JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

Abstract

מעקב סביבתי מוכר ככלי חשוב להערכת בריאות הציבור בעידן שלאחר המגפה. מים, במיוחד שפכים, התגלו כמקור הבחירה לדגום עומסים פתוגניים בסביבה. שפכים מנקז פתוח וממתקני טיהור מים קהילתיים הם מאגר של פתוגנים וגנים של עמידות מיקרוביאלית (AMR), ולעתים קרובות באים במגע עם בני אדם. בעוד שישנן שיטות רבות למעקב אחר AMR ממים, בידוד DNA באיכות טובה בתפוקות גבוהות מדגימות הטרוגניות נותר אתגר. כדי לפצות, נפחי הדגימה צריכים לעתים קרובות להיות גבוהים, מה שיוצר אילוצים מעשיים. בנוסף, דנ"א סביבתי הוא לעתים קרובות מקוטע, והמקורות של AMR (פלסמידים, פאגים, דנ"א ליניארי) מורכבים מדנ"א במשקל מולקולרי נמוך. עם זאת, תהליכי מיצוי מעטים התמקדו בשיטות למיצוי בתפוקה גבוהה של DNA ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך. כאן, שיטה פשוטה למיצוי DNA ליניארי בעל תפוקה גבוהה מכמויות קטנות של שפכים באמצעות תכונות המשקעים של פוליאתילן גליקול (PEG) מדווחת. מחקר זה מציג טיעון להגדלת תפוקת הדנ"א הכוללת מדגימות מים שנאספו לצורך ניתוח מטאגנומי על ידי העשרת שיעור הדנ"א הלינארי. בנוסף, שיפור DNA במשקל מולקולרי נמוך מתגבר על הבעיה הנוכחית של תת-דגימה של AMR סביבתי עקב התמקדות בדנ"א בעל משקל מולקולרי גבוה ותוך תאי. שיטה זו צפויה להיות שימושית במיוחד כאשר קיים דנ"א חוץ-תאי אך בריכוזים נמוכים, כגון עם קולחים ממתקני טיהור. זה אמור גם לשפר את הדגימה הסביבתית של מקטעי גנים AMR המתפשטים באמצעות העברת גנים אופקית.

Introduction

SARS-CoV-2 ותוצאותיו הדגישו את חשיבות המעקב הסביבתי בניטור וחיזוי התפרצויות מחלות זיהומיות 1,2. בעוד שמגפות ויראליות ניכרות, עליית העמידות האנטי-מיקרוביאלית (AMR) מתוארת לעתים קרובות כמגיפה חתרנית וכזו המהווה דאגה מובילה לבריאות הציבור ברחבי העולם 3,4. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות מתואמות כדי להבין את האבולוציה וההתפשטות של AMR. גופי מים, כמו גם שפכים, יכולים לשמש כמאגרים הן לפתוגנים והן ל- AMR 5,6,7,8. מקורות מים משותפים הם, אם כן, מקור רב עוצמה להעברת מחלות בקרב בני אדם, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית (LMIC) שבהן היגיינה ירודה והתפוצצות אוכלוסין הולכות יד ביד 9,10,11. בדיקות של מקורות מים כבר זמן רב משמש כדי להעריך את בריאות הקהילה 12,13,14. לאחרונה, שפכים ממתקני טיהור שפכים עירוניים הוכיחו את עצמם כאינדיקטור מתקדם טוב למקרי COVID במרפאה 1,2,15,16,17,18.

בהשוואה לניטור מחלות ספציפיות, איתור ומעקב אחר AMR בסביבה מהווה בעיה מורכבת יותר. המספר הגדול של אנטיביוטיקה בשימוש, גנים מגוונים של עמידות, לחצי ברירה מקומיים שונים והעברת גנים אופקית בין חיידקים מקשים על הערכת נטל AMR אמיתי, ולאחר ההערכה, לקשר אותו עם תצפיות קליניות 19,20,21,22. כתוצאה מכך, בעוד מעקב מרוכז אחר AMR קליני מתבצע על ידי מספר ארגונים ברחבי העולם 3,23,24, ניטור AMR סביבתי עדיין בחיתוליו, נסקר ב 19,25,26.

