התמרה נרחבת של נוירונים ניאוקורטיקליים של עכברים על ידי הזרקה תת-עכבישית של AAV2

Summary

מתוארת טכניקה חדשה להעברה נרחבת של נגיף הקשור לאדנו, המשתמשת בעירוי וירוס תת-עכבישי. שיטה זו לא רק מבטיחה התמרה נרחבת של נוירונים ניאו-קורטיקליים של עכברים בשכבות שטחיות, אלא גם מביאה לביטוי סלקטיבי של הטרנסגן בנוירונים פירמידליים בשכבה חמש, גם כאשר משתמשים במקדם לא סלקטיבי.

Abstract

נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו-הם כלי גמיש ורב עוצמה להעברה וביטוי של גנים שונים בעלי עניין בתחומים רבים של ביולוגיה ניסויית, במיוחד במדעי המוח. השיטה הפופולרית ביותר להניע את הביטוי של טרנסגן רצוי באזור מסוים במוח היא הזרקת וקטור AAV ישירות לפרנכימה של המוח. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת התמרה עצבית נרחבת הנדרשת לחלק מניסויי in vivo . במאמר זה, אנו מציגים טכניקה חדשה לביטוי גנים נרחב בניאו-קורטקס של עכברים המבוססת על עירוי ויראלי לחלל התת-עכבישי של המוח. שיטת תיוג עצבית זו לא רק מבטיחה התמרה נרחבת של נוירונים בשכבות ניאו-קורטיקליות שטחיות של עכבר בוגר, אלא גם מביאה לביטוי של הטרנסגן באוכלוסייה גדולה של נוירונים פירמידליים בשכבה חמש עם ספציפיות גבוהה גם בעת שימוש במקדם חזק ולא סלקטיבי כגון CAG. יתר על כן, מכיוון שהתמרת תאים מתרחשת במרחק משמעותי מאתר ההזרקה, שיטה זו יכולה לסייע בשימור רקמת המוח לצורך הקלטות אופטיות או אלקטרופיזיולוגיות של פעילות עצבית לאחר מכן.

Introduction

מוח היונקים מורכב מתאים מעכבים, מעוררים ומווסתים רבים המחוברים זה לזה למעגלים על ידי טריליוני סינפסות¹. אחד האתגרים המרכזיים של מדעי המוח הוא לפענח את תפקידם של סוגי תאים שונים בארגון ובתפקוד של מעגלי מוח והתנהגות. מניפולציה של תאים מוגדרים גנטית בתוך המוח דורשת שיטות להחדרה ולביטוי של טרנסגנים. מערכות העברת גנים מבוססות ויראלים הן ללא ספק השיטה היעילה והפשוטה ביותר להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית². מערכות אספקה ויראליות מבוססות על שכפול וירוסים (אדנו-וירוסים, וירוסים הקשורים לאדנו-וירוסים (AAVs), לנטי-וירוסים ורטרו-וירוסים) שיש להם את היכולת להעביר מידע גנטי לתא מארח ^2,3.

וקטורים מבוססי AAV הפכו כעת לאחד הכלים הנפוצים ביותר להעברת טרנסגנים רצויים לתאים במוח, הן למטרות מחקר בסיסי במדעי המוח והן לפיתוח ריפוי גנטי למחלות נוירולוגיות. בהשוואה לנגיפים אחרים, ל-AAV פגומים בשכפול יש תכונות רבות שהופכות אותם לווקטורים אידיאליים למטרות אלה. בעיקר, וקטורי AAV מתמרים ביעילות תאים שאינם מתחלקים (מובחנים סופנית) כגון נוירונים ותאי גליה, וכתוצאה מכך רמות גבוהות של ביטוי טרנסגנים in vivo². ניתן לייצר את הווקטורים בקלות בטיטר פונקציונלי גבוה המתאים לשימוש in vivo ^3,4,5. חשוב לציין, העברת גנים בתיווך נגיף הקשור לאדנו in vivo אינה מייצרת שינויים היסטופתולוגיים ורעילות הקשורה לווקטור⁶. בניגוד לווקטורים אדנו-ויראליים, מתן in vivo של וקטורי AAV במודלים של בעלי חיים בדרך כלל אינו מעורר תגובות חיסוניות של המארח כנגד תאים מותמרים, ומאפשר ביטוי טרנסגנים יציב בתוך פרנכימת המוח לפרקי זמן ממושכים ^2,7,8.

