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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine einfache Technik zur Bewertung der antimikrobiellen Resistenz in der Umwelt (AMR) vor, indem der Anteil an niedermolekularer extrazellulärer DNA erhöht wird. Eine vorherige Behandlung mit 20%-30% PEG und 1,2 M NaCl ermöglicht den Nachweis sowohl genomischer als auch horizontal übertragener AMR-Gene. Das Protokoll eignet sich für einen kitfreien Prozess mit zusätzlicher Optimierung.

Zusammenfassung

Die Umweltüberwachung gilt als wichtiges Instrument zur Bewertung der öffentlichen Gesundheit in der Zeit nach der Pandemie. Wasser, insbesondere Abwasser, hat sich als die Quelle der Wahl herauskristallisiert, um Proben von Krankheitserregern in der Umwelt zu nehmen. Abwässer aus offenen Abflüssen und kommunalen Wasseraufbereitungsanlagen sind ein Reservoir sowohl für Krankheitserreger als auch für Gene für antimikrobielle Resistenzen (AMR) und kommen häufig mit Menschen in Kontakt. Es gibt zwar viele Methoden, um AMR aus dem Wasser zu verfolgen, aber die Isolierung von qualitativ hochwertiger DNA mit hohen Ausbeuten aus heterogenen Proben bleibt eine Herausforderung. Um dies zu kompensieren, müssen die Probenvolumina oft hoch sein, was zu praktischen Einschränkungen führt. Darüber hinaus ist die Umwelt-DNA häufig fragmentiert, und die Quellen von AMR (Plasmide, Phagen, lineare DNA) bestehen aus niedermolekularer DNA. Dennoch haben sich nur wenige Extraktionsverfahren auf Methoden zur Extraktion von linearer und niedermolekularer DNA mit hoher Ausbeute konzentriert. Hier wird über eine einfache Methode zur linearen DNA-Extraktion mit hoher Ausbeute aus kleinen Abwassermengen unter Verwendung der Fällungseigenschaften von Polyethylenglykol (PEG) berichtet. Diese Studie plädiert dafür, die Gesamt-DNA-Ausbeute von Wasserproben zu erhöhen, die für metagenomische Analysen entnommen wurden, indem der Anteil der linearen DNA angereichert wird. Darüber hinaus überwindet die Verbesserung der niedermolekularen DNA das derzeitige Problem der Unterbeprobung von umweltbedingter AMR aufgrund der Fokussierung auf hochmolekulare und intrazelluläre DNA. Es wird erwartet, dass diese Methode besonders nützlich ist, wenn extrazelluläre DNA vorhanden ist, jedoch in geringen Konzentrationen, z. B. bei Abwässern aus Kläranlagen. Es sollte auch die Umweltprobenahme von AMR-Genfragmenten verbessern, die sich durch horizontalen Gentransfer ausbreiten.

Einleitung

SARS-CoV-2 und seine Folgen unterstrichen die Bedeutung der Umweltüberwachung für die Überwachung und Vorhersage von Ausbrüchen von Infektionskrankheiten 1,2. Während Viruspandemien offensichtlich sind, wird die Zunahme von Antibiotikaresistenzen (AMR) oft als heimtückische Pandemie bezeichnet, die weltweit ein Hauptproblem für die öffentliche Gesundheit darstellt 3,4. Folglich besteht ein dringender Bedarf an koordinierten Strategien, um die Entwicklung und Ausbreitung von AMR zu verstehen. Gewässer sowie Abwasser können sowohl für Krankheitserreger als auch für AMR 5,6,7,8 als Speicher dienen. Gemeinsam genutzte Wasserquellen sind daher eine starke Quelle für die Übertragung von Krankheiten unter Menschen, insbesondere in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMIC), in denen schlechte Hygiene und Überbevölkerung Hand in Hand gehen 9,10,11. Die Untersuchung von Wasserquellen wird seit langem eingesetzt, um die Gesundheit der Bevölkerung zu beurteilen 12,13,14. Kürzlich erwies sich das Abwasser aus städtischen Kläranlagen als guter Indikator für COVID-Fälle in der Klinik 1,2,15,16,17,18.