בשנים האחרונות דווח על שיטות שונות למעקב אחר AMR סביבתי 5,27, שנבדקוב-28,29. נקודת המוצא של רוב אלה היא הפקת DNA באיכות טובה מדגימות סביבתיות הטרוגניות, אתגר בפני עצמו. בנוסף, דנ"א סביבתי הוא בדרך כלל מקוטע בגלל חשיפה לסביבה עוינת. דנ"א חוץ-תאי מקוטע מוכר זה מכבר כמאגר חשוב של גני AMR (נסקר ב-30,31,32), עם פוטנציאל נוסף להיכנס ולצאת מחיידקים באמצעות העברת גנים אופקית. לכן, חשוב שכל פרוטוקול שמטרתו למדוד את עומס AMR בסביבה ידגום DNA ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך בצורה הטובה ביותר האפשרית. באופן מפתיע, התמקד מעט בפיתוח שיטות ספציפיות למיצוי בעל תפוקה גבוהה של דנ"א ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך: עבודה זו מתמקדת בטיפול בפער.

שיטה נפוצה ופשוטה לזירוז דנ"א היא שילוב פוליאתילן גליקול (PEG) ומלחים כגון נתרן כלורי (NaCl)33. PEG הוא חומר צפיפות מקרומולקולרי המשמש להשגת משקעים ספציפיים לגודל של מקטעי DNA34,35. ככל שריכוז ה-PEG נמוך יותר, כך המשקל המולקולרי של הדנ"א שניתן לזרז ביעילות גבוה יותר. מחקרים רבים השתמשו ב-PEG במהלך מיצוי סביבתי של דנ"א ורנ"א 1,2 (מסוכם בטבלה 1 17,33,36,37,38,39) בשלב הסופי 33,36,37 או כדי לרכז דגימות מים גדולות להפקת חלקיקים נגיפיים כמו ב-SARS-CoV-2 15,40. בעבודה הנוכחית נמצא כי ריכוזי ה-PEG ששימשו בעבר למיצוי דנ"א סביבתי (שנקבעו במידה רבה על ידי פרוטוקולי מעקב נגיפיים) אינם לוכדים דנ"א ליניארי בעל משקל מולקולרי נמוך. לכן, הם מפסידים דגימה של מקטעי דנ"א קצרים ואינם מתאימים להערכת תוכן AMR במדויק. מחקר זה ניצל את התכונות של פוליאתילן גליקול ונתרן כלורי כדי לזרז ביעילות מקטעי DNA ליניאריים בעלי משקל מולקולרי נמוך בתפוקה גבוהה שיכולה, בעתיד, להוביל לשיטת מיצוי DNA חסכונית. שיטה זו יכולה לשמש להעשרת היחס של DNA מקוטע ומשקל מולקולרי נמוך מדגימות טבעיות מורכבות, ובכך ללכוד תמונה מדויקת יותר של AMR סביבתי. עם קצת יותר חידוד, הטכניקה משאילה את עצמה ליישום קל ובעלות נמוכה על ידי תאגידים עירוניים מקומיים וגופים ממשלתיים אחרים לשימוש ככלי מעקב עם הכשרה טכנית מינימלית.

Protocol

1. דיגום שפכים

  1. טבלו פוליפרופילן בנפח 500 מ"ל במאגר הניקוז הפתוח או במתקן טיהור השפכים (STP) ואספו ~300 מ"ל של דגימת שפכים.
  2. העבר ~ 250 מ"ל של הדגימה לבקבוק פוליפרופילן אוטוקלאבד 250 מ"ל.
  3. הבריגו את פקק הבקבוק ואטמו אותו בסרט פלסטיק. שמרו את הבקבוק זקוף בשקית סגורה.
  4. העבירו את הדגימה זקופה במיכל סגור בטמפרטורת הסביבה.
  5. השבת בחום את הדגימה בטמפרטורה של 70°C בתנור אוויר חם למשך 4 שעות לפני עיבודה למיצוי DNA.

