항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화

요약

여기에서는 저분자량 세포외 DNA의 비율을 향상시켜 환경적 항생제 내성(AMR)을 평가하는 간단한 기술을 제시합니다. 20%-30% PEG 및 1.2M NaCl로 사전 처리하면 게놈 및 수평 전달 AMR 유전자를 모두 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 최적화를 통해 키트가 없는 프로세스에 적합합니다.

초록

환경 감시는 포스트 팬데믹 시대에 공중 보건을 평가하는 중요한 도구로 인식되고 있습니다. 물, 특히 폐수는 환경에서 병원균 부담을 샘플링하기 위한 선택의 원천으로 부상했습니다. 개방형 배수구 및 지역사회 수처리 시설의 폐수는 병원균과 항생제 내성(AMR) 유전자의 저장소이며 인간과 자주 접촉합니다. 물에서 AMR을 추적하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 이질적인 샘플에서 높은 수율로 우수한 품질의 DNA를 분리하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이를 보상하기 위해 시료 부피가 커야 하는 경우가 많아 실질적인 제약이 발생합니다. 또한 환경 DNA는 자주 단편화되며 AMR(플라스미드, 파지, 선형 DNA)의 소스는 저분자량 DNA로 구성됩니다. 그러나 선형 및 저분자량 DNA의 고수율 추출 방법에 초점을 맞춘 추출 공정은 거의 없습니다. 여기에서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 침전 특성을 사용하여 소량의 폐수에서 고수율 선형 DNA를 추출하는 간단한 방법이 보고됩니다. 이 연구는 선형 DNA의 비율을 풍부하게 함으로써 메타게놈 분석을 위해 수집된 물 샘플의 전체 DNA 수율을 증가시키는 사례를 만듭니다. 또한 저분자량 DNA를 강화하면 고분자량 및 세포 내 DNA에 중점을 두어 환경 AMR을 과소 샘플링하는 현재의 문제를 극복할 수 있습니다. 이 방법은 세포외 DNA가 존재하지만 처리장에서 배출되는 폐수와 같이 농도가 낮을 때 특히 유용할 것으로 예상됩니다. 또한 수평적 유전자 전달을 통해 확산되는 AMR 유전자 절편의 환경 샘플링을 강화해야 합니다.

서문

SARS-CoV-2와 그 여파는 전염병 발병을 모니터링하고 예측하는 데 있어 환경 감시의 중요성을 강조했습니다 ^1,2. 바이러스 팬데믹이 명백하지만, 항생제 내성(AMR)의 증가는 종종 은밀한 팬데믹으로 묘사되며 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제를 구성합니다 ^3,4. 따라서 항생제 내성(AMR)의 진화와 확산을 이해하기 위한 조율된 전략이 시급히 필요합니다. 폐수뿐만 아니라 수역은 병원균과 AMR ^5,6,7,8 모두의 저장소 역할을 할 수 있습니다. 따라서 공유된 수원은 인간들 사이에서 질병을 전염시키는 강력한 원인이며, 특히 열악한 위생 상태와 인구 과잉이 밀접한 관련이 있는 저소득 및 중간소득 국가(LMIC)에서는 더욱 그러하다 ^9,10,11. 수원 검사는 지역 사회 건강을 평가하기 위해 오랫동안 사용되어 왔습니다 12,13,14. 최근 도시 하수 처리장에서 나오는 폐수는 클리닉 ^{1,2,15,16,17,18}에서 코로나 사례의 좋은 사전 지표임이 입증되었습니다.

특정 질병을 모니터링하는 것과 비교했을 때, 환경에서 AMR을 감지하고 추적하는 것은 더 복잡한 문제를 제기합니다. 사용 중인 항생제의 수가 많고, 다양한 내성 유전자, 다양한 국소 선택 압력, 박테리아 간의 수평적 유전자 전달로 인해 실제 AMR 부담을 평가하기 어렵고, 일단 평가한 후에는 임상 관찰과 연관시키기가 어렵다 19,20,21,22. 그 결과, 임상 AMR에 대한 공동 감시는 전 세계 여러 기관에서 수행되고 있지만(^3,23,24), 환경 AMR 모니터링은 아직 초기 단계에 있으며,^이는 19,25,26에서 검토되었습니다.

최근 몇 년 동안 환경 AMR을 추적하는 다양한 방법이 ^{5,27에서 보고되었으며 28,29}에서 검토되었습니다. 이들 중 대부분의 시작점은 이질적인 환경 샘플에서 양질의 DNA를 추출하는 것인데, 이는 그 자체로 도전입니다. 또한 환경 DNA는 일반적으로 적대적인 환경에 노출되어 단편화됩니다. 단편화된 세포외 DNA는 오랫동안 AMR 유전자의 중요한 저장소로 인식되어 왔으며(^30,31,32에서 검토됨), 수평 유전자 전달을 통해 박테리아에 들어오고 나갈 수 있는 추가 잠재력이 있습니다. 따라서 환경에서 AMR 부담을 측정하는 것을 목표로 하는 모든 프로토콜은 선형 및 저분자량 DNA를 가능한 한 잘 샘플링해야 합니다. 놀랍게도, 선형 및 저분자량 DNA의 고수율 추출에 특화된 방법 개발에 대한 초점은 거의 없었습니다: 이 연구는 격차를 해결하는 데 중점을 둡니다.

DNA를 침전시키는 일반적이고 간단한 방법은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 염화나트륨(NaCl)과 같은 염을 결합하는 것입니다.³³. PEG는 DNA 단편^34,35의 크기 특정 침전을 달성하는 데 사용되는 고분자 군집 제입니다. PEG 농도가 낮을수록 효율적으로 침전될 수 있는 DNA의 분자량이 높아집니다. 많은 연구에서 DNA 및 RNA ^1,2(표 1 17,33,36,37,38,39에 요약)의 환경 추출 중에 PEG를 사용하여 최종 단계 33,36,37에서 또는 SARS-CoV-2 ^15,40과 같이 바이러스 입자 추출을 위해 대규모 물 샘플을 농축했습니다. 현재 연구에서는 이전에 환경 DNA 추출에 사용된 PEG 농도(주로 바이러스 감시 프로토콜에 의해 결정됨)가 저분자량 선형 DNA를 캡처하지 않는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 짧은 DNA 단편을 샘플링할 수 없으며 AMR 함량을 정확하게 평가하는 데 적합하지 않습니다. 이 연구는 폴리에틸렌 글리콜과 염화나트륨의 특성을 활용하여 저분자량 선형 DNA 단편을 높은 수율로 효과적으로 침전시켜 향후 비용 효율적인 DNA 추출 방법으로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 자연 샘플에서 단편화된 저분자량 DNA의 비율을 강화하는 데 사용할 수 있으므로 환경 AMR에 대한 보다 정확한 그림을 캡처할 수 있습니다. 조금만 더 정교하게 다듬으면 이 기술은 지방 자치 단체 및 기타 정부 기관에서 최소한의 기술 교육으로 감시 도구로 사용할 수 있는 쉽고 저렴한 응용 프로그램에 적합합니다.

프로토콜

1. 폐수 샘플링

1. 500mL 폴리프로필렌 비커를 개방형 배수 또는 하수 처리장(STP) 저장소에 담그고 ~300mL의 폐수 샘플을 수집합니다.
2. ~250mL의 샘플을 250mL 오토클레이브 폴리프로필렌 병에 옮깁니다.
3. 병의 뚜껑을 조이고 플라스틱 필름으로 밀봉하십시오. 병을 밀폐된 가방에 똑바로 세워 보관하십시오.
4. 상온에서 밀폐된 용기에 샘플을 똑바로 세워 운반합니다.
5. DNA 추출을 위해 처리하기 전에 70°C의 열풍 오븐에서 4시간 동안 샘플을 가열 비활성화합니다.