Im Vergleich zur Überwachung spezifischer Krankheiten stellt die Erkennung und Verfolgung von AMR in der Umwelt ein komplexeres Problem dar. Die große Anzahl der verwendeten Antibiotika, die unterschiedlichen Resistenzgene, der unterschiedliche lokale Selektionsdruck und der horizontale Gentransfer zwischen Bakterien machen es schwierig, die tatsächliche AMR-Belastung zu beurteilen und sie nach der Bewertung mit klinischen Beobachtungen zu korrelieren 19,20,21,22. Während die konzertierte Überwachung klinischer AMR von mehreren Organisationen auf der ganzen Welt durchgeführt wird 3,23,24, steckt die umweltbedingte AMR-Überwachung noch in den Kinderschuhen, wie in 19,25,26 überprüft.

In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur Verfolgung umweltbedingter AMR berichtet 5,27, die in28,29 überprüft wurden. Ausgangspunkt der meisten davon ist die Extraktion von DNA guter Qualität aus heterogenen Umweltproben, was an sich schon eine Herausforderung darstellt. Darüber hinaus ist die DNA der Umwelt in der Regel fragmentiert, da sie einer feindlichen Umgebung ausgesetzt ist. Fragmentierte extrazelluläre DNA ist seit langem als wichtiges Reservoir für AMR-Gene anerkannt (überprüft in30, 31, 32), mit dem zusätzlichen Potenzial, Bakterien über horizontalen Gentransfer zu betreten und zu verlassen. Daher ist es wichtig, dass jedes Protokoll, das darauf abzielt, die AMR-Belastung in der Umwelt zu messen, so gut wie möglich lineare und niedermolekulare DNA beprobt. Überraschenderweise wurde wenig Wert auf die Entwicklung von Methoden gelegt, die speziell für die Extraktion von linearer und niedermolekularer DNA mit hoher Ausbeute spezifisch sind: Diese Arbeit konzentriert sich darauf, diese Lücke zu schließen.

Eine gängige und einfache Methode zur Ausfällung von DNA ist die Kombination von Polyethylenglykol (PEG) und Salzen wie Natriumchlorid (NaCl)33. PEG ist ein makromolekulares Crowding-Agenzmittel, das verwendet wird, um eine größenspezifische Präzipitation von DNA-Fragmentenzu erreichen 34,35. Je niedriger die PEG-Konzentration, desto höher ist das Molekulargewicht der DNA, die effizient ausgefällt werden kann. In vielen Studien wurde PEG bei der Extraktion von DNA und RNA 1,2 in der Umwelt (zusammengefasst in Tabelle 1 17,33,36,37,38,39) entweder im letzten Schritt 33,36,37 oder zur Konzentration großer Wasserproben zur Extraktion von Viruspartikeln wie bei SARS-CoV-2 verwendet 15,40. In der aktuellen Arbeit wurde festgestellt, dass die PEG-Konzentrationen, die zuvor für DNA-Extraktionen in der Umwelt verwendet wurden (weitgehend durch virale Überwachungsprotokolle bestimmt), keine lineare DNA mit niedrigem Molekulargewicht erfassen. Daher haben sie Nachsehen bei der Probenahme kurzer DNA-Fragmente und sind ungeeignet, um den AMR-Gehalt genau zu bestimmen. In dieser Studie wurden die Eigenschaften von Polyethylenglykol und Natriumchlorid genutzt, um lineare DNA-Fragmente mit niedrigem Molekulargewicht effektiv und mit hoher Ausbeute auszufällen, was in Zukunft zu einer kostengünstigen DNA-Extraktionsmethode führen kann. Diese Methode kann verwendet werden, um den Anteil an fragmentierter und niedermolekularer DNA aus komplexen natürlichen Proben anzureichern und so ein genaueres Bild der AMR in der Umwelt zu erhalten. Mit ein wenig weiterer Verfeinerung eignet sich die Technik für eine einfache und kostengünstige Anwendung durch lokale kommunale Unternehmen und andere Regierungsbehörden, um sie mit minimaler technischer Schulung als Überwachungsinstrument zu verwenden.

Protokoll

1. Probenahme von Abwasser

  1. Tauchen Sie ein 500-ml-Polypropylen-Becherglas in den offenen Abfluss oder das Reservoir der Kläranlage (STP) und sammeln Sie ~300 mL Abwasserprobe.
  2. Übertragen Sie ~250 mL der Probe in eine 250 mL Flasche aus autoklaviertem Polypropylen.
  3. Schrauben Sie den Deckel der Flasche auf und verschließen Sie ihn mit einer Plastikfolie. Bewahren Sie die Flasche aufrecht in einem geschlossenen Beutel auf.
  4. Transportieren Sie die Probe aufrecht in einem geschlossenen Behälter bei Umgebungstemperatur.
  5. Die Probe wird 4 h lang bei 70 °C in einem Heißluftofen hitzeinaktiviert, bevor sie für die DNA-Extraktion verarbeitet wird.

2. DNA-Extraktion aus Abwasserproben

  1. Sobald die Abwasserprobe abgekühlt ist, wirbeln Sie die Proben mit maximaler Geschwindigkeit und lassen Sie den Schmutz/Schlamm absetzen.
  2. 27,5 mL des Abwassers in 50 mL Zentrifugenröhrchen umfüllen und 13,5 g PEG-8000 (Endkonzentration 30%) und 3 g NaCl (Endkonzentration 1,2 M) dazugeben und gut mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
  3. Inkubieren Sie die Probe über Nacht (~16-18 h) bei 4 °C.
  4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 15.500 x g bei 4 °C für 30 min.
  5. Entsorgen Sie den Überstand.
    HINWEIS: PEG-8000 mit 30 % ist hochviskos und das Pellet kann sich lösen, wenn der Überstand weggeworfen wird. Der Überstand sollte langsam und vorsichtig dekantiert werden, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht verloren geht. Die Schritte 2.6 bis 2.23 werden mit dem Boden-DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Kits mit einigen Änderungen durchgeführt.
  6. Lösen Sie das Pellet in 800 μl der Lyselösung des Kits auf und geben Sie die Lösung in das gemischte Zirkoniumperlenröhrchen.
    HINWEIS: Wenn Sie größere Mengen verarbeiten, sammeln Sie die Pellets aus der gewünschten Anzahl von Röhrchen. Zum Beispiel, wenn 160 ml Probe verarbeitet werden; Es wird vier 50-ml-Röhrchen geben, die Abwasser mit PEG und NaCl enthalten. Nach Zentrifugation aller vier Röhrchen bei 15.500 x g bei 4 °C für 30 min ist der Überstand aus allen vier Röhrchen zu entsorgen. Fügen Sie jeweils 200 μl CD1-Lösung hinzu, suspendieren Sie die Pellets erneut und vereinen Sie sie in einem Bead-Röhrchen.
  7. Befestigen Sie das Perlenrohr waagerecht auf einem Wirbel. Wirbeln Sie das Rohr bei maximaler Geschwindigkeit für 20-30 min.
    HINWEIS: Längeres Vortexen gewährleistet eine vollständige Lyse und Homogenisierung der Proben, was die DNA-Ausbeute verbessert.
  8. Drehen Sie die Röhrchen 15 s lang bei 8.000 x g herunter, um die Kügelchen am Boden abzusetzen, Schaumbildung zu entfernen und den Überstand vollständig aus dem Röhrchen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Einige Perlen können während dieses Schritts auch übertragen werden.
  9. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 15.000 x g für 1 min.
  10. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Der Überstand kann noch einige Schwebeteilchen enthalten.
  11. 200 μl Fällungslösung zugeben und 5 s lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. Bei 4 °C 5 min inkubieren.
    HINWEIS: Die Inkubation bei 4 °C erhöht die Effizienz der Ausfällung von Proteinen und Zelltrümmern, während die DNA in Lösung bleibt. Es ist möglich, das Protokoll in diesem Schritt für bis zu 2 Stunden zu pausieren, ohne dass die Ausbeute und Qualität der extrahierten DNA signifikant beeinträchtigt wird.
  12. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur (RT). Vermeiden Sie das Pellet und geben Sie den klaren Überstand in ein sauberes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  13. 600 μl Bindungspuffer pro 700 μl Überstand zugeben und 5 s lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexen.
  14. Laden Sie 700 μl des Lysats auf eine Siliziumdioxid-Spin-Säule, inkubieren Sie 2 Minuten lang und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 15.000 x g .
    HINWEIS: Die Inkubation von Lysat auf einer Kieselsäuresäule verbessert die Bindung der DNA an die Säule, was zu einer besseren DNA-Ausbeute führt.
  15. Der Durchfluss wird verworfen und Schritt 2.14 wiederholt, bis das gesamte Lysat die Spinsäule durchlaufen hat.
  16. Setzen Sie die Spin-Säule vorsichtig in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen ein. Stellen Sie sicher, dass kein Durchfluss auf die Schleudersäule spritzt.
  17. Geben Sie 500 μl Waschpuffer in die Schleudersäule und zentrifugieren Sie die Schleudersäule bei 15.000 x g für 1 min.
  18. Entsorgen Sie den Durchfluss und geben Sie die Spin-Säule wieder in dasselbe 2-ml-Sammelröhrchen zurück.
  19. Geben Sie 500 μl Ethanol-Waschpuffer in die Schleudersäule. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 min.
  20. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen ein.
  21. Zentrifugieren Sie 2 min lang bei 16.000 x g , um Ethanolreste zu entfernen. Setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen ein.
  22. 100 μl Elutionspuffer (auf 55 °C vorgeheizt) in die Mitte der weißen Filtermembran geben und 5 Minuten inkubieren.
    HINWEIS: Beheizter Elutionspuffer erhöht zusammen mit der Inkubation auf der Membran die Effizienz der DNA-Elution, insbesondere bei hochmolekularer DNA.
  23. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 min. Verwerfen Sie die Spin-Spalte.
  24. Zu der eluierten DNA werden 10 μl 3 M NaCl (1/10 Volumen DNA-Eluat) und 250 μl gekühltes absolutes Ethanol (2,5 Volumenkörper DNA-Eluat) hinzugefügt. Zum guten Vermischen invertieren und den Inhalt 15 s lang bei 8.000 x g herunterschleudern.
  25. Das DNA-Ethanol-Gemisch wird mindestens 1 h lang bei -20 °C inkubiert.
    HINWEIS: Die Inkubation des DNA-Ethanol-Gemisches kann auf 16 Stunden erhöht werden, ohne dass die Ausbeute oder Qualität der extrahierten DNA signifikant abnimmt.
  26. Zentrifugieren bei 19.000 x g bei 4 °C für 30 min. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen.
  27. Geben Sie 500 μl gekühltes 70%iges Ethanol in das Pellet.
  28. Zentrifugieren bei 19.000 x g bei 4 °C für 15 min. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen.
  29. Drehen Sie die Tube um und klopfen Sie vorsichtig auf Seidenpapier, um Ethanolreste durch Kapillarwirkung zu entfernen.
  30. Trocknen Sie das DNA-Pellet vollständig, indem Sie die Röhrchen 5-10 Minuten lang bei 37 °C auf einem Heizblock offen halten, bis das gesamte Ethanol verdampft ist.
  31. Das DNA-Pellet wird in 30-50 μl autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) erneut suspendiert. Bei 37 °C 5-10 min inkubieren.
  32. Schleudern Sie die DNA bei 8.000 x g für 15 s herunter.
  33. Wählen Sie die dsDNA-Anwendung unter den Nukleinsäuren-Einstellungen in einem Nanodrop-Spektralphotometer aus.
    1. Reinigen Sie den Sockel mit fusselfreiem Seidenpapier und Wasser. Verwenden Sie ddH2O, um das Instrument zu verblinden, und laden Sie dann 2 μl der DNA-Probe auf den Sockel.
    2. Messen Sie die Konzentration und das Absorptionsverhältnis (A260/280 und A260/230), um die Reinheit zu bestimmen.
  34. Lagern Sie die DNA-Probe bei -20 °C.

