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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo una semplice tecnica per valutare la resistenza antimicrobica ambientale (AMR) aumentando la proporzione di DNA extracellulare a basso peso molecolare. Il trattamento precedente con PEG al 20%-30% e NaCl 1,2 M consente di rilevare sia i geni genomici che quelli AMR trasferiti orizzontalmente. Il protocollo si presta a un processo senza kit con un'ulteriore ottimizzazione.

Abstract

La sorveglianza ambientale è riconosciuta come uno strumento importante per valutare la salute pubblica nell'era post-pandemica. L'acqua, in particolare le acque reflue, è emersa come fonte di scelta per campionare i carichi di agenti patogeni nell'ambiente. Le acque reflue provenienti da scarichi a cielo aperto e impianti di trattamento delle acque comunitarie sono un serbatoio di agenti patogeni e geni di resistenza antimicrobica (AMR) e spesso entrano in contatto con l'uomo. Sebbene esistano molti metodi per tracciare l'AMR dall'acqua, isolare DNA di buona qualità ad alte rese da campioni eterogenei rimane una sfida. Per compensare, i volumi di campione devono spesso essere elevati, creando vincoli pratici. Inoltre, il DNA ambientale è spesso frammentato e le fonti di AMR (plasmidi, fagi, DNA lineare) sono costituite da DNA a basso peso molecolare. Tuttavia, pochi processi di estrazione si sono concentrati su metodi per l'estrazione ad alto rendimento di DNA lineare e a basso peso molecolare. Qui, viene riportato un metodo semplice per l'estrazione lineare del DNA ad alto rendimento da piccoli volumi di acque reflue utilizzando le proprietà di precipitazione del polietilenglicole (PEG). Questo studio sostiene la necessità di aumentare la resa complessiva del DNA dai campioni d'acqua raccolti per le analisi metagenomiche, arricchendo la proporzione di DNA lineare. Inoltre, il miglioramento del DNA a basso peso molecolare supera l'attuale problema del sottocampionamento dell'AMR ambientale a causa di un'attenzione particolare al DNA intracellulare e ad alto peso molecolare. Si prevede che questo metodo sia particolarmente utile quando esiste DNA extracellulare ma a basse concentrazioni, come con gli effluenti degli impianti di trattamento. Dovrebbe anche migliorare il campionamento ambientale dei frammenti del gene AMR che si diffondono attraverso il trasferimento genico orizzontale.

Introduzione

Il SARS-CoV-2 e le sue conseguenze hanno sottolineato l'importanza della sorveglianza ambientale nel monitoraggio e nella previsione dei focolai di malattie infettive 1,2. Sebbene le pandemie virali siano evidenti, l'aumento della resistenza antimicrobica (AMR) è spesso descritto come una pandemia insidiosa e che costituisce una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica in tutto il mondo 3,4. Di conseguenza, vi è un urgente bisogno di strategie coordinate per comprendere l'evoluzione e la diffusione della resistenza antimicrobica. I corpi idrici, così come le acque reflue, possono fungere da serbatoi sia per gli agenti patogeni che per l'AMR 5,6,7,8. Le fonti d'acqua condivise sono, quindi, una potente fonte di trasmissione di malattie tra gli esseri umani, in particolare nei paesi a basso e medio reddito (LMIC) dove scarsa igiene e sovrappopolazione vanno di pari passo 9,10,11. L'analisi delle fonti d'acqua è stata a lungo impiegata per valutare la salute della comunità 12,13,14. Recentemente, le acque reflue degli impianti di trattamento delle acque reflue urbane si sono dimostrate un buon indicatore anticipato dei casi di COVID nella clinica 1,2,15,16,17,18.