2. הפקת DNA מדגימות שפכים

  1. לאחר קירור דגימת השפכים, מערבלים את הדגימות במהירות מרבית ומניחים לפסולת/בוצה לשקוע.
  2. דקנט 27.5 מ"ל של השפכים בצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ולהוסיף 13.5 גרם של PEG-8000 (ריכוז סופי 30%) ו 3 גרם של NaCl (ריכוז סופי 1.2 M) אליו ולערבב היטב עד מומס לחלוטין.
  3. לדגור את הדגימה לילה (~ 16-18 שעות) ב 4 ° C.
  4. צנטריפוגה הדגימה ב 15,500 x גרם ב 4 ° C במשך 30 דקות.
  5. השליכו את הסופרנטנט.
    הערה: PEG-8000 ב-30% הוא צמיג מאוד, והגלולה יכולה להיזרק בזמן השלכת הסופרנטנט. יש לנטרל את הסופרנאטנט לאט ובזהירות כדי להבטיח שהגלולה לא תאבד. שלבים 2.6 עד 2.23 מבוצעים באמצעות ערכת מיצוי DNA קרקע בהתאם להוראות הערכה עם מספר שינויים.
  6. ממיסים את הגלולה ב 800 μL של תמיסת הליזיס של הערכה ומוסיפים את התמיסה לצינור חרוזי הזירקוניום המעורב.
    הערה: אם אתה מעבד נפחים גדולים יותר, אחסן את הכדוריות ממספר הצינורות הרצוי. לדוגמה, אם עיבוד 160 מ"ל של דגימה; יהיו ארבעה צינורות 50 מ"ל המכילים שפכים עם PEG ו- NaCl. לאחר צנטריפוגה של כל ארבעת הצינורות ב 15,500 x גרם ב 4 ° C במשך 30 דקות, להשליך supernatant מכל ארבעת הצינורות. הוסף 200 μL של תמיסת CD1 לכל אחד, להשהות מחדש את הכדוריות, ולאגד אותם יחד בצינור חרוז אחד.
  7. הדקו את צינור החרוז בצורה אופקית על מערבולת. מערבלים את הצינור במהירות מרבית למשך 20-30 דקות.
    הערה: מערבולות ממושכות מבטיחות ליזה מלאה והומוגניזציה של הדגימות, מה שמשפר את תפוקת ה- DNA.
  8. סובבו את הצינורות במהירות של 8,000 x גרם במשך 15 שניות כדי למקם את החרוזים בתחתית, הסירו קצף, והעבירו את הסופרנאטנט לחלוטין מהצינור לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. חלק מהחרוזים עשויים גם להיות מועברים במהלך שלב זה.
  9. צנטריפוגה את supernatant ב 15,000 x גרם במשך 1 דקה.
  10. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 2 מ"ל. הסופרנאטנט עדיין עשוי להכיל כמה חלקיקים מרחפים.
  11. הוסף 200 μL של תמיסה משקעת ומערבולת במהירות מקסימלית במשך 5 שניות. יש לדגור ב-4°C למשך 5 דקות.
    הערה: דגירה ב 4 ° C מגביר את היעילות של משקעים של חלבונים ופסולת התא בעוד DNA נשאר בתמיסה. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה למשך עד שעתיים ללא ירידה משמעותית בתפוקה ובאיכות הדנ"א המופק.
  12. צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT). הימנעו מהגלולה והעבירו את הסופרנאטנט השקוף לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 2 מ"ל.
  13. הוסף 600 μL של חיץ קשירה לכל 700 μL של supernatant ומערבולת במהירות מרבית למשך 5 שניות.
  14. יש להעמיס 700 μL של הליזט על עמוד ספין סיליקה, לדגור במשך 2 דקות, ולצנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 1 דקה.
