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Resumo

Aqui, apresentamos uma técnica simples para avaliar a resistência antimicrobiana ambiental (AMR), aumentando a proporção de DNA extracelular de baixo peso molecular. O tratamento prévio com 20%-30% de PEG e 1,2 M NaCl permite a detecção de genes de AMR genômicos e transferidos horizontalmente. O protocolo se presta a um processo sem kit com otimização adicional.

Resumo

A vigilância ambiental é reconhecida como uma importante ferramenta de avaliação da saúde pública na era pós-pandemia. A água, em particular as águas residuais, surgiu como a fonte de escolha para amostrar as cargas de patógenos no meio ambiente. As águas residuais de drenos abertos e estações de tratamento de água comunitárias são um reservatório de patógenos e genes de resistência antimicrobiana (AMR) e frequentemente entram em contato com humanos. Embora existam muitos métodos de rastreamento de AMR da água, isolar DNA de boa qualidade com alto rendimento de amostras heterogêneas continua sendo um desafio. Para compensar, os volumes de amostra geralmente precisam ser altos, criando restrições práticas. Além disso, o DNA ambiental é frequentemente fragmentado e as fontes de AMR (plasmídeos, fagos, DNA linear) consistem em DNA de baixo peso molecular. No entanto, poucos processos de extração se concentraram em métodos para extração de alto rendimento de DNA linear e de baixo peso molecular. Aqui, um método simples para extração linear de DNA de alto rendimento de pequenos volumes de águas residuais usando as propriedades de precipitação do polietilenoglicol (PEG) é relatado. Este estudo defende o aumento do rendimento geral de DNA de amostras de água coletadas para análises metagenômicas, enriquecendo a proporção de DNA linear. Além disso, o aprimoramento do DNA de baixo peso molecular supera o problema atual de subamostragem de AMR ambiental devido ao foco no DNA intracelular e de alto peso molecular. Espera-se que este método seja particularmente útil quando existe DNA extracelular, mas em baixas concentrações, como com efluentes de estações de tratamento. Também deve melhorar a amostragem ambiental de fragmentos do gene AMR que se espalham por meio da transferência horizontal de genes.

Introdução

O SARS-CoV-2 e suas consequências sublinharam a importância da vigilância ambiental no monitoramento e previsão de surtos de doenças infecciosas 1,2. Embora as pandemias virais sejam aparentes, o aumento da resistência antimicrobiana (RAM) é frequentemente descrito como uma pandemia insidiosa e que constitui uma das principais preocupações de saúde pública em todo o mundo 3,4. Consequentemente, há uma necessidade urgente de estratégias coordenadas para entender a evolução e a disseminação da RAM. Corpos d'água, assim como águas residuais, podem servir como reservatórios tanto para patógenos quanto para AMR 5,6,7,8. As fontes de água compartilhadas são, portanto, uma fonte potente de transmissão de doenças entre os seres humanos, particularmente em países de baixa e média renda (LMIC), onde a falta de higiene e a superpopulação andam de mãos dadas 9,10,11. O teste de fontes de água tem sido empregado há muito tempo para avaliar a saúde da comunidade 12,13,14. Recentemente, as águas residuais das estações de tratamento de esgoto urbano provaram ser um bom indicador antecipado de casos de COVID na clínica 1,2,15,16,17,18.

Em comparação com o monitoramento de doenças específicas, detectar e rastrear a RAM no ambiente representa um problema mais complexo. O grande número de antibióticos em uso, diversos genes de resistência, diferentes pressões de seleção local e transferência horizontal de genes entre bactérias dificultam a avaliação da verdadeira carga de RAM e, uma vez avaliada, correlacioná-la com observações clínicas 19,20,21,22. Como resultado, enquanto a vigilância concertada da RAM clínica está sendo realizada por várias organizações em todo o mundo 3,23,24, o monitoramento ambiental da RAM ainda está em sua infância, revisado em 19,25,26.

Nos últimos anos, diferentes métodos de rastreamento de RAM ambiental foram relatados 5,27, revisados em28,29. O ponto de partida da maioria deles é a extração de DNA de boa qualidade de amostras ambientais heterogêneas, o que por si só é um desafio. Além disso, o DNA ambiental é tipicamente fragmentado devido à exposição a ambientes hostis. O DNA extracelular fragmentado há muito é reconhecido como um importante reservatório de genes AMR (revisado em 30,31,32), com o potencial adicional de entrar e sair de bactérias por meio da transferência horizontal de genes. Portanto, é importante que qualquer protocolo que vise medir a carga de AMR no ambiente deve coletar amostras de DNA linear e de baixo peso molecular da melhor maneira possível. Surpreendentemente, tem havido pouco foco no desenvolvimento de métodos específicos para extração de alto rendimento de DNA linear e de baixo peso molecular: este trabalho se concentra em abordar a lacuna.

