolgen Sie die gleichen Schritte, bei denen Sie den tierischen Blinddarm freilegen. Ligatieren Sie den Blinddarm jedoch nicht und punktieren Sie ihn nicht.
    HINWEIS: Die Nadelstärke wirkt sich direkt auf den Schweregrad der Infektion aus. Um eine minderwertige Infektion hervorzurufen, werden 26 G bis 28 G Nadeln empfohlen. Bitte beachten Sie, dass die Verwendung dickerer Nadelstärken zu einer erhöhten Sterblichkeitsrate führt und die Tiere die anschließende Aufhängungsphase der Hintergliedmaßen des Protokolls möglicherweise nicht vertragen.
11. Verlagern Sie den Blinddarm in die Bauchhöhle. Verschließen Sie die Muskelschicht mit einem sterilen 5-0 resorbierbaren Nahtmaterial. Verschließen Sie die Haut mit einer nicht resorbierbaren Naht aus 5-0 Nylon. Nachdem die Hautnaht abgeschlossen ist, geben Sie sterile Kochsalzlösung (1 ml für Rüden und 0,5 ml für Hündinnen) durch subkutane Injektion in den Rücken des Tieres.
    HINWEIS: Für den Verschluss der Muskelschicht wird eine kontinuierliche Nahttechnik empfohlen, während für die Hautschicht eine unterbrochene Nahttechnik empfohlen wird. Konsultieren Sie Ihre lokalen IACUC-Richtlinien für das Nähen in der Überlebenschirurgie und halten Sie sich daran.
12. Nach der Operation werden die Tiere in einem sauberen Käfig auf einer Heizmatratze oder einem Heizkissen mit einer Temperatur von 35 °C untergebracht. Beobachten Sie die Maus in der ersten Stunde nach der Wiederherstellung der Narkose alle 15 Minuten, danach kann sie in die Wohneinrichtung zurückgebracht werden.
    HINWEIS: Stellen Sie eine minimale Menge Futter auf dem Käfigboden bereit, damit die Tiere ad libitum gefüttert werden können, ohne die Operationsstelle zu beeinträchtigen. Nach der Rückkehr in die Einrichtung werden die Tiere nach der septischen Tierbeurteilung (Schritt 3) zweimal täglich kontrolliert.
13. Bieten Sie in den folgenden vier Tagen sterile Unterstützung mit Kochsalzlösung und Analgetika, damit der chirurgische Schnitt heilen kann.
    HINWEIS: Die tägliche Überwachung der Xiphoid-Oberflächentemperatur und des Körpergewichts hilft dabei, genaue Aufzeichnungen über den Schweregrad der Sepsis^{zu führen 11}.

2. Aufhängung der Hintergliedmaßen (HLS)

1. Um die HLS durchführen zu können, müssen die Prüfärzte die lokalen Ethikrichtlinien der IACUC befolgen. Dazu gehört auch die Verwendung geeigneter Käfigabmessungen und Bodenbeläge, die für die Fortbewegung, das Fressen und die Trinkgewohnheiten der Tiere unter HLS-Bedingungen von entscheidender Bedeutung sind.
   HINWEIS: Für die Wundheilung wird eine Genesung von 4 Tagen nach CLP empfohlen.
2. Nach 4 Tagen nach der Genesung von CLP oder Scheinoperation wird das Tier unter leichtem Isofluranfluss (2,5 %, 100-125 ml/min) anästhesiert. Befestige den Mausschwanz mit Schaumstoffband an einer kurzen Metallkette. Lege die Metallkette parallel zum Schwanz, während das Schaumstoffband den Schwanz und die Kette fest aneinander schließt.
3. Um die Aufhängung der Hinterbeine zu gewährleisten, befestigen Sie die Metallkette an einem Haken, der mit einer Querstange in der Mitte des Käfigs verbunden ist. Befestigen Sie zusätzlich einen zweiten kleinen Balken, der sich entlang der Querstange bewegen kann, um dem Tier eine größere Bewegungsfähigkeit zu ermöglichen.
   HINWEIS: Die Tiere müssen in der Lage sein, sich über ihre Vorderbeine zu bewegen, indem sie das Metallgitter am Käfigboden verwenden.
4. Passen Sie die Höhe der hängenden Gliedmaßen an, um den Kontakt der Pfoten mit den Chow-Pellets zu verhindern. Überwachen Sie die Tiere und reinigen Sie den rasierten Bereich um die genähte Haut mindestens zweimal täglich von Hand mit einem wassergetränkten Wattestäbchen während der Suspensionsperiode.
   HINWEIS: Die Reinigung ist entscheidend, um Infektionen an der Operationsstelle zu vermeiden, insbesondere durch Verbrühungen des Urins aufgrund der erhöhten Körperposition.
5. Um die Ergebnisse zu reproduzieren, stellen Sie sicher, dass die Tiere 7 Tage lang einer Aufhängung der Hintergliedmaßen unterzogen werden. Die Dauer wurde auf der Grundlage früherer Zeitverlaufsstudien bestimmt, die zeigten^, dass die minimale Zeit, die für die Suspension der Hintergliedmaßen erforderlich ist, um unter nicht-septischen Bedingungen signifikante Auswirkungen auf die Skelettmuskulatur hervorzurufen^12,13.
   HINWEIS: Das Überleben, das Unbehagen oder die Not der Tiere nehmen je nach Schwere der Infektion zu.