    הערה: דגירה של ליזט על עמודת סיליקה משפרת את קשירת הדנ"א לעמודה, וכתוצאה מכך תפוקת דנ"א טובה יותר.
  15. מחק את הזרימה וחזור על שלב 2.14 עד שכל הליזט יעבור דרך עמודת הסיבוב.
  16. מניחים בזהירות את עמוד הסחיטה לתוך צינור איסוף נקי של 2 מ"ל. ודא שלא ניתזה זרימה על עמוד הסיבוב.
  17. הוסף 500 μL של חיץ כביסה לעמוד הסחיטה וצנטריפוגה את עמוד הסחיטה ב- 15,000 x גרם למשך דקה אחת.
  18. מחק את הזרימה והחזיר את עמודת הספין לאותו צינור איסוף של 2 מ"ל.
  19. הוסף 500 μL של חיץ אתנול לשטיפת עמוד הסחיטה. צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה.
  20. השליכו את עמוד הזרימה והכניסו את עמוד הסחרור לצינור איסוף חדש של 2 מ"ל.
  21. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 2 דקות כדי להסיר אתנול שיורי. הכנס את עמוד הסחרור לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
  22. מוסיפים 100 μL של חיץ אלוציה (מחומם מראש ל-55°C) למרכז קרום הפילטר הלבן ודגרים במשך 5 דקות.
    הערה: חיץ אלוציה מחומם, יחד עם דגירה על הממברנה, מגביר את היעילות של שאיבת DNA, במיוחד DNA במשקל מולקולרי גבוה.
  23. צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה. מחק את עמודת הסיבוב.
  24. לדנ"א המדולל, יש להוסיף 10 μL של 3 M NaCl (1/10 נפח של DNA eluate) ו-250 μL של אתנול מוחלט מקורר (2.5 נפח של DNA eluate). הפוך כדי לערבב היטב ולסובב את התוכן ב 8,000 x גרם במשך 15 שניות.
  25. לדגור על תערובת DNA-אתנול ב -20 ° C במשך 1 שעה לפחות.
    הערה: ניתן להגדיל את הדגירה של תערובת DNA-אתנול ל -16 שעות ללא ירידה משמעותית בתשואה או באיכות של ה- DNA המופק.
  26. צנטריפוגה ב-19,000 x גרם ב-4°C למשך 30 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הקנטה.
  27. מוסיפים 500 μL של אתנול 70% צונן לכדור.
  28. צנטריפוגה ב-19,000 x גרם ב-4°C למשך 15 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הקנטה.
  29. הפוך והקש בעדינות על הצינור על נייר טישו כדי להסיר שאריות אתנול על ידי פעולה נימית.
  30. יבש את כדורית ה- DNA לחלוטין על ידי שמירה על צינורות פתוחים על בלוק חימום במשך 5-10 דקות ב 37 ° C עד שכל אתנול התאדה.
  31. להשהות מחדש את גלולת הדנ"א ב 30-50 μL של מים מזוקקים כפול autoclaved (ddH2O). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5-10 דקות.
  32. סובבו את הדנ"א במהירות של 8,000 x גרם למשך 15 שניות.
  33. בחר ביישום dsDNA תחת ההגדרות חומצות גרעין בספקטרופוטומטר ננו-טיפה.
    1. נקו את הכן עם נייר טישו ללא סיבים ומים. השתמש ב- ddH2O כדי לרוקן את המכשיר ולאחר מכן טען 2 μL של דגימת ה- DNA על הדום.
    2. מדוד את יחסי הריכוז והספיגה (A260/280 ו- A260/230) כדי לקבוע את הטוהר.
  34. אחסן את דגימת ה- DNA ב -20 ° C.