Um método comum e simples para precipitar o DNA é combinar polietilenoglicol (PEG) e sais como cloreto de sódio (NaCl) 33 . O PEG é um agente de aglomeração macromolecular usado para obter precipitação específica de tamanho de fragmentos de DNA34,35. Quanto menor a concentração de PEG, maior o peso molecular do DNA que pode ser precipitado com eficiência. Muitos estudos utilizaram o PEG durante a extração ambiental de DNA e RNA 1,2 (resumido na Tabela 1 17,33,36,37,38,39) seja na etapa final 33,36,37 ou para concentrar grandes amostras de água para extração de partículas virais como no SARS-CoV-2 15,40. No presente trabalho, verifica-se que as concentrações de PEG usadas anteriormente para extrações de DNA ambiental (em grande parte determinadas por protocolos de vigilância viral) não capturam DNA linear de baixo peso molecular. Portanto, eles perdem na amostragem de fragmentos curtos de DNA e são inadequados para avaliar o conteúdo de AMR com precisão. Este estudo explorou as propriedades do polietilenoglicol e do cloreto de sódio para precipitar efetivamente fragmentos de DNA linear de baixo peso molecular com alto rendimento que pode, no futuro, levar a um método de extração de DNA econômico. Este método pode ser usado para enriquecer a proporção de DNA fragmentado e de baixo peso molecular de amostras naturais complexas, capturando assim uma imagem mais precisa da RAM ambiental. Com um pouco mais de refinamento, a técnica se presta a uma aplicação fácil e de baixo custo por corporações municipais locais e outros órgãos governamentais para usar como uma ferramenta de vigilância com treinamento técnico mínimo.

Protocolo

1. Amostragem de águas residuais

  1. Mergulhe um béquer de polipropileno de 500 mL no reservatório aberto do dreno ou da estação de tratamento de esgoto (STP) e colete ~ 300 mL de amostra de águas residuais.
  2. Transfira ~ 250 mL da amostra para um frasco de polipropileno autoclavado de 250 mL.
  3. Enrosque a tampa da garrafa e feche-a com um filme plástico. Mantenha a garrafa na posição vertical em um saco fechado.
  4. Transporte a amostra na vertical em um recipiente fechado à temperatura ambiente.
  5. Inativar a amostra a 70 °C em estufa de ar quente durante 4 h antes de a processar para extração de ADN.