סיבה נוספת לפופולריות של וקטורי AAV היא המגוון הרחב של סרוטיפים AAV עם טרופיזמים ייחודיים של רקמות ותאים 9,10,11,12,13,14. חלבוני קפסיד מובהקים המתבטאים על ידי סרוטיפים שונים של AAV מביאים לשימוש בקולטנים שונים על פני התא לכניסת תאים ובכך לטרופיזמים ספציפיים^10,14.

טרופיזם AAV נקבע לא רק על ידי חלבוני קפסיד אלא על ידי גורמים רבים אחרים¹⁴. הוכח כי סרוטיפים 1, 2, 6, 7, 8 ו-9 של AAV התמירו הן נוירונים והן אסטרוציטים בתרבית ראשונית^15,16, אך הפגינו טרופיזם עצבי חזק לאחר הזרקת מוח תוך-פרנכימלית^17,18. השיטה המשמשת להכנת וקטור AAV יכולה גם להשפיע על טרופיזם של תאי עצבים, אפילו עבור אותו סרוטיפ. לדוגמה, AAV8 מטוהר CsCl היה בעל טרופיזם אסטרוגליאלי חזק לאחר הזרקת מוח תוך-פרנכימלית, בעוד ש-AAV8 מטוהר יודיקסאנול, שהוזרק בתנאים זהים, התמיר רק נוירונים¹⁹. טרופיזם AAV עשוי להיות מושפע גם מהמינון המוזרק ומנפח¹⁴. לדוגמה, טיטר גבוה rAAV2/1 התמיר ביעילות הן נוירונים מעוררים קליפת המוח והן נוירונים מעכבים, אך השימוש בטיטרים נמוכים יותר חשף העדפה חזקה להתמרה של נוירונים מעכבים בקליפת המוח²⁰.

לפיכך, לא ניתן להשיג ספציפיות חזקה של סוג התא המבוססת אך ורק על סרוטיפ הקפסיד. ניתן להשתמש במקדמים ספציפיים לסוג תא כדי להתגבר על הטרופיזם הטבעי הרחב של קפסיד AAV. לדוגמה, סינפסין I אנושי משמש להתמקדות בנוירונים²¹, מקדם CaMKII יכול להניע ביטוי טרנסגנים בנוירונים מעוררים גלוטמטרגיים עם ספציפיות גבוהה²⁰, מקדם ppHcrt מכוון לנוירונים המבטאים היפוקרטין (HCRT) בהיפותלמוס הצדדי²², מקדם PRSx8 מכוון לנוירונים נוראדרנרגיים ואדרנרגיים המבטאים דופמין בטא-הידרוקסילאז²³, ומקדם GFAP יכול להניע ביטוי ספציפי לאסטרוציטים²⁴. עם זאת, לחלק מהמקדמים הספציפיים לתא יש פעילות שעתוק חלשה ואינם יכולים להניע רמות מספיקות של ביטוי טרנסגנים²⁵. יתר על כן, המקדמים הקצרים המתאימים לווקטורים נגיפיים של AAV לרוב אינם שומרים על ספציפיות סוג התא ^1,26. לדוגמה, הוכח שמבנה CaMKII התמיר גם נוירונים מעכבים¹².

מלבד ספציפיות סוג התא (טרופיזם), מאפיין משמעותי נוסף של AAVs הוא יעילות התמרה. לסרוטיפים השונים של AAV יש תכונות דיפוזיה שונות. AAV2 וארבעה וקטורים נגיפיים מתפזרים פחות בקלות דרך פרנכימת המוח ולכן מתווכים התמרה על פני שטח קטן יותר^17,27. ההתמרה העצבית הנפוצה ביותר נצפית עם סרוטיפים AAV 1, 9 ו-rh.10 11,17,18,19,28.

השיטה הפופולרית ביותר להניע את הביטוי של טרנסגן רצוי באזור מסוים במוח היא להזריק את וקטור ה-AAV ישירות לאזור המוח המעניין (פרנכימה)³. לאחר הזרקה תוך-פרנכימלית, אפילו סרוטיפים של AAV עם דיפוזיה יעילה יותר דרך המוח מתמרים בדרך כלל רק אזור מקומי סביב אתר ההזרקה ¹². יתרה מכך, הזרקה תוך פרנכימלית היא הליך פולשני ומוביל לנזק לרקמות הסמוכות לאזור העניין. לפיכך, שיטה זו של הזרקת וירוסים אינה מתאימה למשימות ניסיוניות מסוימות. לדוגמה, תיוג נרחב של תאים רצוי מאוד בניסויים שמטרתם לחקור תפקודי נוירונים בקליפת המוח בבעלי חיים הנעים בחופשיות, כולל באמצעות מיקרוסקופיה של פוטון אחד או שניים 29,30,31,32.

כאן, אנו מתארים טכניקת הזרקת וירוסים חדשה הקשורה לאדנו, המשתמשת בעירוי וירוסים תת-עכבישיים כדי לספק התמרה נרחבת של נוירונים ניאו-קורטיקליים בעכברים בוגרים ולשמר רקמת מוח להקלטות אופטיות או אלקטרופיזיולוגיות של פעילות עצבית. שיטה זו לא רק הבטיחה התמרה נרחבת של נוירונים בשכבות ניאו-קורטיקליות שטחיות, אלא הביאה לביטוי של הטרנסגן באוכלוסייה גדולה של נוירונים פירמידליים בשכבה חמש עם ספציפיות גבוהה גם בעת שימוש במקדם חזק ולא סלקטיבי כגון CAG.

Protocol

נערכו ניסויים בעכברים בוגרים C57Black/6 משני המינים (מרכז גידול פושצ'ינו, סניף המכון לכימיה ביואורגנית ע"ש שמיאקין-אובצ'יניקוב של RAS). העכברים שוכנו בוויווריום מבוקר טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות, אורות דולקים בשעה 08:00) עם מזון ומים אד ליביטום. כל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ARRIVE ולהנחיה 2010/63/EU לניסויים בבעלי חיים. פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של IHNA RAS (פרוטוקול N1 מיום 01.02.2022). נעשה כל מאמץ למזער את סבלם של בעלי החיים ולהבטיח את אמינות התוצאות.

1. הכנה לניתוח

1. עקר את כל המכשירים הכירורגיים לפני תחילת הניתוח. נקה את אזור הניתוח באמצעות 70% אתנול.
2. בדוק את רמת האיזופלורן במערכת ההרדמה ומלא אותה במידת הצורך. הניחו מגבת נייר נקייה בתחתית תא האינדוקציה.
3. הנח כרית חימום על המסגרת הסטריאוטקסית. מכסים את הכרית במגבת נייר נקייה.
4. הכינו בקבוק עם אקונומיקה של 2% כדי לאסוף קצות מיקרופיפטות, צינורות, צמר גפן ופריטים אחרים שבאים במגע עם הנגיף.
5. מוציאים כמות של AAV מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס ומניחים אותה על קרח להפשרה.

2. הכנת מזרק

1. נקה מיקרו-מזרק המילטון 5 מיקרוליטר עם מחט RN קהה 33G. שאפו ואז חלקו 70% אתנול. חזור על הפעולה 3 פעמים עם אתנול טרי. שוטפים את המזרק במים מזוקקים כדי להסיר את עודפי האתנול. חזור על הפעולה 3x.
2. הוציאו את הבוכנה ומלאו את הקנה בשמן וזלין דרך האוגן באמצעות מזרק אינסולין. וודאו כי אין בועות אוויר במיקרו-מזרק.
   הערה: אוויר כלוא ניתן לדחיסה ומשפיע על דיוק ודיוק המזרק.
3. החזירו את הבוכנה למיקרו-מזרק והוציאו טיפת שמן. הנח את המזרק לתוך המזרק הסטריאוטקסי כך שהסולם יהיה גלוי לניטור נפח התמיסה המחולקת.

3. הכנת עכברים לניתוח

1. שקלו עכבר. הנח את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה המחובר לאיזופלורן. הפעל את מכשיר האידוי איזופלורן המוגדר ל-5% והתאם את קצב הזרימה ל-250 מ"ל/דקה. עומק הרדמה הולם מושג תוך 5 עד 7 דקות.
2. כדי לאמת את רמת ההרדמה הכירורגית, בדוק אם יש היעדר רפלקס הקצפה ונסיגה במהלך צביטה כואבת בכף האחורית, והיעדר מצמוץ בקשר עין.
3. העבר את שסתום יציאת הוופורייזר מתא האינדוקציה למסכה הסטריאוטקסית. הפחת את האיזופלורן ל-1.8%-2.0% והגדר את קצב הזרימה בהתאם למשקל העכבר (70-90 מ"ל/דקה לעכברים במשקל שבין 25 ל-35 גרם).
4. הסר את העכבר מתא האינדוקציה והנח אותו במנגנון הסטריאוטקטי על גבי כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) למניעת היפותרמיה במהלך הרדמה כירורגית. הנח את השיניים הקדמיות במוט השיניים ולאחר מכן הרכיב את מסכת החיה.
5. מקם בזהירות את החיה על מוטות האוזניים. תנוחת הראש הנכונה במנגנון הסטריאוטקטי מאפשרת תנועה אנכית אך לא רוחבית של הראש. ודא שמיקום החיה אינו גורם למצוקה. עקוב בקפידה אחר עומק ההרדמה, נשימת בעלי החיים וטמפרטורת הגוף לאורך כל הניתוח.
6. לגלח את הראש מהעיניים אל מאחורי האוזניים. נקו את פני השטח המגולחים של הראש על ידי ספוגית עם 70% אתנול, ולאחר מכן ספוג עם תמיסת אלכוהול של 5% יוד.
7. מרחו ג'ל עיניים למניעת ייבוש בעיניים. יש למרוח תמיסת לידוקאין 4% באופן מקומי ודקסמתזון (0.02 מ"ל ב-4 מ"ג/מ"ל) תת עורית כדי למנוע כאבים הקשורים לניתוח ולהפחית את התגובה הדלקתית האפשרית.
8. בעזרת להב אזמל סטרילי ומספריים, בצע חתך באורך 4-5 מ"מ לאורך קו האמצע של הראש כדי לפתוח את הקרקפת. התחל בחתך קטן בין האוזניים ולאחר מכן הרחב אותו באמצעות מספריים כדי למנוע נזק לגולגולת.
9. ספוג את פני הגולגולת בכמות קטנה של 3% מי חמצן כדי לדמיין את ציוני הדרך הסטריאוטקסיים: ברגמה ולמבדה. עצור את התגובה עם 0.9% NaCl מלח מיד. מגרדים רקמות על גבי הגולגולת בעזרת מגרד עצם.
10. התקן את המזרק הממונע שהוכן מראש עם מזרק המילטון על הזרוע הסטריאוטקסית. כוון מקור אור כירורגי על הגולגולת החשופה ומקד את המיקרוסקופ על הברגמה.
11. בהסתכלות דרך המיקרוסקופ, תפעל את הזרוע של המנגנון הסטריאוטקטי כדי למרכז את החלק העליון של המחט ישירות מעל הברגמה.
12. בעזרת קצה המחט, יישר את הברגמה והלמבדה אופקית ולאחר מכן הזז את הזרוע לאחור לברגמה ורשום את הקואורדינטות. השתמש בקואורדינטות ברגמה אלה ובקואורדינטות האטלס של אזור העניין כדי לחשב את הקואורדינטות היחסיות של אזור היעד.
13. העבר את המחט לאזור הממוקד. הורד את המחט בקואורדינטות החדשות וסמן מיקום זה. בחר את האתר למיקרו-הזרקה ויראלית בסמיכות לאזור היעד תוך התחשבות בהתפשטות הנגיף.
    הערה: זה ימנע פגיעה ברקמה באזור העניין. השתמשנו בקואורדינטות הבאות עבור אזור העניין: AP-3.4, ML -2.0, ולמיקרו-הזרקה ויראלית: AP-2.0, ML -1.4. הקואורדינטות לעיל הן אופטימליות אם נוירונים ראשוניים בקליפת המוח הראייתית אמורים להיות נגועים.
14. במידת האפשר, הימנע מאזורים עם כלי דם גדולים. תחת מיקרוסקופ כירורגי, תאורה בהירה וקרה וטבילה של 0.9% NaCl במי מלח, אמורים להתגלות כלי דם גדולים בגולגולת ועל פני המוח.