3. משקעים של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) - DNA ליניארי מוגבר לבדיקת התאוששות DNA על פני מגוון משקלים מולקולריים

  1. באמצעות DNA גנומי מ- E. coli MG155, להגביר מקטעי גנים על ידי PCR כדי ליצור מאגר של מקטעים ליניאריים מהגנים הבאים: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (ראה טבלה 2 עבור רצפי פריימר ותנאי PCR).
  2. לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור ה-PCR ולאגד את מוצרי ה-PCR יחד.
  3. חלקו את האמפליקונים המאוחדים לצינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל בעלי נפחים שווים - תייגו צינור אחד כ'דנ"א קלט'.
  4. הוסף PEG ו- NaCl בהתאם לתנאים הרצויים (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0.3 M, 1.2 M NaCl) לכל אחד מהצינורות למעט זה שכותרתו 'קלט DNA' והשלם את הנפח הסופי ל- 1 מ"ל.
  5. לדגור את הצינורות לילה (~ 16-18 שעות) ב 4 ° C.
    הערה: בשאר השלבים עד 3.16, 'DNA קלט' נשמר ללא שינוי במקרר.
  6. סובבו את הצינורות במיקרו-צנטריפוגה שולחנית בהתאם למהירות הרצויה (15,000 x גרם או 20,000 x גרם) למשך שעה אחת ב-4°C.
  7. בזהירות להסיר 900 μL של supernatant מהצד מול הגלולה באמצעות micropipette.
  8. שטיפת אתנול ראשונה: הוסיפו 900 μL אתנול 70% צונן לגלולה וערבבו על ידי היפוך עדין של הצינורות.
  9. סובב את הצינורות באותה מהירות שבה נעשה שימוש בשלב 3.6 (15,000 x גרם או 20,000 x גרם) למשך 30 דקות ב- 4 ° C.
  10. הסר את supernatant על ידי decantation.
  11. שטיפת אתנול שנייה: הוסיפו לכדורית 500 מיקרוליטר אתנול 70% מקורר.
  12. סובב את הצינורות באותה מהירות שבה נעשה שימוש בשלב 3.6 (15,000 x גרם או 20,000 x גרם) למשך 30 דקות ב-4°C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הקנטה.
  13. הפוך והקש בעדינות על הצינור על נייר טישו כדי להסיר שאריות אתנול על ידי פעולה נימית.
  14. יבש את כדורית ה- DNA לחלוטין על ידי שמירה על צינורות פתוחים על בלוק חימום במשך 5-10 דקות ב 37 ° C עד שכל אתנול מתאדה.
  15. להשהות מחדש את הגלולה ב 20 μL של מים מזוקקים כפול autoclaved.
  16. למדוד את ריכוז הדנ"א המואץ על ידי התנאים השונים ואת 'דנ"א הקלט' באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפה או פלואורומטר.
  17. טען את ה- DNA המואץ על ג'ל אגרוז 1% להדמיית DNA.

  

תוצאות

קביעת פרוטוקול למיצוי DNA בתפוקה גבוהה מדגימות שפכים
גרסה שונה של פרוטוקולים שנקבעו בעבר שימשה להפקת DNA ו- RNA באיכות גבוהה מדגימות מים17. הדגימות נלקחו מנקז פתוח וכן ממתקני טיהור שפכים באזור דלהי-NCR בצפון הודו. לאחר עיבוד מקדים באמצעות PEG ו-NaCl (

Discussion

AMR הוא אחד מעשרת האיומים הבריאותיים המובילים כיום, כפי שצוין על ידי ארגון הבריאות העולמי, ומעקב סביבתי אחר AMR מוכר ככלי חשוב ברחבי העולם. כפי שהוזכר במבוא, תיעוד מקיף של AMR סביבתי כולל דנ"א בעל משקל מולקולרי נמוך, מקוטע וחוץ-תאי. פרוטוקול העיבוד המקדים שדווח כאן באמצעות ריכוז גבוה של PEG בשילוב...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

אנו מכירים בתמיכת מימון מקרן רוקפלר (מענק קרן רוקפלר מספר 2021 HTH 018) כחלק מצוות APSI הודו (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). אנו מכירים גם בסיוע הכספי שניתן על ידי בנק Axis לתמיכה במחקר זה ובית הספר Trivedi למדעים ביולוגיים באוניברסיטת אשוקה עבור ציוד ותמיכה אחרת.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-seat microcentrifugeEppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Bench top refrigerated centrifugeEppendorf Centrifuge 5920 REP5948000131
ChemiDoc Imaging SystemBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mLTarsons510051
Molecular Biology Grade Water for PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)ThermofisherQ33238
Qubit Assay TubesThermofisherQ32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad rangeThermo ScientificQ32853 (500 assays)
Sodium ChlorideHiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)Applied Biosystems4484073
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125