Rispetto al monitoraggio di malattie specifiche, il rilevamento e il monitoraggio della resistenza antimicrobica nell'ambiente pone un problema più complesso. L'elevato numero di antibiotici in uso, i diversi geni di resistenza, le diverse pressioni di selezione locale e il trasferimento genico orizzontale tra i batteri rendono difficile valutare il vero carico di AMR e, una volta valutato, correlarlo con le osservazioni cliniche 19,20,21,22. Di conseguenza, mentre la sorveglianza concertata della resistenza antimicrobica clinica è in corso da parte di diverse organizzazioni in tutto il mondo 3,23,24, il monitoraggio ambientale della resistenza antimicrobica è ancora agli inizi, rivisto nel 19,25,26.

Negli ultimi anni, sono stati segnalati diversi metodi per monitorare la resistenza antimicrobica ambientale 5,27, rivisti in28,29. Il punto di partenza della maggior parte di questi è l'estrazione di DNA di buona qualità da campioni ambientali eterogenei, di per sé una sfida. Inoltre, il DNA ambientale è tipicamente frammentato a causa dell'esposizione ad ambienti ostili. Il DNA extracellulare frammentato è stato a lungo riconosciuto come un importante serbatoio di geni AMR (rivisto in 30,31,32), con l'aggiunta del potenziale di entrare e uscire dai batteri attraverso il trasferimento genico orizzontale. Pertanto, è importante che qualsiasi protocollo che miri a misurare il carico di AMR nell'ambiente campiona nel miglior modo possibile il DNA lineare e a basso peso molecolare. Sorprendentemente, c'è stata poca attenzione allo sviluppo di metodi specifici per l'estrazione ad alto rendimento di DNA lineare e a basso peso molecolare: questo lavoro si concentra sull'affrontare il divario.

Un metodo comune e semplice per precipitare il DNA consiste nel combinare il polietilenglicole (PEG) e sali come il cloruro di sodio (NaCl)33. Il PEG è un agente di affollamento macromolecolare utilizzato per ottenere precipitazioni di frammenti di DNA34,35 in base alle dimensioni. Più bassa è la concentrazione di PEG, maggiore è il peso molecolare del DNA che può essere precipitato in modo efficiente. Molti studi hanno utilizzato il PEG durante l'estrazione ambientale di DNA e RNA 1,2 (riassunto nella Tabella 1 17,33,36,37,38,39) sia nella fase finale 33,36,37 sia per concentrare grandi campioni d'acqua per l'estrazione di particelle virali come con SARS-CoV-2 15,40. Nel presente lavoro, si è scoperto che le concentrazioni di PEG utilizzate in precedenza per le estrazioni di DNA ambientale (in gran parte determinate da protocolli di sorveglianza virale) non catturano il DNA lineare a basso peso molecolare. Pertanto, perdono il campionamento di frammenti di DNA corti e non sono adatti a valutare accuratamente il contenuto di AMR. Questo studio ha sfruttato le proprietà del polietilenglicole e del cloruro di sodio per precipitare efficacemente frammenti di DNA lineare a basso peso molecolare ad una resa elevata che potrà, in futuro, portare a un metodo di estrazione del DNA economicamente vantaggioso. Questo metodo può essere utilizzato per arricchire la proporzione di DNA frammentato e a basso peso molecolare da campioni naturali complessi, catturando così un quadro più accurato della resistenza antimicrobica ambientale. Con un po' di ulteriore perfezionamento, la tecnica si presta ad un'applicazione facile ed economica da parte delle società municipali locali e di altri enti governativi da utilizzare come strumento di sorveglianza con una formazione tecnica minima.

Protocollo

1. Campionamento delle acque reflue

  1. Immergere un becher di polipropilene da 500 mL nello scarico a cielo aperto o nel serbatoio dell'impianto di trattamento delle acque reflue (STP) e raccogliere ~300 mL di campione di acque reflue.
  2. Trasferire ~250 mL del campione in un flacone in polipropilene autoclavato da 250 mL.
  3. Avvitare il tappo della bottiglia e sigillarlo con una pellicola di plastica. Conservare il flacone in posizione verticale in un sacchetto chiuso.
  4. Trasportare il campione in posizione verticale in un contenitore chiuso a temperatura ambiente.
  5. Inattivare il campione a 70 °C in un forno ad aria calda per 4 ore prima di processarlo per l'estrazione del DNA.