3. Präzipitation von Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-amplifizierter linearer DNA zur Überprüfung der DNA-Rückgewinnung über einen Bereich von Molekulargewichten

  1. Unter Verwendung genomischer DNA von E. coli MG155 amplifizieren Sie Genfragmente durch PCR, um einen Pool linearer Fragmente aus den folgenden Genen zu erzeugen: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (siehe Tabelle 2 für Primersequenzen und PCR-Bedingungen).
  2. Aufreinigung der PCR-Produkte mit dem PCR-Aufreinigungskit und Bündelung der PCR-Produkte miteinander.
  3. Teilen Sie die gepoolten Amplikons in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit gleichem Volumen auf und beschriften Sie ein Röhrchen mit "Eingabe-DNA".
  4. Geben Sie PEG und NaCl gemäß den gewünschten Bedingungen (9 %, 20 %, 30 % PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) in jedes der Röhrchen mit Ausnahme des mit "Input DNA" gekennzeichneten Röhrchens und füllen Sie das endgültige Volumen auf 1 ml.
  5. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht (~16-18 h) bei 4 °C.
    HINWEIS: Für den Rest der Schritte bis 3.16 wird 'Input DNA' unverändert im Kühlschrank aufbewahrt.
  6. Die Röhrchen werden in einer Tisch-Mikrozentrifuge entsprechend der gewünschten Geschwindigkeit (15.000 x g oder 20.000 x g) 1 h bei 4 °C gedreht.
  7. Entfernen Sie vorsichtig 900 μl des Überstands von der dem Pellet gegenüberliegenden Seite mit einer Mikropipette.
  8. Erste Ethanolwäsche: Geben Sie 900 μl gekühltes 70%iges Ethanol in das Pellet und mischen Sie, indem Sie die Röhrchen vorsichtig umdrehen.
  9. Die Röhrchen mit der gleichen Geschwindigkeit wie in Schritt 3.6 (15.000 x g oder 20.000 x g) für 30 min bei 4 °C drehen.
  10. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren.
  11. Zweite Ethanolwäsche: Geben Sie 500 μl gekühltes 70%iges Ethanol in das Pellet.
  12. Die Röhrchen mit der gleichen Geschwindigkeit wie in Schritt 3.6 (15.000 x g oder 20.000 x g) für 30 min bei 4°C drehen. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen.
  13. Drehen Sie die Tube um und klopfen Sie vorsichtig auf Seidenpapier, um Ethanolreste durch Kapillarwirkung zu entfernen.
  14. Trocknen Sie das DNA-Pellet vollständig, indem Sie die Röhrchen 5-10 Minuten lang bei 37 °C auf einem Heizblock offen halten, bis das gesamte Ethanol verdampft ist.
  15. Das Pellet wird in 20 μl autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser wieder suspendiert.
  16. Messen Sie die Konzentration der DNA, die unter den verschiedenen Bedingungen ausgefällt wird, und die "Eingangs-DNA" mit einem Nanodrop-Spektralphotometer oder Fluorometer.
  17. Laden Sie die gefällte DNA auf ein 1%iges Agarosegel zur DNA-Visualisierung.

  

Ergebnisse

Etablierung eines Protokolls für die Extraktion von DNA aus Abwasserproben mit hoher Ausbeute
Für die Extraktion von hochwertiger DNA und RNA aus Wasserproben wurde eine modifizierte Version von zuvor etablierten Protokollen verwendet17. Die Proben stammten aus offenen Abflüssen sowie aus Kläranlagen in der Region Delhi-NCR in Nordindien. Nach der Vorverarbeitung mit PEG und NaCl (Abbildung 1) wurden die Proben ...

Diskussion

AMR ist heute eine der 10 größten Gesundheitsbedrohungen, wie von der WHO aufgeführt, und die Umweltüberwachung für AMR ist weltweit als wichtiges Instrument anerkannt. Wie in der Einleitung erwähnt, umfasst eine umfassende Aufzeichnung von umweltbedingter AMR niedermolekulare, fragmentierte und extrazelluläre DNA. Das hier beschriebene Vorverarbeitungsprotokoll mit einer hohen Konzentration von PEG in Kombination mit Salz (30 % PEG und 1,2 M NaCl) erreicht dieses Ergebnis, indem es den Anteil an niedermolekularer...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die Rockefeller Foundation (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) als Teil des APSI India Teams (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Wir danken auch der finanziellen Unterstützung durch die Axis Bank zur Unterstützung dieser Forschung und der Trivedi School of Biosciences an der Ashoka University für Ausrüstung und andere Unterstützung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
24-seat microcentrifugeEppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Bench top refrigerated centrifugeEppendorf Centrifuge 5920 REP5948000131
ChemiDoc Imaging SystemBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mLTarsons510051
Molecular Biology Grade Water for PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)ThermofisherQ33238
Qubit Assay TubesThermofisherQ32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad rangeThermo ScientificQ32853 (500 assays)
Sodium ChlorideHiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)Applied Biosystems4484073
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125

Referenzen

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