2. Extração de DNA de amostras de águas residuais

  1. Uma vez que a amostra de águas residuais é resfriada, vortex as amostras na velocidade máxima e deixe os detritos / lodo assentarem.
  2. Transvase 27,5 mL de águas residuais em tubos de centrífuga de 50 mL e adicione 13,5 g de PEG-8000 (concentração final de 30%) e 3 g de NaCl (concentração final de 1,2 M) e misture bem até dissolver completamente.
  3. Incubar a amostra durante a noite (~16-18 h) a 4 °C.
  4. Centrifugue a amostra a 15.500 x g a 4 °C por 30 min.
  5. Descarte o sobrenadante.
    NOTA: PEG-8000 a 30% é altamente viscoso e o pellet pode ser desalojado ao descartar o sobrenadante. O sobrenadante deve ser decantado lenta e cuidadosamente para garantir que o pellet não se perca. As etapas 2.6 a 2.23 são executadas usando o kit de extração de DNA do solo de acordo com as instruções do kit com algumas modificações.
  6. Dissolva o pellet em 800 μL da solução de lise do kit e adicione a solução ao tubo de esferas de zircônio misturado.
    NOTA: Se estiver processando volumes maiores, agrupe os pellets do número desejado de tubos. Por exemplo, se estiver processando 160 mL de amostra; haverá quatro tubos de 50 mL contendo águas residuais com PEG e NaCl. Após centrifugação de todos os quatro tubos a 15.500 x g a 4 ° C por 30 min, descarte o sobrenadante de todos os quatro tubos. Adicione 200 μL de solução de CD1 a cada um, ressuspenda os pellets e agrupe-os em um tubo de esferas.
  7. Prenda o tubo do cordão horizontalmente em um vórtice. Vortex o tubo na velocidade máxima por 20-30 min.
    NOTA: O vórtice prolongado garante a lise completa e homogeneização das amostras, o que melhora o rendimento do DNA.
  8. Gire os tubos a 8.000 x g por 15 s para assentar os grânulos no fundo, remover a espuma e transferir o sobrenadante completamente do tubo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Algumas contas também podem ser transferidas durante esta etapa.
  9. Centrifugue o sobrenadante a 15.000 x g por 1 min.
  10. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo de 2 mL. O sobrenadante ainda pode conter algumas partículas em suspensão.
  11. Adicionar 200 μL de solução precipitante e vórtice à velocidade máxima durante 5 s. Incubar a 4 °C durante 5 min.
    NOTA: A incubação a 4 °C aumenta a eficiência da precipitação de proteínas e detritos celulares enquanto o DNA permanece em solução. É possível pausar o protocolo nesta etapa por até 2 h sem uma diminuição significativa no rendimento e na qualidade do DNA extraído.
  12. Centrifugue a 15.000 x g por 1 min em temperatura ambiente (RT). Evite o pellet e transfira o sobrenadante transparente para um tubo de microcentrífuga limpo de 2 mL.
  13. Adicione 600 μL de tampão de ligação por 700 μL de sobrenadante e vórtice na velocidade máxima por 5 s.
  14. Carregue 700 μL do lisado em uma coluna de centrifugação de sílica, incube por 2 min e centrifugue a 15.000 x g por 1 min.
    NOTA: A incubação do lisado na coluna de sílica aumenta a ligação do DNA à coluna, resultando em melhor rendimento de DNA.
  15. Rejeitar o fluxo e repetir o passo 2.14 até que todo o lisado tenha passado pela coluna de centrifugação.
  16. Coloque cuidadosamente a coluna de centrifugação em um tubo de coleta limpo de 2 mL. Certifique-se de que nenhum fluxo seja respingado na coluna de rotação.
  17. Adicione 500 μL de tampão de lavagem à coluna de centrifugação e centrifugue a coluna de centrifugação a 15.000 x g por 1 min.
  18. Descarte o fluxo e retorne a coluna de centrifugação para o mesmo tubo de coleta de 2 mL.
  19. Adicione 500 μL de tampão de lavagem de etanol à coluna de centrifugação. Centrifugue a 15.000 x g por 1 min.
  20. Descarte o fluxo e coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de 2 mL.
  21. Centrifugue a 16.000 x g por 2 min para remover o etanol residual. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de 1,5 mL.
  22. Adicione 100 μL de tampão de eluição (pré-aquecido a 55 °C) no centro da membrana do filtro branco e incube por 5 min.
    NOTA: O tampão de eluição aquecido, juntamente com a incubação na membrana, aumenta a eficiência da eluição do DNA, especialmente do DNA de alto peso molecular.
  23. Centrifugue a 15.000 x g por 1 min. Descarte a coluna de rotação.
  24. Ao DNA eluído, adicione 10 μL de NaCl 3 M (1/10 volume de eluato de DNA) e 250 μL de etanol absoluto resfriado (2,5 volume de eluato de DNA). Inverta para misturar bem e gire o conteúdo a 8.000 x g por 15 s.
  25. Incubar a mistura de ADN e etanol a -20 °C durante, pelo menos, 1 h.
    NOTA: A incubação da mistura de DNA-etanol pode ser aumentada para 16 h sem uma diminuição significativa no rendimento ou na qualidade do DNA extraído.
  26. Centrifugue a 19.000 x g a 4 °C por 30 min. Descarte o sobrenadante por decantação.
  27. Adicione 500 μL de etanol 70% resfriado ao pellet.
  28. Centrifugue a 19.000 x g a 4 °C por 15 min. Descarte o sobrenadante por decantação.
  29. Inverta e bata suavemente o tubo no papel de seda para remover o etanol residual por ação capilar.
  30. Seque completamente o sedimento de ADN, mantendo os tubos abertos num bloco de aquecimento durante 5-10 min a 37 °C até que todo o etanol tenha evaporado.
  31. Ressuspenda o pellet de DNA em 30-50 μL de água bidestilada autoclavada (ddH2O). Incubar a 37 °C durante 5-10 min.
  32. Gire o DNA a 8.000 x g por 15 s.
  33. Selecione a aplicação de dsDNA nas configurações de Ácidos Nucleicos em um espectrofotômetro Nanodrop.
    1. Limpe o pedestal com papel de seda sem fiapos e água. Use ddH2O para esvaziar o instrumento e, em seguida, carregue 2 μL da amostra de DNA no pedestal.
    2. Medir as relações de concentração e de absorvância (A260/280 e A260/230) para determinar a pureza.
  34. Armazenar a amostra de ADN a -20 °C.