2. Estrazione del DNA da campioni di acque reflue

  1. Una volta che il campione di acque reflue si è raffreddato, agitare i campioni alla massima velocità e lasciare che i detriti/fanghi si depositino.
  2. Decantare 27,5 mL di acque reflue in provette da centrifuga da 50 mL e aggiungere 13,5 g di PEG-8000 (concentrazione finale 30%) e 3 g di NaCl (concentrazione finale 1,2 M) e mescolare bene fino a completa dissoluzione.
  3. Incubare il campione per una notte (~16-18 h) a 4 °C.
  4. Centrifugare il campione a 15.500 x g a 4 °C per 30 minuti.
  5. Scartare il surnatante.
    NOTA: PEG-8000 al 30% è altamente viscoso e il pellet può staccarsi durante lo scarto del surnatante. Il surnatante deve essere travasato lentamente e con attenzione per garantire che il pellet non vada perso. I passaggi da 2.6 a 2.23 vengono eseguiti utilizzando il kit di estrazione del DNA del suolo secondo le istruzioni del kit con alcune modifiche.
  6. Sciogliere il pellet in 800 μl della soluzione di lisi del kit e aggiungere la soluzione alla provetta di perle di zirconio miscelate.
    NOTA: In caso di lavorazione di volumi maggiori, raggruppare i pellet dal numero di provette desiderato. Ad esempio, se si elaborano 160 ml di campione; ci saranno quattro provette da 50 mL contenenti acque reflue con PEG e NaCl. Dopo la centrifugazione di tutte e quattro le provette a 15.500 x g a 4 °C per 30 minuti, eliminare il surnatante da tutte e quattro le provette. Aggiungere 200 μl di soluzione CD1 a ciascuno, risospendere i pellet e riunirli in un unico tubo a sfere.
  7. Fissare il tubo della perlina orizzontalmente su un vortice. Agitare il tubo alla massima velocità per 20-30 min.
    NOTA: Il vortice prolungato garantisce la completa lisi e omogeneizzazione dei campioni, migliorando la resa del DNA.
  8. Centrifugare le provette a 8.000 x g per 15 s per depositare le perle sul fondo, rimuovere la schiuma e trasferire completamente il surnatante dalla provetta a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Durante questa fase possono anche essere trasferite alcune perline.
  9. Centrifugare il surnatante a 15.000 x g per 1 minuto.
  10. Trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga da 2 ml pulita. Il surnatante può contenere ancora alcune particelle sospese.
  11. Aggiungere 200 μl di soluzione precipitante e agitare alla massima velocità per 5 s. Incubare a 4 °C per 5 min.
    NOTA: L'incubazione a 4 °C aumenta l'efficienza della precipitazione delle proteine e dei detriti cellulari mentre il DNA rimane in soluzione. È possibile mettere in pausa il protocollo in questa fase per un massimo di 2 ore senza una diminuzione significativa della resa e della qualità del DNA estratto.
  12. Centrifugare a 15.000 x g per 1 min a temperatura ambiente (RT). Evitare il pellet e trasferire il surnatante limpido in una provetta da microcentrifuga da 2 ml pulita.
  13. Aggiungere 600 μL di tampone legante per 700 μL di surnatante e agitare alla massima velocità per 5 s.
  14. Caricare 700 μl di lisato su una colonna di centrifuga di silice, incubare per 2 minuti e centrifugare a 15.000 x g per 1 minuto.
    NOTA: L'incubazione del lisato su colonna di silice migliora il legame del DNA alla colonna, con conseguente migliore resa del DNA.
  15. Scartare il flusso e ripetere il passaggio 2.14 fino a quando tutto il lisato è passato attraverso la colonna di centrifuga.
  16. Posizionare con cautela la colonna centrifuga in una provetta di raccolta da 2 ml pulita. Assicurarsi che non vi siano schizzi di flusso sulla colonna di centrifuga.
  17. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio alla colonna di centrifuga e centrifugare la colonna di centrifuga a 15.000 x g per 1 minuto.
  18. Eliminare il flusso continuo e riportare la colonna di centrifuga nella stessa provetta di raccolta da 2 mL.
  19. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio con etanolo alla colonna di centrifuga. Centrifugare a 15.000 x g per 1 min.
  20. Eliminare il flusso continuo e inserire la colonna di centrifuga in una nuova provetta di raccolta da 2 mL.
  21. Centrifugare a 16.000 x g per 2 minuti per rimuovere l'etanolo residuo. Posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta da 1,5 mL.
  22. Aggiungere 100 μl di tampone di eluizione (preriscaldato a 55 °C) al centro della membrana filtrante bianca e incubare per 5 minuti.
    NOTA: Il tampone di eluizione riscaldato, insieme all'incubazione sulla membrana, aumenta l'efficienza dell'eluizione del DNA, in particolare del DNA ad alto peso molecolare.
  23. Centrifugare a 15.000 x g per 1 min. Eliminare la colonna di rotazione.
  24. Al DNA eluito, aggiungere 10 μl di NaCl 3 M (1/10 di volume di eluato di DNA) e 250 μl di etanolo assoluto refrigerato (2,5 volume di eluato di DNA). Capovolgere per mescolare bene e centrifugare il contenuto a 8.000 x g per 15 s.
  25. Incubare la miscela DNA-etanolo a -20 °C per almeno 1 ora.
    NOTA: L'incubazione della miscela DNA-etanolo può essere aumentata a 16 ore senza una diminuzione significativa della resa o della qualità del DNA estratto.
  26. Centrifugare a 19.000 x g a 4 °C per 30 min. Scartare il surnatante per decantazione.
  27. Aggiungere 500 μl di etanolo refrigerato al 70% al pellet.
  28. Centrifugare a 19.000 x g a 4 °C per 15 min. Scartare il surnatante per decantazione.
  29. Capovolgere e picchiettare delicatamente il tubo su carta velina per rimuovere l'etanolo residuo mediante azione capillare.
  30. Asciugare completamente il pellet di DNA tenendo le provette aperte su un blocco riscaldante per 5-10 minuti a 37 °C fino a quando tutto l'etanolo non è evaporato.
  31. Risospendere il pellet di DNA in 30-50 μL di acqua distillata in autoclave (ddH2O). Incubare a 37 °C per 5-10 min.
  32. Centrifuga il DNA a 8.000 x g per 15 s.
  33. Selezionare l'applicazione dsDNA nelle impostazioni Acidi nucleici in uno spettrofotometro Nanodrop.
    1. Pulisci il piedistallo con carta velina priva di lanugine e acqua. Utilizzare ddH2O per cancellare lo strumento e quindi caricare 2 μL del campione di DNA sul piedistallo.
    2. Misurare i rapporti di concentrazione e assorbanza (A260/280 e A260/230) per determinare la purezza.
  34. Conservare il campione di DNA a -20 °C.