References

  1. Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
  2. Amman, F., et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-COV-2 at national scale. Nat Biotechnol. 40 (12), 1814-1822 (2022).
  3. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  4. The L. Antimicrobial resistance. The L. Antimicrobial resistance: Time to repurpose the global fund. Lancet. 399 (10322), 335 (2022).
  5. Munk, P., et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance. Nat Commun. 13 (1), 7251 (2022).
  6. Parnanen, K. M. M., et al. Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence. Sci Adv. 5 (3), 9124 (2019).
  7. Grenni, P. Antimicrobial resistance in rivers: A review of the genes detected and new challenges. Environ Toxicol Chem. 41 (3), 687-714 (2022).
  8. Siri, Y., Precha, N., Sirikanchana, K., Haramoto, E., Makkaew, P. Antimicrobial resistance in southeast Asian water environments: A systematic review of current evidence and future research directions. Sci Total Environ. 896, 165229 (2023).
  9. Hunter, P. R., Macdonald, A., Carter, R. C. Water supply and health. PLoS Med. 7 (11), e1000361 (2010).
  10. Bain, R., et al. Fecal contamination of drinking-water in low- and middle-income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 11 (5), e1001644 (2014).
  11. Collignon, P., Beggs, J. J., Walsh, T. R., Gandra, S., Laxminarayan, R. Anthropological and socioeconomic factors contributing to global antimicrobial resistance: A univariate and multivariable analysis. Lancet Planet Health. 2 (9), e398-e405 (2018).
  12. Asghar, H., et al. Environmental surveillance for polioviruses in the global polio eradication initiative. J Infect Dis. 210, S294-S303 (2014).
  13. Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Hernandez, F., Zuccato, E., Castiglioni, S. Wastewater-based epidemiology as a novel biomonitoring tool to evaluate human exposure to pollutants. Environ Sci Technol. 52 (18), 10224-10226 (2018).
  14. Choi, P. M., et al. economic correlates of food and chemical consumption measured by wastewater-based epidemiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21864-21873 (2019).
  15. Hemalatha, M., et al. Surveillance of SARS-COV-2 spread using wastewater-based epidemiology: Comprehensive study. Sci Total Environ. 768, 144704 (2021).
  16. Westhaus, S., et al. Detection of sars-cov-2 in raw and treated wastewater in Germany - suitability for COVID-19 surveillance and potential transmission risks. Sci Total Environ. 751, 141750 (2021).
  17. Lamba, S., et al. SARS-COV-2 infection dynamics and genomic surveillance to detect variants in wastewater - a longitudinal study in Bengaluru, India. Lancet Reg Health Southeast Asia. 11, 100151 (2023).
  18. Stockdale, S. R., et al. RNA-seq of untreated wastewater to assess COVID-19 and emerging and endemic viruses for public health surveillance. Lancet Reg Health Southeast Asia. 14, 100205 (2023).
  19. Bengtsson-Palme, J., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs. Environ Int. 178, 108089 (2023).
  20. Bengtsson-Palme, J., Kristiansson, E., Larsson, D. G. J. Environmental factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 42 (1), 053 (2018).
  21. Dunachie, S. J., Day, N. P., Dolecek, C. The challenges of estimating the human global burden of disease of antimicrobial resistant bacteria. Curr Opin Microbiol. 57, 95-101 (2020).
  22. Hughes, D., Andersson, D. I. Evolutionary trajectories to antibiotic resistance. Annu Rev Microbiol. 71, 579-596 (2017).
  23. World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS). World Health Organization. , (2022).
  24. Walia, K., et al. Establishing antimicrobial resistance surveillance & research network in india: Journey so far. Indian J Med Res. 149 (2), 164-179 (2019).
  25. Hart, A., Warren, J., Wilkinson, H., Schmidt, W. Environmental surveillance of antimicrobial resistance (AMR), perspectives from a national environmental regulator in 2023. Euro Surveill. 28 (11), (2023).