3. Precipitação de DNA linear amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) para verificar a recuperação do DNA em uma variedade de pesos moleculares

  1. Usando DNA genômico de E. coli MG155, amplifique fragmentos de genes por PCR para gerar um conjunto de fragmentos lineares dos seguintes genes: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (consulte a Tabela 2 para sequências de primers e condições de PCR).
  2. Purifique os produtos de PCR usando o kit de purificação de PCR e agrupe os produtos de PCR.
  3. Divida os amplicons agrupados em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com volumes iguais - rotule um tubo como 'DNA de entrada'.
  4. Adicione PEG e NaCl de acordo com as condições desejadas (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) a cada um dos tubos, exceto aquele rotulado como 'DNA de entrada' e perfaça o volume final para 1 mL.
  5. Incubar os tubos durante a noite (~16-18 h) a 4 °C.
    NOTA: Para o resto das etapas até 3.16, 'DNA de entrada' é mantido inalterado na geladeira.
  6. Girar os tubos numa microcentrífuga de mesa de acordo com a velocidade desejada (15.000 x g ou 20.000 x g) durante 1 h a 4 °C.
  7. Remova cuidadosamente 900 μL do sobrenadante do lado oposto ao pellet usando uma micropipeta.
  8. Primeira lavagem com etanol: Adicione 900 μL de etanol 70% resfriado ao pellet e misture invertendo suavemente os tubos.
  9. Gire os tubos na mesma velocidade usada na etapa 3.6 (15.000 x g ou 20.000 x g) por 30 min a 4 °C.
  10. Remover o sobrenadante por decantação.
  11. Segunda lavagem com etanol: Adicione 500 μL de etanol 70% resfriado ao pellet.
  12. Gire os tubos na mesma velocidade usada na etapa 3.6 (15.000 x g ou 20.000 x g) por 30 min a 4°C. Descarte o sobrenadante por decantação.
  13. Inverta e bata suavemente o tubo no papel de seda para remover o etanol residual por ação capilar.
  14. Secar completamente o sedimento de ADN, mantendo os tubos abertos num bloco de aquecimento durante 5-10 min a 37 °C até que todo o etanol evapore.
  15. Ressuspenda o pellet em 20 μL de água bidestilada autoclavada.
  16. Meça a concentração de DNA precipitada pelas diferentes condições e o 'DNA de entrada' usando um espectrofotômetro ou fluorômetro Nanodrop.
  17. Carregue o DNA precipitado em um gel de agarose a 1% para visualização do DNA.

  

Resultados

Estabelecimento de um protocolo para extração de DNA de alto rendimento de amostras de águas residuais
Uma versão modificada de protocolos previamente estabelecidos foi usada para a extração de DNA e RNA de alta qualidade de amostras de água17. As amostras foram provenientes de drenos abertos, bem como de estações de tratamento de esgoto na região de Delhi-NCR, no norte da Índia. Após o pré-processamento utilizando PEG e NaCl (

Discussão

A RAM é uma das 10 principais ameaças à saúde atualmente, conforme listado pela OMS, e a vigilância ambiental da RAM é reconhecida como uma ferramenta importante em todo o mundo. Conforme mencionado na introdução, um registro abrangente de AMR ambiental inclui DNA de baixo peso molecular, fragmentado e extracelular. O protocolo de pré-processamento relatado aqui usando uma alta concentração de PEG combinado com sal (30% de PEG e 1,2 M de NaCl) alcança esse resultado enriquecendo a proporção de DNA de baixo ...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Reconhecemos o apoio financeiro da Fundação Rockefeller (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) como parte da equipe da APSI Índia (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Também reconhecemos a ajuda financeira fornecida pelo Axis Bank no apoio a esta pesquisa e pela Trivedi School of Biosciences da Ashoka University para equipamentos e outros suportes.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
24-seat microcentrifugeEppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Bench top refrigerated centrifugeEppendorf Centrifuge 5920 REP5948000131
ChemiDoc Imaging SystemBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mLTarsons510051
Molecular Biology Grade Water for PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)ThermofisherQ33238
Qubit Assay TubesThermofisherQ32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad rangeThermo ScientificQ32853 (500 assays)
Sodium ChlorideHiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)Applied Biosystems4484073
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125

Referências

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