항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화

요약

여기에서는 저분자량 세포외 DNA의 비율을 향상시켜 환경적 항생제 내성(AMR)을 평가하는 간단한 기술을 제시합니다. 20%-30% PEG 및 1.2M NaCl로 사전 처리하면 게놈 및 수평 전달 AMR 유전자를 모두 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 최적화를 통해 키트가 없는 프로세스에 적합합니다.

초록

환경 감시는 포스트 팬데믹 시대에 공중 보건을 평가하는 중요한 도구로 인식되고 있습니다. 물, 특히 폐수는 환경에서 병원균 부담을 샘플링하기 위한 선택의 원천으로 부상했습니다. 개방형 배수구 및 지역사회 수처리 시설의 폐수는 병원균과 항생제 내성(AMR) 유전자의 저장소이며 인간과 자주 접촉합니다. 물에서 AMR을 추적하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 이질적인 샘플에서 높은 수율로 우수한 품질의 DNA를 분리하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이를 보상하기 위해 시료 부피가 커야 하는 경우가 많아 실질적인 제약이 발생합니다. 또한 환경 DNA는 자주 단편화되며 AMR(플라스미드, 파지, 선형 DNA)의 소스는 저분자량 DNA로 구성됩니다. 그러나 선형 및 저분자량 DNA의 고수율 추출 방법에 초점을 맞춘 추출 공정은 거의 없습니다. 여기에서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 침전 특성을 사용하여 소량의 폐수에서 고수율 선형 DNA를 추출하는 간단한 방법이 보고됩니다. 이 연구는 선형 DNA의 비율을 풍부하게 함으로써 메타게놈 분석을 위해 수집된 물 샘플의 전체 DNA 수율을 증가시키는 사례를 만듭니다. 또한 저분자량 DNA를 강화하면 고분자량 및 세포 내 DNA에 중점을 두어 환경 AMR을 과소 샘플링하는 현재의 문제를 극복할 수 있습니다. 이 방법은 세포외 DNA가 존재하지만 처리장에서 배출되는 폐수와 같이 농도가 낮을 때 특히 유용할 것으로 예상됩니다. 또한 수평적 유전자 전달을 통해 확산되는 AMR 유전자 절편의 환경 샘플링을 강화해야 합니다.

서문

SARS-CoV-2와 그 여파는 전염병 발병을 모니터링하고 예측하는 데 있어 환경 감시의 중요성을 강조했습니다 ^1,2. 바이러스 팬데믹이 명백하지만, 항생제 내성(AMR)의 증가는 종종 은밀한 팬데믹으로 묘사되며 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제를 구성합니다 ^3,4. 따라서 항생제 내성(AMR)의 진화와 확산을 이해하기 위한 조율된 전략이 시급히 필요합니다. 폐수뿐만 아니라 수역은 병원균과 AMR ^5,6,7,8 모두의 저장소 역할을 할 수 있습니다. 따라서 공유된 수원은 인간들 사이에서 질병을 전염시키는 강력한 원인이며, 특히 열악한 위생 상태와 인구 과잉이 밀접한 관련이 있는 저소득 및 중간소득 국가(LMIC)에서는 더욱 그러하다 ^9,10,11

프로토콜

1. 폐수 샘플링

1. 500mL 폴리프로필렌 비커를 개방형 배수 또는 하수 처리장(STP) 저장소에 담그고 ~300mL의 폐수 샘플을 수집합니다.
2. ~250mL의 샘플을 250mL 오토클레이브 폴리프로필렌 병에 옮깁니다.
3. 병의 뚜껑을 조이고 플라스틱 필름으로 밀봉하십시오. 병을 밀폐된 가방에 똑바로 세워 보관하십시오.
4. 상온에서 밀폐된 용기에 샘플을 똑바로 세워 운반합니다.
5. DNA 추출을 위해 처리하기 전에 70°C의 열풍 오븐에서 4시간 동안 샘플을 가열 비활성화합니다.

2. 폐수 샘플에서 DNA 추출

1. 폐수 샘플이 냉각되면 샘플을 최대 속도로 소용돌이치고 파편/슬러지가 가라앉도록 합니다.
2. 50mL 원심분리기 튜브에 폐수 27.5mL를 디캔팅하고 PEG-8000 13.5g(최종 농도 30%)과 NaCl 3g(최종 농도 1.2M)을 넣고 완전히 녹을 때까지 잘 섞는다.
3. 4 °C에서 하룻밤 동안(~16-18시간) 샘플을 배양합니다.
4. 4°C에서 15,500 x g 으로 30분 동안 샘플을 원심분리합니다.

결과

폐수 샘플에서 DNA의 고수율 추출을 위한 프로토콜 수립
물 샘플로부터 고품질 DNA 및 RNA를 추출하기 위해 이전에 확립된 프로토콜의 수정된 버전이 사용되었다¹⁷. 샘플은 인도 북부의 델리-NCR 지역에 있는 개방형 배수구와 하수 처리장에서 공급받았습니다. PEG 및 NaCl(그림 1)을 사용하여 전처리 한 후 토양 및 물에서 DNA.......

토론

항생제 내성은 WHO가 선정한 10대 건강 위협 중 하나이며, 항생제 내성에 대한 환경 감시는 전 세계적으로 중요한 도구로 인식되고 있습니다. 서론에서 언급했듯이 환경 AMR의 포괄적인 기록에는 저분자량, 단편화 및 세포외 DNA가 포함됩니다. 염(30% PEG 및 1.2M NaCl)과 결합된 고농도의 PEG를 사용하여 여기에 보고된 전처리 프로토콜은 고분자량 분획(주로 게놈 및 플라스미드 DNA)의 추출에 영향을 주지 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-seat microcentrifuge	Eppendorf Centrifuge 5425 R	EP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)	Supelco	100983-0511
Agarose	Invitrogen	16500500
Bench top refrigerated centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5920 R	EP5948000131
ChemiDoc Imaging System	BioRad	12003153
DNeasy PowerSoil Pro Kit	Qiagen	47014
DNeasy PowerWater Pro Kit	Qiagen	14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)	Thermo Fisher	R0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer*	Thermofscientific	EP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder	Invitrogen	10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mL	Tarsons	510051
Molecular Biology Grade Water for PCR	HiMedia	ML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	13400519
Parafilm	Bemis	S37440
PEG-8000	SRL	54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit	Qiagen	28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)	Thermofisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermofisher	Q32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad range	Thermo Scientific	Q32853 (500 assays)
Sodium Chloride	HiMedia	TC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)	Applied Biosystems	4484073
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1125