  26. Huijbers, P. M. C., Flach, C. F., Larsson, D. G. J. A conceptual framework for the environmental surveillance of antibiotics and antibiotic resistance. Environ Int. 130, 104880 (2019).
  27. Liguori, K., et al. Antimicrobial resistance monitoring of water environments: A framework for standardized methods and quality control. Environ Sci Technol. 56 (13), 9149-9160 (2022).
  28. Hayward, C., Ross, K. E., Brown, M. H., Whiley, H. Water as a source of antimicrobial resistance and healthcare-associated infections. Pathogens. 9 (8), 667 (2020).
  29. Booton, R. D., et al. One health drivers of antibacterial resistance: Quantifying the relative impacts of human, animal and environmental use and transmission. One Health. 12, 100220 (2021).
  30. Sivalingam, P., Pote, J., Prabakar, K. Extracellular DNA (eDNA): Neglected and potential sources of antibiotic resistant genes (ARGs) in the aquatic environments. Pathogens. 9 (11), 874 (2020).
  31. Woegerbauer, M., Bellanger, X., Merlin, C. Cell-free DNA: An underestimated source of antibiotic resistance gene dissemination at the interface between human activities and downstream environments in the context of wastewater reuse. Front Microbiol. 11, 671 (2020).
  32. Kittredge, H. A., Dougherty, K. M., Evans, S. E. Dead but not forgotten: How extracellular DNA, moisture, and space modulate the horizontal transfer of extracellular antibiotic resistance genes in soil. Appl Environ Microbiol. 88 (7), 0228021 (2022).
  33. Lever, M. A., et al. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front Microbiol. 6, 476 (2015).
  34. Lis, J. T., Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2 (3), 383-389 (1975).
  35. He, Z., Zhu, Y., Gu, H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (20), 9175-9183 (2013).
  36. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. Biotechniques. 49 (3), 631-640 (2010).
  37. Arbeli, Z., Fuentes, C. L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples. FEMS Microbiol Lett. 272 (2), 269-275 (2007).
  38. Verma, S. K., Singh, H., Sharma, P. C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 7 (3), 171 (2017).
  39. Narayan, A., Jain, K., Shah, A. R., Madamwar, D. An efficient and cost-effective method for DNA extraction from athalassohaline soil using a newly formulated cell extraction buffer. 3 Biotech. 6 (1), 62 (2016).
  40. Sapula, S. A., Whittall, J. J., Pandopulos, A. J., Gerber, C., Venter, H. An optimized and robust peg precipitation method for detection of sars-cov-2 in wastewater. Sci Total Environ. 785, 147270 (2021).
  41. Calderon-Franco, D., Van Loosdrecht, M. C. M., Abeel, T., Weissbrodt, D. G. Free-floating extracellular DNA: Systematic profiling of mobile genetic elements and antibiotic resistance from wastewater. Water Res. 189, 116592 (2021).
  42. Sangamnere, R., Misra, T., Al Bherwani, H. E. t. A critical review of conventional and emerging wastewater treatment technologies. Sustain Water Resour Manag. 9, 58 (2023).
  43. . Centrifugation at 30,000 x g. in plasmid DNA precipitation allows better recovery rates and shorter centrifugation times. Application note no: 234, Eppendorf Available from: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/157398_Application/Eppendorf_Centrifugation_Application-Note_234_Centrifuge-5430-familiy_Safe-Lock-Tubes_Centrifugation-at-30_000-x-g-plasmid-DNA-precipitation-allows-better-recovery-rates-shorter-centrifug.pdf  (2017)
  44. Atha, D. H., Ingham, K. C. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume. J Biol Chem. 256 (23), 12108-12117 (1981).
  45. Sivalingam, P., et al. Extracellular DNA includes an important fraction of high-risk antibiotic resistance genes in treated wastewaters. Environ Pollut. 323, 121325 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved