JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы представляем простой метод оценки устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) окружающей среды путем увеличения доли внеклеточной ДНК с низкой молекулярной массой. Предварительная обработка 20%-30% ПЭГ и 1,2 М NaCl позволяет обнаруживать как геномные, так и горизонтально перенесенные гены AMR. Протокол позволяет использовать процесс без наборов с дополнительной оптимизацией.

Аннотация

Эпиднадзор за окружающей средой признан важным инструментом оценки здоровья населения в постпандемическую эпоху. Вода, в частности сточные воды, стала предпочтительным источником отбора проб патогенных микроорганизмов в окружающей среде. Сточные воды из открытых стоков и общественных водоочистных сооружений являются резервуаром как патогенов, так и генов устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) и часто вступают в контакт с человеком. Несмотря на то, что существует множество методов отслеживания УПП из воды, выделение ДНК хорошего качества с высоким выходом из гетерогенных образцов остается сложной задачей. Чтобы компенсировать это, часто требуется большой объем образцов, что создает практические ограничения. Кроме того, ДНК окружающей среды часто фрагментирована, а источники УПП (плазмиды, фаги, линейная ДНК) состоят из низкомолекулярной ДНК. Тем не менее, лишь немногие процессы экстракции были сосредоточены на методах высокопродуктивной экстракции линейной и низкомолекулярной ДНК. В данной работе представлен простой метод высокопродуктивной линейной экстракции ДНК из небольших объемов сточных вод с использованием осадительных свойств полиэтиленгликоля (ПЭГ). Это исследование доказывает необходимость увеличения общего выхода ДНК из образцов воды, собранных для метагеномного анализа, за счет обогащения доли линейной ДНК. Кроме того, усиление низкомолекулярной ДНК позволяет решить текущую проблему недостаточной выборки УПП окружающей среды из-за акцента на высокомолекулярную и внутриклеточную ДНК. Ожидается, что этот метод будет особенно полезен в тех случаях, когда внеклеточная ДНК существует, но в низких концентрациях, например, в сточных водах очистных сооружений. Это также должно улучшить отбор проб из окружающей среды фрагментов гена AMR, которые распространяются через горизонтальный перенос генов.

Введение

SARS-CoV-2 и его последствия подчеркнули важность эпиднадзора за окружающей средой для мониторинга и прогнозирования вспышек инфекционных заболеваний 1,2. Несмотря на очевидные вирусные пандемии, рост устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) часто описывается как коварная пандемия, которая представляет собой одну из главных проблем общественного здравоохранения во всем мире 3,4. Следовательно, существует острая необходимость в скоординированных стратегиях для понимания эволюции и распространения УПП. Водоемы, как и сточные воды, могут служить резервуарами как для патогенов, так и для УПП 5,6,7,8. Таким образом, общие источники воды являются мощным источником передачи болезней среди людей, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода (СНСД), где плохая гигиена и перенаселение идут рука об руку 9,10,11. Тестирование источников воды уже давно используется для оценки состояния здоровья населения 12,13,14. В последнее время сточные воды городских очистных сооружений оказались хорошим опережающим индикатором случаев COVID в клинике 1,2,15,16,17,18.

По сравнению с мониторингом конкретных заболеваний, обнаружение и отслеживание УПП в окружающей среде представляет собой более сложную проблему. Большое количество используемых антибиотиков, разнообразные гены устойчивости, различное давление местного отбора и горизонтальный перенос генов среди бактерий затрудняют оценку истинного бремени УПП и, после оценки, соотнесение его с клиническими наблюдениями 19,20,21,22. В результате, в то время как согласованный эпиднадзор за клинической УПП проводится несколькими организациями по всему миру 3,23,24, мониторинг экологической УПП все еще находится в зачаточном состоянии, рассмотрен в 19,25,26.

В последние годы сообщалось о различных методах отслеживания экологических УПП 5,27, рассмотренных в28,29. Отправной точкой для большинства из них является извлечение ДНК хорошего качества из разнородных образцов окружающей среды, что само по себе является сложной задачей. Кроме того, ДНК окружающей среды обычно фрагментируется из-за воздействия агрессивной окружающей среды. Фрагментированная внеклеточная ДНК уже давно признана важным резервуаром генов AMR (рассмотрено в 30,31,32) с добавленным потенциалом проникновения и выхода из бактерий посредством горизонтального переноса генов. Следовательно, важно, чтобы любой протокол, направленный на измерение бремени УПП в окружающей среде, как можно лучше отбирал образцы линейной и низкомолекулярной ДНК. Удивительно, но мало внимания уделялось разработке методов, специфичных для высокопродуктивной экстракции линейной и низкомолекулярной ДНК: эта работа сосредоточена на устранении этого разрыва.

Распространенным и простым методом осаждения ДНК является соединение полиэтиленгликоля (ПЭГ) и солей, таких как хлорид натрия (NaCl)33. ПЭГ является высокомолекулярным агентом сквырастивания, используемым для достижения размерно-специфического осаждения фрагментов ДНК34,35. Чем ниже концентрация ПЭГ, тем выше молекулярная масса ДНК, которая может быть эффективно осаждена. Во многих исследованиях ПЭГ использовался во время экстракции ДНК и РНК 1,2 в окружающей среде (обобщено в таблице 1 17,33,36,37,38,39) либо на заключительном этапе 33,36,37, либо для концентрации больших проб воды для экстракции вирусных частиц, как в случае с SARS-CoV-2 15,40. В текущей работе было обнаружено, что концентрации ПЭГ, использованные ранее для экстракции ДНК из окружающей среды (в значительной степени определяемые протоколами вирусного надзора), не охватывают низкомолекулярную линейную ДНК. Таким образом, они проигрывают в отборе коротких фрагментов ДНК и не подходят для точной оценки содержания УПП. В этом исследовании были использованы свойства полиэтиленгликоля и хлорида натрия для эффективного осаждения низкомолекулярных линейных фрагментов ДНК с высоким выходом, что в будущем может привести к экономически эффективному методу экстракции ДНК. Этот метод может быть использован для обогащения доли фрагментированной и низкомолекулярной ДНК из сложных природных образцов, что позволяет получить более точную картину УПП в окружающей среде. При небольшом дальнейшем совершенствовании этот метод может быть легко и недорого применен местными муниципальными корпорациями и другими государственными органами в качестве инструмента наблюдения с минимальной технической подготовкой.

протокол

1. Отбор проб сточных вод

  1. Опустите полипропиленовый стакан объемом 500 мл в резервуар с открытым дренажем или очистными сооружениями (STP) и соберите ~300 мл образца сточных вод.
  2. Перенесите ~250 мл образца в автоклавный полипропиленовый флакон объемом 250 мл.
  3. Закрутите крышку бутылки и заклейте ее полиэтиленовой пленкой. Храните флакон в вертикальном положении в закрытом пакете.
  4. Транспортируйте образец в вертикальном положении в закрытом контейнере при температуре окружающей среды.
  5. Нагрейте образец при температуре 70 °C в духовке с горячим воздухом в течение 4 часов перед обработкой для экстракции ДНК.

2. Экстракция ДНК из образцов сточных вод

  1. После того как проба сточных вод охладится, нанесите на них вихревую нагрузку на максимальную скорость и дайте мусору/илу осесть.
  2. Сцедите 27,5 мл сточных вод в центрифужные пробирки объемом 50 мл и добавьте к ним 13,5 г PEG-8000 (конечная концентрация 30%) и 3 г NaCl (конечная концентрация 1,2 М) и хорошо перемешайте до полного растворения.
  3. Инкубируйте образец в течение ночи (~16-18 ч) при температуре 4 °C.
  4. Центрифугируйте образец при 15 500 x g при 4 °C в течение 30 минут.
  5. Выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PEG-8000 при 30% обладает высокой вязкостью, и гранула может сместиться при выбросе надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость следует сцеживать медленно и осторожно, чтобы не потерять гранулы. Шаги с 2.6 по 2.23 выполняются с использованием набора для экстракции ДНК почвы в соответствии с инструкциями к набору с некоторыми изменениями.
  6. Растворите гранулу в 800 μл раствора для лизиса из набора и добавьте раствор в смешанную циркониевую пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При переработке больших объемов объединяйте гранулы из желаемого количества пробирок. Например, если обрабатывается 160 мл пробы; будет четыре трубки объемом 50 мл со сточными водами с ПЭГ и NaCl. После центрифугирования всех четырех пробирок при 15 500 x g при 4 °C в течение 30 мин удалите надосадочную жидкость из всех четырех пробирок. Добавьте 200 μL раствора CD1 в каждую, повторно суспендируйте гранулы и объедините их в одну трубку.
  7. Закрепите трубку с шариком горизонтально на вихре. Вихревая трубка на максимальной скорости в течение 20-30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное вихревое производство обеспечивает полный лизис и гомогенизацию образцов, что повышает выход ДНК.
  8. Отжимайте пробирки при давлении 8 000 x g в течение 15 с, чтобы шарики осели на дне, удалите пену и полностью перенесите надосадочную жидкость из пробирки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Некоторые бусины также могут быть перенесены во время этого шага.
  9. Центрифугируйте надосадочную жидкость при давлении 15 000 x g в течение 1 мин.
  10. Перенесите надосадочную жидкость в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Надосадочная жидкость может содержать некоторые взвешенные частицы.
  11. Добавьте 200 мкл раствора осадителя и завихрите на максимальной скорости в течение 5 с. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 5 минут.
    Примечание: Инкубация при 4 °C повышает эффективность осаждения белков и клеточного мусора, в то время как ДНК остается в растворе. На этом этапе можно приостановить протокол на срок до 2 ч без существенного снижения выхода и качества экстрагированной ДНК.
  12. Центрифуга при 15 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре (RT). Избегайте гранул и переложите прозрачную надосадочную жидкость в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
  13. Добавьте 600 мкл связывающего буфера на 700 мкл надосадочной жидкости и вихря с максимальной скоростью в течение 5 с.
  14. Загрузите 700 мкл лизата в кремнеземную колонку, инкубируйте в течение 2 мин и центрифугируйте при 15 000 x g в течение 1 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация лизата на колонке с кремнеземом усиливает связывание ДНК с колонкой, что приводит к лучшему выходу ДНК.
  15. Откажитесь от проточной трубы и повторяйте шаг 2.14 до тех пор, пока весь лизат не пройдет через спиновую колонку.
  16. Осторожно поместите спиновую колонку в чистую пробирку для сбора объемом 2 мл. Следите за тем, чтобы проточный поток не попадал на вращающуюся колонну.
  17. Добавьте 500 μL промывочного буфера в спин-колонну и центрифугируйте в спин-колонне при давлении 15 000 x g в течение 1 минуты.
  18. Выбросьте проточный поток и верните спиновую колонку в ту же сборную пробирку объемом 2 мл.
  19. Добавьте 500 μL буфера для промывки этанолом в спиновую колонну. Центрифуга при 15 000 x g в течение 1 мин.
  20. Откажитесь от проточной трубки и поместите вращающуюся колонку в новую сборную пробирку объемом 2 мл.
  21. Центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 2 минут, чтобы удалить остатки этанола. Поместите спиновую колонку в новую пробирку объемом 1,5 мл.
  22. Добавьте 100 мкл элюирующего буфера (предварительно нагретого до 55 °C) в центр белой фильтрующей мембраны и инкубируйте в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нагретый элюирующий буфер, наряду с инкубацией на мембране, повышает эффективность элюирования ДНК, особенно высокомолекулярной ДНК.
  23. Центрифуга при 15 000 x g в течение 1 мин. Откажитесь от спин-колонки.
  24. К элюированной ДНК добавить 10 мкл 3 М NaCl (1/10 объема элюата ДНК) и 250 мкл охлажденного абсолютного этанола (2,5 объема элюата ДНК). Переверните для хорошего перемешивания и уменьшите содержимое при 8 000 x g в течение 15 секунд.
  25. Инкубируйте смесь ДНК и этанола при температуре -20 °C в течение не менее 1 часа.
    Примечание: Инкубация смеси ДНК и этанола может быть увеличена до 16 ч без существенного снижения выхода или качества экстрагированной ДНК.
  26. Центрифуга при 19 000 x g при 4 °C в течение 30 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания.
  27. Добавьте в гранулу 500 μл охлажденного 70% этанола.
  28. Центрифуга при 19 000 x g при 4 °C в течение 15 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания.
  29. Переверните и аккуратно постучите по трубке по папиросной бумаге, чтобы удалить остатки этанола капиллярным действием.
  30. Полностью высушите гранулу ДНК, держа трубки открытыми на нагревательном блоке в течение 5-10 минут при температуре 37 °C, пока весь этанол не испарится.
  31. Повторно суспендируйте гранулу ДНК в 30-50 мкл автоклавной воды двойной дистилляции (ddH2O). Выдерживать при 37 °C в течение 5-10 минут.
  32. Вращайте ДНК при 8 000 x g в течение 15 с.
  33. Выберите приложение dsDNA в настройках Нуклеиновые кислоты в спектрофотометре Nanodrop.
    1. Очистите пьедестал безворсовой папиросной бумагой и водой. Используйте ddH2O для заглушения прибора, а затем загрузите 2 мкл образца ДНК на пьедестал.
    2. Измерьте коэффициенты концентрации и поглощения (A260/280 и A260/230), чтобы определить чистоту.
  34. Храните образец ДНК при температуре -20 °C.