3. Precipitazione di DNA lineare amplificato con reazione a catena della polimerasi (PCR) per verificare il recupero del DNA in una gamma di pesi molecolari

  1. Utilizzando il DNA genomico di E. coli MG155, amplificare i frammenti genici mediante PCR per generare un pool di frammenti lineari dai seguenti geni: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (vedere la Tabella 2 per le sequenze di primer e le condizioni di PCR).
  2. Purificare i prodotti PCR utilizzando il kit di purificazione PCR e raggruppare i prodotti PCR.
  3. Dividere gli ampliconi raggruppati in provette per microcentrifuga da 1,5 mL con volumi uguali ed etichettare una provetta come "DNA in ingresso".
  4. Aggiungere PEG e NaCl secondo le condizioni desiderate (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) a ciascuna delle provette, ad eccezione di quella etichettata come "DNA in ingresso", e portare il volume finale a 1 mL.
  5. Incubare le provette per una notte (~16-18 h) a 4 °C.
    NOTA: Per il resto dei passaggi fino al 3.16, 'Input DNA' viene mantenuto invariato in frigorifero.
  6. Centrifugare le provette in una microcentrifuga da tavolo secondo la velocità desiderata (15.000 x g o 20.000 x g) per 1 ora a 4 °C.
  7. Rimuovere con cautela 900 μl di surnatante dal lato opposto al pellet utilizzando una micropipetta.
  8. Primo lavaggio con etanolo: aggiungere 900 μl di etanolo refrigerato al 70% al pellet e mescolare capovolgendo delicatamente le provette.
  9. Centrifugare i tubi alla stessa velocità utilizzata al punto 3.6 (15.000 x g o 20.000 x g) per 30 minuti a 4 °C.
  10. Rimuovere il surnatante per decantazione.
  11. Secondo lavaggio con etanolo: aggiungere 500 μl di etanolo refrigerato al 70% al pellet.
  12. Centrifugare i tubi alla stessa velocità utilizzata al punto 3.6 (15.000 x g o 20.000 x g) per 30 minuti a 4°C. Scartare il surnatante per decantazione.
  13. Capovolgere e picchiettare delicatamente il tubo su carta velina per rimuovere l'etanolo residuo mediante azione capillare.
  14. Asciugare completamente il pellet di DNA tenendo le provette aperte su un blocco riscaldante per 5-10 minuti a 37 °C fino a quando tutto l'etanolo evapora.
  15. Risospendere il pellet in 20 μl di acqua bidistillata autoclavata.
  16. Misura la concentrazione di DNA precipitato dalle diverse condizioni e dal "DNA in ingresso" utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop o un fluorimetro.
  17. Caricare il DNA precipitato su un gel di agarosio all'1% per la visualizzazione del DNA.

  

Risultati

Istituzione di un protocollo per l'estrazione ad alto rendimento del DNA da campioni di acque reflue
Una versione modificata di protocolli precedentemente stabiliti è stata utilizzata per l'estrazione di DNA e RNA di alta qualità da campioni d'acqua17. I campioni provenivano da scarichi a cielo aperto e da impianti di trattamento delle acque reflue nella regione di Delhi-NCR, nel nord dell'India. Dopo la pre-elaborazione con PEG e NaCl (

Discussione

La resistenza antimicrobica è oggi una delle prime 10 minacce per la salute, come elencato dall'OMS, e la sorveglianza ambientale per la resistenza antimicrobica è riconosciuta come uno strumento importante in tutto il mondo. Come accennato nell'introduzione, una registrazione completa dell'AMR ambientale include il DNA a basso peso molecolare, frammentato ed extracellulare. Il protocollo di pre-processazione qui riportato utilizzando un'alta concentrazione di PEG combinato con sale (30% PEG e 1,2 M NaCl) raggiunge que...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Riconosciamo il sostegno finanziario della Rockefeller Foundation (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) come parte del team APSI India (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Riconosciamo anche l'aiuto finanziario fornito da Axis Bank a sostegno di questa ricerca e dalla Trivedi School of Biosciences dell'Università di Ashoka per attrezzature e altro supporto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
24-seat microcentrifugeEppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Bench top refrigerated centrifugeEppendorf Centrifuge 5920 REP5948000131
ChemiDoc Imaging SystemBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mLTarsons510051
Molecular Biology Grade Water for PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)ThermofisherQ33238
Qubit Assay TubesThermofisherQ32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad rangeThermo ScientificQ32853 (500 assays)
Sodium ChlorideHiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)Applied Biosystems4484073
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125

Riferimenti

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