3. Beurteilung der septischen Tiere

HINWEIS: Die Beurteilung des klinischen Zustands des Tieres ist ein wichtiger Aspekt, um den Schweregrad nach CLP-/Scheinoperationen im Auge zu behalten. Außerdem müssen, wie von der IACUC gefordert, humane Endpunkte für den Tierschutz festgelegt werden. Um diese Bedenken auszuräumen und Standards für die tägliche Tierpflege festzulegen, wurden Anweisungen für die Durchführung von Tierbewertungen anhand des modifizierten murinen Sepsis-Scores (MMSS) verwendet¹⁴.

1. Verwenden Sie das MMSS (Supplementary File 1), um das Tier zu beurteilen. Beachten Sie, dass für jede Kategorie eine Punktzahl von 0 für ein gesundes Tier steht. Bewerten Sie das Tier zweimal täglich von 0 bis 3 entsprechend der Schwere der Infektion.
2. Um die Genauigkeit zu verbessern, messen Sie die Xiphoid-Oberflächentemperatur und das Körpergewicht zweimal täglich^11,15 und zeichnen Sie es zusammen mit dem MMSS-Scoresheet auf.
   HINWEIS: Typische Schwankungen der Xiphoid-Oberflächentemperatur und des Körpergewichts sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.
3. Wenden Sie sich an die örtliche IACUC für humane Endpunkte.
   HINWEIS: Um die Ergebnisse zu reproduzieren, wurden die folgenden Kriterien als Endpunkte verwendet: (1) Körpergewichtsverlust >40 % gegenüber dem Ausgangswert. (2) Temperatur <30 °C oder Absenkung um >5 °C gegenüber dem vorherigen Wert. (3) Eine Punktzahl von 3 in den folgenden Bereichen: Reaktion auf Reize, Bewusstseinsniveau oder Atmungsqualität. (4) Tägliche MSSS insgesamt ≥17. Die hier beschriebene Beurteilung ist für die postoperative Behandlung und bei Tieren konzipiert, die sich einer normalen Ambulation unterziehen. Es wird empfohlen, auf den Umgang mit Tieren, die sich einer HLS unterziehen, zu verzichten, um den Kontakt zwischen den Hinterbeinen und der Oberfläche zu vermeiden. Nach der abschließenden Bewertung schläfern Sie das Tier gemäß den Empfehlungen der örtlichen Tierethikkommission ein.

Ergebnisse

Für die repräsentativen Daten, die in den Ergebnissen gezeigt wurden, wurden männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 17 Wochen mit einer Körpermasse von 27 bis 34 g verwendet. Das gesamte Protokoll dauert elf Tage und besteht aus dem chirurgischen Eingriff (CLP oder Schein), der Unterstützung durch Kochsalzlösung und Analgetika (Tage 0 bis 4) und der HLS-Unterbrechung (Tage 4 bis 11). Endexperimente können zu jedem Zeitpunkt während der Suspensionsphase durchgeführt werden. Um de...

Diskussion

Das aktuelle Protokoll enthält technische Richtlinien für die Implementierung eines neuen präklinischen Modells der Sepsis-induzierten Myopathie. Alle Materialien und wichtigen Schritte für die Reproduktion des Modells sind ausführlich beschrieben. Dieser Ansatz kann die bei septischen Patienten beobachtete Skelettmuskeldysfunktion reproduzieren, was die Rolle des Nichtgebrauchs als entscheidende Komponente bei der Verschlechterung der Myopathie hervorhebt. Bisher wurde in der Mehrz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Ethicon Coated Vicryl	Ethicon	D5792	Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"	Ethicon	662G	Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G	BD	305136 for 27g needle	Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #000664
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	Swabs for topical application of iodine.
Cryostat	(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415	Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)	Fisher Scientific		To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages	Custom Made	N/A	These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube	Optixcare		Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11	Fine Science		Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac	Zimmer	736579	Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific Corporation	SS-01	Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus	Aurora Scientific	Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C