2. 폐수 샘플에서 DNA 추출

1. 폐수 샘플이 냉각되면 샘플을 최대 속도로 소용돌이치고 파편/슬러지가 가라앉도록 합니다.
2. 50mL 원심분리기 튜브에 폐수 27.5mL를 디캔팅하고 PEG-8000 13.5g(최종 농도 30%)과 NaCl 3g(최종 농도 1.2M)을 넣고 완전히 녹을 때까지 잘 섞는다.
3. 4 °C에서 하룻밤 동안(~16-18시간) 샘플을 배양합니다.
4. 4°C에서 15,500 x g 으로 30분 동안 샘플을 원심분리합니다.
5. 상층액을 버립니다.
   알림: 30%의 PEG-8000은 점성이 높으며 상층액을 버리는 동안 펠릿이 빠질 수 있습니다. 상층액은 펠릿이 손실되지 않도록 천천히 조심스럽게 디캔팅해야 합니다. 2.6 - 2.23 단계는 키트 지침에 따라 토양 DNA 추출 키트를 사용하여 약간의 수정을 가하여 수행합니다.
6. 펠릿을 키트의 용해 용액 800μL에 용해시키고 용액을 혼합된 지르코늄 비드 튜브에 추가합니다.
   알림: 더 많은 양을 처리하는 경우 원하는 수의 튜브에서 펠릿을 합동하십시오. 예를 들어, 160mL의 시료를 처리하는 경우; PEG 및 NaCl이 있는 폐수를 포함하는 4개의 50mL 튜브가 있습니다. 4°C에서 15,500 x g 으로 30분 동안 4개의 튜브를 모두 원심분리한 후 4개의 튜브 모두에서 상층액을 버립니다. 각각에 200μL의 CD1 용액을 첨가하고 펠릿을 다시 현탁시킨 다음 하나의 비드 튜브에 함께 합칩니다.
7. 비드 튜브를 소용돌이에 수평으로 고정합니다. 20-30분 동안 최대 속도로 튜브를 소용돌이칩니다.
   참고: 장기간의 소용돌이는 샘플의 완전한 용해 및 균질화를 보장하여 DNA 수율을 향상시킵니다.
8. 8,000 x g 에서 15초 동안 튜브를 회전시켜 바닥에 비드를 가라앉히고 거품을 제거한 다음 튜브에서 상층액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 완전히 옮깁니다. 일부 비드는 이 단계에서 옮겨질 수도 있습니다.
9. 상층액을 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
10. 상층액을 깨끗한 2mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 상층액에는 여전히 일부 부유 입자가 포함될 수 있습니다.
11. 200μL의 침전제 용액과 와류를 5초 동안 최대 속도로 추가합니다. 4 °C에서 5 분 동안 배양합니다.
    참고: 4°C에서 배양하면 DNA가 용액에 남아 있는 동안 단백질과 세포 파편의 침전 효율이 증가합니다. 추출된 DNA의 수율과 품질을 크게 저하시키지 않고 이 단계에서 프로토콜을 최대 2시간 동안 일시 중지할 수 있습니다.
12. 15,000 x g 에서 실온(RT)에서 1분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 피하고 투명한 상층액을 깨끗한 2mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
13. 상층액 700μL당 600μL의 결합 완충액을 추가하고 5초 동안 최대 속도로 와류를 추가합니다.
14. 700μL의 용해물을 실리카 스핀 컬럼에 로드하고 2분 동안 배양한 다음 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    참고: 실리카 컬럼에서 용해물을 배양하면 DNA와 컬럼의 결합이 향상되어 DNA 수율이 향상됩니다.
15. 플로우 스루를 버리고 모든 용해물이 스핀 컬럼을 통과할 때까지 2.14단계를 반복합니다.
16. 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 조심스럽게 넣습니다. 스핀 컬럼에 플로우스루가 튀지 않도록 하십시오.
17. 스핀 컬럼에 500μL의 세척 버퍼를 추가하고 스핀 컬럼을 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
18. 플로우 스루(flow-through)를 폐기하고 스핀 컬럼을 동일한 2mL 수집 튜브에 다시 넣습니다.
19. 스핀 컬럼에 500μL의 에탄올 세척 완충액을 추가합니다. 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기
20. 플로우 스루(flow-through)를 버리고 스핀 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣습니다.
21. 16,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 스핀 컬럼을 새 1.5mL 튜브에 넣습니다.
22. 100μL의 용출 완충액(55°C로 예열)을 흰색 필터 멤브레인 중앙에 추가하고 5분 동안 배양합니다.
    참고: 가열된 용출 완충액은 멤브레인에서의 배양과 함께 DNA, 특히 고분자량 DNA의 용출 효율을 높입니다.
23. 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기 스핀 컬럼을 버립니다.
24. 용리된 DNA에 10μL의 3M NaCl(DNA 용리액 1/10 부피)과 250 μL의 냉각 절대 에탄올(DNA 용리액 2.5 부피)을 추가합니다. 반전하여 잘 섞고 내용물을 8,000 x g 에서 15초 동안 회전시킵니다.
25. DNA-에탄올 혼합물을 -20°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
    참고: DNA-에탄올 혼합물의 배양은 추출된 DNA의 수율이나 품질을 크게 저하시키지 않고 16시간까지 늘릴 수 있습니다.
26. 4°C에서 19,000 x g 으로 30분 동안 원심분리기 디캔테이션으로 상층액을 버립니다.
27. 펠릿에 500μL의 냉각된 70% 에탄올을 추가합니다.
28. 4°C에서 19,000 x g 으로 15분 동안 원심분리기 디캔테이션으로 상층액을 버립니다.
29. 튜브를 뒤집어 티슈 페이퍼에 부드럽게 두드려 모세관 작용으로 잔류 에탄올을 제거합니다.
30. 모든 에탄올이 증발할 때까지 37°C에서 5-10분 동안 가열 블록에서 튜브를 열어 두어 DNA 펠릿을 완전히 건조시킵니다.
31. DNA 펠릿을 30-50 μL의 오토클레이브 이중 증류수(ddH₂O)에 다시 현탁시킵니다. 37 °C에서 5-10 분 동안 배양합니다.
32. 8,000 x g 에서 15초 동안 DNA를 스핀다운합니다.
33. Nanodrop 분광광도계의 핵산 설정에서 dsDNA 애플리케이션을 선택합니다.
    1. 보푸라기가 없는 티슈와 물로 받침대를 청소하십시오. ddH₂O를 사용하여 기기를 비운 다음 받침대에 DNA 샘플 2μL를 로드합니다.
    2. 농도 및 흡광도 비율(A260/280 및 A260/230)을 측정하여 순도를 결정합니다.
34. DNA 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오.

3. 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭 선형 DNA의 침전을 통해 다양한 분자량에서 DNA 회수율을 확인할 수 있습니다.

1. E. coli MG155의 게놈 DNA를 사용하여 PCR로 유전자 단편을 증폭하여 fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR 유전자에서 선형 단편 풀을 생성합니다(프라이머 염기서열 및 PCR 조건은 표 2 참조).
2. PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하고 PCR 산물을 함께 합칩니다.
3. 통합된 앰플리콘을 동일한 부피의 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 나누고 하나의 튜브를 '입력 DNA'로 레이블을 지정합니다.
4. 'Input DNA'라고 표시된 튜브를 제외한 각 튜브에 원하는 조건(9%, 20%, 30% PEG-8000, 0.3M, 1.2M NaCl)에 따라 PEG와 NaCl을 첨가하고 최종 부피를 1mL로 구성합니다.
5. 4 °C에서 밤새(~16-18시간) 튜브를 배양합니다.
   참고: 3.16까지의 나머지 단계 동안 '입력 DNA'는 냉장고에 변경되지 않은 상태로 보관됩니다.
6. 4°C에서 1시간 동안 원하는 속도(15,000 x g 또는 20,000 x g)에 따라 탁상용 마이크로 원심분리기에서 튜브를 회전시킵니다.
7. 마이크로피펫을 사용하여 펠릿 반대쪽에서 상층액 900μL를 조심스럽게 제거합니다.
8. 첫 번째 에탄올 세척: 펠릿에 900μL의 냉각된 70% 에탄올을 추가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
9. 3.6단계에서 사용한 것과 동일한 속도(15,000 x g 또는 20,000 x g)로 4°C에서 30분 동안 튜브를 회전합니다.
10. 디캔팅으로 상층액을 제거합니다.
11. 두 번째 에탄올 세척: 펠릿에 500μL의 냉각된 70% 에탄올을 추가합니다.
12. 3.6단계에서 사용한 것과 동일한 속도(15,000 x g 또는 20,000 x g)로 4°C에서 30분 동안 튜브를 회전합니다. 디캔테이션으로 상층액을 버립니다.
13. 튜브를 뒤집어 티슈 페이퍼에 부드럽게 두드려 모세관 작용으로 잔류 에탄올을 제거합니다.
14. 모든 에탄올이 증발할 때까지 37°C에서 5-10분 동안 가열 블록에서 튜브를 열어 두어 DNA 펠릿을 완전히 건조시킵니다.
15. 펠릿을 20μL의 오토클레이브 이중 증류수에 다시 현탁시킵니다.
16. Nanodrop 분광 광도계 또는 형광계를 사용하여 다양한 조건과 '입력 DNA'에 의해 침전된 DNA의 농도를 측정합니다.
17. DNA 시각화를 위해 침전된 DNA를 1% 아가로스 겔에 로드합니다.

  

결과

폐수 샘플에서 DNA의 고수율 추출을 위한 프로토콜 수립
물 샘플로부터 고품질 DNA 및 RNA를 추출하기 위해 이전에 확립된 프로토콜의 수정된 버전이 사용되었다¹⁷. 샘플은 인도 북부의 델리-NCR 지역에 있는 개방형 배수구와 하수 처리장에서 공급받았습니다. PEG 및 NaCl(그림 1)을 사용하여 전처리 한 후 토양 및 물에서 DNA...

토론

항생제 내성은 WHO가 선정한 10대 건강 위협 중 하나이며, 항생제 내성에 대한 환경 감시는 전 세계적으로 중요한 도구로 인식되고 있습니다. 서론에서 언급했듯이 환경 AMR의 포괄적인 기록에는 저분자량, 단편화 및 세포외 DNA가 포함됩니다. 염(30% PEG 및 1.2M NaCl)과 결합된 고농도의 PEG를 사용하여 여기에 보고된 전처리 프로토콜은 고분자량 분획(주로 게놈 및 플라스미드 DNA)의 추출에 영향을 주지 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-seat microcentrifuge	Eppendorf Centrifuge 5425 R	EP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)	Supelco	100983-0511
Agarose	Invitrogen	16500500
Bench top refrigerated centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5920 R	EP5948000131
ChemiDoc Imaging System	BioRad	12003153
DNeasy PowerSoil Pro Kit	Qiagen	47014
DNeasy PowerWater Pro Kit	Qiagen	14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)	Thermo Fisher	R0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer*	Thermofscientific	EP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder	Invitrogen	10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mL	Tarsons	510051
Molecular Biology Grade Water for PCR	HiMedia	ML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	13400519
Parafilm	Bemis	S37440
PEG-8000	SRL	54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit	Qiagen	28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)	Thermofisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermofisher	Q32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad range	Thermo Scientific	Q32853 (500 assays)
Sodium Chloride	HiMedia	TC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)	Applied Biosystems	4484073
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1125