4. הזרקת וירוסים

1. קח בור שיניים סטרילי (קוטר 0.5 - 0.8 מ"מ). התבוננות במשטח הגולגולת דרך המיקרוסקופ הכירורגי, קדחו קרניוטומיה קטנה באופן ידני (ביד) או באמצעות מיקרו-מקדחה. הקפד לא להפעיל לחץ מוגזם על הגולגולת.
2. הזז את הזרוע מהדרך כדי למנוע נזק למחט המיקרו-מזרק במהלך קידוח הגולגולת (חור). יש למרוח טבילה במי מלח של 0.9% NaCl ולעצור לסירוגין כדי למנוע חימום העצם ופגיעה בדורה מאטר. השתמש באוויר בלחץ כדי לפוצץ אבק עצמות.
   הערה: הסוגים הבאים של בורות שיניים מקרביד מתאימים: בצורת אגס (רצוי), גליל מעוגל ועגול.
   1. בעת דילול העצם עם הבור, ודא שהדילול אחיד על פני כל ההיקף. זה יקל על הסרת העצם מבלי לפגוע בדורה מאטר. לשם כך, השתמש בתחילה בבור עם קצה עגול ולאחר מכן בבור עם קצה שטוח. שמור על הבור בניצב לעצם; אחרת, צד אחד יהיה דק יותר מהשני.
      הערה: בנוסף, ככל שגודל הבור קטן יותר וככל שהגולגולת המבוצעת קטנה יותר, כך המניפולציה תהיה מורכבת יותר. מומלץ לבצע קרניוטומיה בקוטר קטן יותר (0.5-0.6 מ"מ) בעת שימוש נוסף בבעל החיים לעבודה in vivo . אם מתכננים להשתמש במוח החיה לעבודה מחוץ לגוף , מקובל קוטר גולגולת גדול יותר כדי לפשט את ההליך.
3. כאשר העצם הדלילה רכה ושקופה, הפסק לקדוח. כאשר נוצר שקע גדול מספיק בעצם, עצור לעתים קרובות את הסיבוב ופקח על עובי העצם. הופעת סדקים בעצם מעידה על כך שדילול מספיק.
4. רחצו את החור במי מלח סטריליים ואז הסירו את עודפי המלח בעזרת צמר גפן. הסר את שכבת העצם הנותרת באמצעות מחט 27 גרם עם קצה בצורת וו / או באמצעות פינצטה עדינה. הימנע מפגיעה בדורא.
5. מכסים את פני הגולגולת בפיסת מגבת נייר סטרילית לחה במי מלח. הנח פיסת סרט נקי ושקוף על משטח גולגולת העכבר מעל הנייר.
6. הזז את הזרוע הסטריאוטקסית לאחור ומקם את מחט המיקרו-מזרק במקומה ישירות מעל הסרט. מוציאים את עודפי השמן עד שמגיעים לנפח של 2 מיקרוליטר.
   הערה: הנפח הסופי של השמן עשוי להשתנות בהתאם לנפח מזרק המיקרו. השתמשנו במזרק מיקרו 5 μL 75-RN Hamilton.
7. פיפטה נפח וירוס השווה לנפח המוזרק + 2 מיקרוליטר על פיסת סרט שקוף.
8. בהסתכלות דרך המיקרוסקופ הכירורגי, הורד את הזרוע כלפי מטה עד שקצה המחט נמצא במרכז טיפת הנגיף. טען את הנגיף לתוך המיקרו-מזרק באמצעות מזרק ממונע. השלך את קצה המיקרופיפטה והסרט השקוף לבקבוק עם אקונומיקה 2%.
9. הסר את הנייר הרטוב במי מלח מעל פני הגולגולת וייבש את הגולגולת בעזרת צמר גפן. השתמש בזרוע הסטריאוטקסית כדי למקם את המחט מעל מקום ההחדרה.
10. יש להוציא טיפה מהנגיף כדי לוודא שהמחט אינה סתומה. צור חריץ קטן בדורה באמצעות מחט 30 גרם עם קצה בצורת וו.
    הערה: חשוב ליצור את החריץ הקטן ביותר האפשרי בדורה מאטר, ולאפשר למחט להיכנס מבלי להשאיר רווח בין המחט לדורה מאטר, שממנו הנגיף עלול לדלוף.
11. הורד את מחט המזרק עד לדורה ובצע את החישובים המתאימים לעומק. העריכו את עומק קליפת המוח של ההחדרה ביחס לנקודה שבה המחט נגעה לראשונה בפני השטח של קליפת המוח.
12. הכנס לאט את קצה המחט לקליפת המוח לעומק של 300 מיקרומטר. המתן 2-3 דקות כדי לאפשר לדורה להיצמד למחט, ולאחר מכן החזר לאט את המחט לעומק של 200 מיקרומטר. המתן עוד 2-3 דקות כדי לאפשר לרקמת המוח להתייצב. התוצאה היא שהמחט מושכת את הדורה כלפי מעלה, ויוצרת מרחב תת-דוראלי להתפשטות הנגיף.
    הערה: כדי למזער את הנזק לקליפת המוח, השתמש במחט 33 גרם או במחטים נמוכות יותר. זכור שככל שהקוטר הפנימי של הקצה קטן יותר, כך גדל הסיכוי שזרימה חוזרת של רקמות תסתום אותו. חשוב להשתמש במחט קהה במקום משופעת מכיוון שמחט קהה מוציאה טיפה מבוקרת יותר של תמיסה ויראלית.
    1. אם המחט לא עוברת דרך הדורה מאטר כשהיא מונמכת ל 150-200 מיקרומטר ובמקום זאת מכופפת אותה, הפסק להנמיך. הרם את המחט ובצע חתך מעט גדול יותר בדורה מאטר, ולאחר מכן נסה להוריד את המחט שוב.
    2. אם נוזל המוח מתחיל לדלוף באופן פעיל מהחתך תוך כדי הורדת המחט, המתן עד שהוא יפסיק לדלוף; אחרת, קשה לשלוט במחט העוברת דרך הדורה. כתם את עודפי נוזל המוח עם קצה רקמה. ברגע שהנוזל מפסיק לזרום, הרם את המחט ונסה שוב.
13. התחל להזריק את התרחיף הנגיפי בקצב של 0.06 מיקרוליטר לדקה תוך ניטור הנפח המופץ. הזרקו 1 מיקרוליטר של נגיף. להזריק את הנגיף בעומק אחד על מנת לא לשבור את האיטום בין המחט לרקמת קליפת המוח.
    1. פתרון בעיות: בתחילת ההזרקה, עלולה להתרחש זרימה חוזרת של הנגיף אל פני השטח של המוח. הפסק להזריק, המתן 2-3 דקות ולאחר מכן המשך בהזרקת הנגיף. חזור על פעולות אלה (שלבים) עד שהזרימה החוזרת של הנגיף תיפסק. וירוסים ונוזלי מוח השדרה יידבקו למחט וימנעו זרימה חוזרת.
    2. דרך נוספת לעצור את הזרימה החוזרת של הנגיף, לשים כמות קטנה של אגרוז על פני קליפת המוח. זה ידכא את פעימת קליפת המוח וגם יעזור לאטום את המחט. אך וודאו כי הפיפטה אינה סתומה על ידי האגרוז.
    3. מכיוון שייתכן שהמחט לא תעבור במלואה דרך הדורה מאטר כאשר היא מונמכת, אלא רק באופן חלקי, ייתכן שצד אחד של המחט לא יתאים היטב לדורה, מה שעלול לגרום לזרימה חוזרת של הנגיף. במקרה זה, משוך לאט את המחט מהרקמה ונסה להוריד אותה שוב.
14. לאחר השלמת העירוי, שמור את המחט במיקום היעד למשך 10 דקות נוספות. זה מאפשר לנגיף להתפזר הרחק מאתר ההזרקה. הוצא את המחט מהמוח באיטיות כדי למנוע מהנגיף להציף בחזרה ממערכת המחט.
15. לאחר השלמת משיכת המחט, בדוק שהיא אינה סתומה על ידי הוצאת טיפה קטנה של נגיף. סגור את חתך העור באמצעות 5-0 תפרים נספגים או לא נספגים.

5. טיפול לאחר הניתוח

1. לאחר סגירת החתך יש למרוח משחה אנטיבקטריאלית באופן מקומי. יש להזריק תערובת של מי מלח (5 מ"ל/ק"ג) ו-5% גלוקוז (5 מ"ל/ק"ג) תת עורית כדי למנוע התייבשות ולהקל על ההחלמה לאחר ההרדמה. יש להזריק קטופרופן תוך שרירי (2.5 מ"ג/ק"ג) כדי להפחית את הכאב.
2. הניחו את החיה בכלוב טרי על גבי כרית חימום ועקבו אחריה עד שהיא מתאוששת מההרדמה. לאחר שהעכבר מגיב, הניחו את החיה בכלוב הביתי שלהם.

6. היסטולוגיה

1. לא לפני 21 יום לאחר הזרקת הנגיף יש להרדים עכברים עם איזופלורן כמתואר בשלב 3.
2. בצע חתך בקו האמצע (10-15 מ"מ) לאורך אזור בית החזה בעזרת מספריים צרים וחשוף את חלל החזה. הפרד בזהירות את הסרעפת ופתח את החזה בעזרת מספריים.
3. הכנס מחט 22G 1 1/2 לחדר השמאלי ובצע חתך באטריום הימני בעזרת מספריים. פרפיוז עם 50 מ"ל של 100 מ"מ מלח פוספט חוצץ (PBS) מקורר מראש, ואחריו 100 מ"ל של פורמלין 10% חוצץ מקורר מראש.
4. חלץ בזהירות את כל מוח העכבר. לשם כך, בצע חתך סגיטלי לאורך מרכז הקרקפת בעזרת מספריים. לאחר מכן, הסר את עצם הגולגולת חתיכה אחר חתיכה באמצעות צבת עצם עם קצוות שטוחים החל מההצטלבות של התפרים הסגיטלים והלמבדואידים וממשיכים קדימה לעצם האף. כאשר המוח חשוף, חתכו את פקעות הריח, שחררו את המוח בעזרת מרית מעוקלת והשליכו אותו לתוך שפופרת של 50 מ"ל המכילה 10% פורמלין חוצץ.
5. תקן את המוח בן לילה. הרכיבו את רקמת המוח על פלטפורמת מתכת של ויברטום באמצעות דבק רקמות. חותכים חלקים קדמיים בעובי של 50 מיקרומטר באמצעות להבי פלדת פחמן.

7. צביעה חיסונית

1. יום 1
   1. שטפו את פרוסות המוח 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS המכיל 0.3% טריטון X-100 (PBS-T). דגרו את החלקים ב-PBS-T למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   2. חסום קשירה לא ספציפית למשך שעה אחת ב-RT באמצעות מאגר חוסם המורכב מ-5% סרום עיזים רגיל (NGS) ו-0.3% טריטון X-100 ב-1x PBS.
   3. דגרו את החלקים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד פרוואלבומין או קלבינדין מדולל 1:500 במאגר החוסם (5% NGS ו-0.3% טריטון X-100 ב-1x PBS).
2. יום 2
   1. שטפו את החלקים 3 פעמים למשך 10 דקות ב-PBS-T. דגירה בחושך למשך שעתיים ב-RT עם נוגדנים משניים (עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 546) מדולל 1:500 במאגר החוסם (5% NGS ו-0.3% טריטון X-100 ב-1x PBS).
   2. שטפו את החלקים 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד ב-1x PBS. העבירו פרוסות מוח על שקופיות זכוכית בעזרת מברשת רכה.
   3. הוסף מיד 0.1 מ"ל של אמצעי הרכבה נגד דהייה לכל חלק. מכסים את הפרוסות בכיסוי בגודל 22 מ"מ על 50 מ"מ.
   4. הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי להגדלה של פי 20 או פי 60 (A/1.4, שמן). השתמש בלייזרים באורכי גל של 488 ננומטר ו-594 ננומטר כדי לרכוש תמונות רב-ערוציות של אזורי המוח המעניינים.

תוצאות

בסדרת ניסויים פיילוט, השתמשנו בשיטת ההזרקה התוך-קורטיקלית המסורתית כדי להמיר נוירונים פירמידליים בשכבה חמש בניאו-קורטקס העכבר על ידי AAV2 הנושא את הגן המהיר channelrhodopsin (oChIEF) שהתמזג עם חלבון פלואורסצנטי EGFP תחת מקדם CaMKII. בהתאם למאפיין האופייני של AAV2¹², קיבלנו...

Discussion

פיתחנו שיטה חדשה להתמרת נוירונים ניאו-קורטיקליים של עכברים על ידי הזרקת תרחיף של חלקיקים נגיפיים AAV2 לחלל התת-עכבישי של המוח. זה מספק תפוצה נרחבת של הנגיף, כמעט פי ארבעה מנפח הרקמה הנגועה כאשר אותה כמות של וירוס מוזרקת ישירות לפרנכימה של המוח.

הזרקת וקטורים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
10 µL Gastight Syringe Model 1701 RN (5 uL 75 RN Hamilton microsyringe)	Hamilton Company	Part/REF # 7634-01, Hamilton or cat no. HAM7634-01, Merck
33 G RN needle, point style 3	Hamilton Company	Part/REF # 7803-05, Hamilton
Binocular Microscope	Nikon or Micromed	Model MC-4 ZOOM
Cerna-based laser scanning confocal microscope	ThorLabs
Cold light source	RWD	Model 76312
Leica VT1000 S Vibrating blade microtome	Leica Biosystems	76001-014
Low-Flow Anesthesia System with starter kit	Kent Scientific Corporation	13-005-111 (Model SomnoSuite)
Mechanical Pipette 0.1 – 2.5 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000012
Mechanical Pipette 10 – 100 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000047
Mice Shaver	RWD	Model CP-5200
Microdrill with drill bits (0.5 mm, round)	RWD	78001, 78040
or Desctop Digital Stereotaxic Instrument, Mouse anesthesia Mask, Mouse ear bars (60 Deg)	RWD	Models 68027, 68665, 68306
Pressurized air	KUDO
Single Channel Manual Pipette 0.5-10 µL	RAINN	17008649
Small Animal Stereotaxic Instrument	KOPF	Model 962
Stereotaxic Injector	Stoelting	10-000-004
Surgical Instruments (Tools)
30 G dental needle (Ni-pro)	Biodent Co. Ltd.		To slit the dura
Bone scraper	Fine Science Tools	10075-16
Dental bur	DRENDEL + ZWEILING		For craniotomy; Shape: pear shaped/round end cylinder/round; Tip Diameter: 0.55-0.8 mm diameter
Needle holder (Halsey Micro Needle Holder)	Fine Science Tools	12500-12
Polypropylene Surgical Suture or Surgical Suture Vicryl (5-0, absorbable)	Walter Products (Ethicon)	S139044 (W9442)
Scalpel handle (#3) with scalpel blades (#11)	Fine Science Tools	10003-12, 10011-00
Scissors (Extra Narrow Scissors)	Fine Science Tools	14088-10	to cut the skin
Scissors (Fine Scissors)	Fine Science Tools	14094-11	to cut suture
Surgical suture PROLENE (Polyproptlene)	Ethicon (Johnson & Johnson)
Tweezers (Forceps #5)	Fine Science Tools	11252-20
Tweezers (Polished Inox Forceps)	Fine Science Tools	11210-20
Disposables
1 mL insulin syringe	SITEKMED		To load vaseline oil into a microsyringe, to administer drugs
Cell Culture Plate	SPL Life Science
Cotton swabs
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-545E
Insulin syringe needle (27 G)	SITEKMED		To remove debries from a hole (craniotomy)
Lint-free wipes CLEANWIPER	NetLink
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Paper towels	Luscan
Parafilm	StatLab	STLPM996
Sterile Surgical Gloves	Dermagrip
Drugs/Chemicals (Reagents)
10% buffered formalin or 4% paraformaldehyde	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK
Alcohol solution of iodine (5%))	Renewal
Antibiotic ointment Baneocin (bacitracin + neomycin)	Sandoz		Antibacterial agent for external use
Aqua Polymount	Poly-sciences	18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (Ophthalmic gel)	BAUSCH+LOMB (Santen)
Carboxylate-Modified FluoSphere Microspheres (red)	Thermo Fisher Scientific	F-8801
Dexamethasone (4 mg/mL)	Ellara (KRKA)		Synthetic glucocorticoid
Distilled H2O
Ethanol (70%)
Flexoprofen 2.5% (Ketoprofen)	VIC		Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs)
Glucose solution 5%	Solopharm
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A-11010
Isoflurane	Karizoo
lidocaine solution (2 % / 4%)	Solopharm
Normal Goat Serum (NGS)	Abcam	ab7481
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Eco-servis
Rabbit Anti-Parvalbumin Antibody	Merck Millipore	AB15736
Rabbit Recombinant Monoclonal anti-Calbindin antibody	Abcam	ab108404
Saline (0.9% NaCl in H2O)	Solopharm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	50-178-1844
Vaseline oil	Genel