3. Осаждение линейной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) для проверки восстановления ДНК в диапазоне молекулярных масс

  1. Используя геномную ДНК из E. coli MG155, амплифицируйте фрагменты генов с помощью ПЦР для получения пула линейных фрагментов из следующих генов: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S рРНК, marR (см. Таблицу 2 для последовательностей праймеров и условий ПЦР).
  2. Очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР и объедините продукты ПЦР вместе.
  3. Разделите объединенные ампликоны на микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с равными объемами и пометьте одну пробирку как «Входная ДНК».
  4. Добавьте ПЭГ и NaCl в соответствии с желаемыми условиями (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) в каждую из пробирок, кроме той, которая помечена как «Входная ДНК», и составьте окончательный объем до 1 мл.
  5. Инкубируйте пробирки в течение ночи (~16-18 часов) при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На остальных этапах до 3.16 «Входная ДНК» хранится в холодильнике без изменений.
  6. Вращайте пробирки в настольной микроцентрифуге в соответствии с желаемой скоростью (15 000 x g или 20 000 x g) в течение 1 часа при 4 °C.
  7. Осторожно удалите 900 мкл надосадочной жидкости со стороны, противоположной грануле, с помощью микропипетки.
  8. Первая промывка этанолом: Добавьте 900 μл охлажденного 70% этанола в гранулу и перемешайте, аккуратно перевернув трубки.
  9. Вращайте трубки с той же скоростью, что и на шаге 3.6 (15 000 x g или 20 000 x g) в течение 30 минут при температуре 4 °C.
  10. Удалите надосадочную жидкость путем сцеживания.
  11. Вторая промывка этанолом: добавьте в гранулу 500 μл охлажденного 70% этанола.
  12. Вращайте трубки с той же скоростью, что и на шаге 3.6 (15 000 x g или 20 000 x g) в течение 30 минут при температуре 4°C. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания.
  13. Переверните и аккуратно постучите по трубке по папиросной бумаге, чтобы удалить остатки этанола капиллярным действием.
  14. Полностью высушите гранулу ДНК, держа трубки открытыми на нагревательном блоке в течение 5-10 минут при температуре 37 °C, пока весь этанол не испарится.
  15. Повторно суспендируйте гранулу в 20 μл автоклавной воды двойной дистилляции.
  16. Измерьте концентрацию ДНК, осажденной различными условиями и «входной ДНК», с помощью нанокапельного спектрофотометра или флуориметра.
  17. Загрузите осажденную ДНК на 1% агарозный гель для визуализации ДНК.

  

Результаты

Разработка протокола высокопродуктивного извлечения ДНК из образцов сточных вод
Модифицированный вариант ранее разработанных протоколов был использован для извлечения высококачественных ДНК и РНК из образцов воды17. Образцы были получены из...

Обсуждение

По данным ВОЗ, УПП является одной из 10 основных угроз здоровью на сегодняшний день, а эпиднадзор за окружающей средой на предмет УПП признан важным инструментом во всем мире. Как упоминалось во введении, всесторонняя запись УПП окружающей среды включает низкомолекулярную, фрагментиров...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы выражаем признательность за финансовую поддержку со стороны Фонда Рокфеллера (Номер гранта Фонда Рокфеллера 2021 HTH 018) в составе команды APSI India (Альянс за инновации в области надзора за патогенами https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Мы также выражаем признательность за финансовую помощь, предоставленную банком Axis Bank для поддержки этого исследования и Школой биологических наук Триведи при Университете Ашоки за оборудование и другую поддержку.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
24-seat microcentrifugeEppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Bench top refrigerated centrifugeEppendorf Centrifuge 5920 REP5948000131
ChemiDoc Imaging SystemBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mLTarsons510051
Molecular Biology Grade Water for PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)ThermofisherQ33238
Qubit Assay TubesThermofisherQ32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad rangeThermo ScientificQ32853 (500 assays)
Sodium ChlorideHiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)Applied Biosystems4484073
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125

Ссылки

  1. Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
  2. Amman, F., et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-COV-2 at national scale. Nat Biotechnol. 40 (12), 1814-1822 (2022).
  3. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  4. The L. Antimicrobial resistance. The L. Antimicrobial resistance: Time to repurpose the global fund. Lancet. 399 (10322), 335 (2022).
  5. Munk, P., et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance. Nat Commun. 13 (1), 7251 (2022).
  6. Parnanen, K. M. M., et al. Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence. Sci Adv. 5 (3), 9124 (2019).
  7. Grenni, P. Antimicrobial resistance in rivers: A review of the genes detected and new challenges. Environ Toxicol Chem. 41 (3), 687-714 (2022).
  8. Siri, Y., Precha, N., Sirikanchana, K., Haramoto, E., Makkaew, P. Antimicrobial resistance in southeast Asian water environments: A systematic review of current evidence and future research directions. Sci Total Environ. 896, 165229 (2023).
  9. Hunter, P. R., Macdonald, A., Carter, R. C. Water supply and health. PLoS Med. 7 (11), e1000361 (2010).
  10. Bain, R., et al. Fecal contamination of drinking-water in low- and middle-income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 11 (5), e1001644 (2014).
  11. Collignon, P., Beggs, J. J., Walsh, T. R., Gandra, S., Laxminarayan, R. Anthropological and socioeconomic factors contributing to global antimicrobial resistance: A univariate and multivariable analysis. Lancet Planet Health. 2 (9), e398-e405 (2018).
  12. Asghar, H., et al. Environmental surveillance for polioviruses in the global polio eradication initiative. J Infect Dis. 210, S294-S303 (2014).
  13. Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Hernandez, F., Zuccato, E., Castiglioni, S. Wastewater-based epidemiology as a novel biomonitoring tool to evaluate human exposure to pollutants. Environ Sci Technol. 52 (18), 10224-10226 (2018).
  14. Choi, P. M., et al. economic correlates of food and chemical consumption measured by wastewater-based epidemiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21864-21873 (2019).
  15. Hemalatha, M., et al. Surveillance of SARS-COV-2 spread using wastewater-based epidemiology: Comprehensive study. Sci Total Environ. 768, 144704 (2021).
  16. Westhaus, S., et al. Detection of sars-cov-2 in raw and treated wastewater in Germany - suitability for COVID-19 surveillance and potential transmission risks. Sci Total Environ. 751, 141750 (2021).
  17. Lamba, S., et al. SARS-COV-2 infection dynamics and genomic surveillance to detect variants in wastewater - a longitudinal study in Bengaluru, India. Lancet Reg Health Southeast Asia. 11, 100151 (2023).
  18. Stockdale, S. R., et al. RNA-seq of untreated wastewater to assess COVID-19 and emerging and endemic viruses for public health surveillance. Lancet Reg Health Southeast Asia. 14, 100205 (2023).
  19. Bengtsson-Palme, J., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs. Environ Int. 178, 108089 (2023).
  20. Bengtsson-Palme, J., Kristiansson, E., Larsson, D. G. J. Environmental factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 42 (1), 053 (2018).
  21. Dunachie, S. J., Day, N. P., Dolecek, C. The challenges of estimating the human global burden of disease of antimicrobial resistant bacteria. Curr Opin Microbiol. 57, 95-101 (2020).
  22. Hughes, D., Andersson, D. I. Evolutionary trajectories to antibiotic resistance. Annu Rev Microbiol. 71, 579-596 (2017).
  23. World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS). World Health Organization. , (2022).
  24. Walia, K., et al. Establishing antimicrobial resistance surveillance & research network in india: Journey so far. Indian J Med Res. 149 (2), 164-179 (2019).
  25. Hart, A., Warren, J., Wilkinson, H., Schmidt, W. Environmental surveillance of antimicrobial resistance (AMR), perspectives from a national environmental regulator in 2023. Euro Surveill. 28 (11), (2023).
  26. Huijbers, P. M. C., Flach, C. F., Larsson, D. G. J. A conceptual framework for the environmental surveillance of antibiotics and antibiotic resistance. Environ Int. 130, 104880 (2019).
  27. Liguori, K., et al. Antimicrobial resistance monitoring of water environments: A framework for standardized methods and quality control. Environ Sci Technol. 56 (13), 9149-9160 (2022).
  28. Hayward, C., Ross, K. E., Brown, M. H., Whiley, H. Water as a source of antimicrobial resistance and healthcare-associated infections. Pathogens. 9 (8), 667 (2020).
  29. Booton, R. D., et al. One health drivers of antibacterial resistance: Quantifying the relative impacts of human, animal and environmental use and transmission. One Health. 12, 100220 (2021).
  30. Sivalingam, P., Pote, J., Prabakar, K. Extracellular DNA (eDNA): Neglected and potential sources of antibiotic resistant genes (ARGs) in the aquatic environments. Pathogens. 9 (11), 874 (2020).
  31. Woegerbauer, M., Bellanger, X., Merlin, C. Cell-free DNA: An underestimated source of antibiotic resistance gene dissemination at the interface between human activities and downstream environments in the context of wastewater reuse. Front Microbiol. 11, 671 (2020).
  32. Kittredge, H. A., Dougherty, K. M., Evans, S. E. Dead but not forgotten: How extracellular DNA, moisture, and space modulate the horizontal transfer of extracellular antibiotic resistance genes in soil. Appl Environ Microbiol. 88 (7), 0228021 (2022).
  33. Lever, M. A., et al. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front Microbiol. 6, 476 (2015).
  34. Lis, J. T., Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2 (3), 383-389 (1975).
  35. He, Z., Zhu, Y., Gu, H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (20), 9175-9183 (2013).
  36. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. Biotechniques. 49 (3), 631-640 (2010).
  37. Arbeli, Z., Fuentes, C. L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples. FEMS Microbiol Lett. 272 (2), 269-275 (2007).
  38. Verma, S. K., Singh, H., Sharma, P. C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 7 (3), 171 (2017).
  39. Narayan, A., Jain, K., Shah, A. R., Madamwar, D. An efficient and cost-effective method for DNA extraction from athalassohaline soil using a newly formulated cell extraction buffer. 3 Biotech. 6 (1), 62 (2016).
  40. Sapula, S. A., Whittall, J. J., Pandopulos, A. J., Gerber, C., Venter, H. An optimized and robust peg precipitation method for detection of sars-cov-2 in wastewater. Sci Total Environ. 785, 147270 (2021).
  41. Calderon-Franco, D., Van Loosdrecht, M. C. M., Abeel, T., Weissbrodt, D. G. Free-floating extracellular DNA: Systematic profiling of mobile genetic elements and antibiotic resistance from wastewater. Water Res. 189, 116592 (2021).
  42. Sangamnere, R., Misra, T., Al Bherwani, H. E. t. A critical review of conventional and emerging wastewater treatment technologies. Sustain Water Resour Manag. 9, 58 (2023).
  43. . Centrifugation at 30,000 x g. in plasmid DNA precipitation allows better recovery rates and shorter centrifugation times. Application note no: 234, Eppendorf Available from: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/157398_Application/Eppendorf_Centrifugation_Application-Note_234_Centrifuge-5430-familiy_Safe-Lock-Tubes_Centrifugation-at-30_000-x-g-plasmid-DNA-precipitation-allows-better-recovery-rates-shorter-centrifug.pdf  (2017)
  44. Atha, D. H., Ingham, K. C. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume. J Biol Chem. 256 (23), 12108-12117 (1981).
  45. Sivalingam, P., et al. Extracellular DNA includes an important fraction of high-risk antibiotic resistance genes in treated wastewaters. Environ Pollut. 323, 121325 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены