Trasduzione diffusa dei neuroni neocorticali di topo mediante iniezione subaracnoidea di AAV2

Riepilogo

Viene descritta una nuova tecnica per la somministrazione diffusa di virus adeno-associato che utilizza l'infusione di virus subaracnoideo. Questo metodo non solo garantisce una diffusa trasduzione dei neuroni neocorticali di topo negli strati superficiali, ma si traduce anche in un'espressione selettiva del transgene nei neuroni piramidali di quinto strato, anche quando si utilizza un promotore non selettivo.

Abstract

I virus adeno-associati ricombinanti sono uno strumento flessibile e potente per la consegna e l'espressione di vari geni di interesse in molte aree della biologia sperimentale, in particolare nelle neuroscienze. Il metodo più popolare per guidare l'espressione di un transgene desiderato in una particolare area del cervello è quello di iniettare un vettore AAV direttamente nel parenchima cerebrale. Tuttavia, questo metodo non consente una trasduzione neuronale diffusa che è necessaria per alcuni esperimenti in vivo . In questo articolo, presentiamo una nuova tecnica per l'espressione genica diffusa nella neocorteccia murina basata sull'infusione virale nello spazio subaracnoideo del cervello. Questo metodo di marcatura neuronale non solo garantisce una diffusa trasduzione dei neuroni negli strati neocorticali superficiali del topo adulto, ma provoca anche l'espressione del transgene in un'ampia popolazione di neuroni piramidali di quinto strato con elevata specificità anche quando si utilizza un forte promotore non selettivo come la CAG. Inoltre, poiché la trasduzione cellulare avviene a una distanza significativa dal sito di iniezione, questo metodo può aiutare a preservare il tessuto cerebrale per le successive registrazioni ottiche o elettrofisiologiche dell'attività neuronale.

Introduzione

Il cervello dei mammiferi è costituito da molte cellule inibitorie, eccitatorie e modulatorie interconnesse in circuiti da trilioni di sinapsi¹. Una delle sfide centrali delle neuroscienze è quella di decodificare il ruolo di tipi di cellule distinte nell'organizzazione e nella funzione dei circuiti cerebrali e del comportamento. La manipolazione di cellule geneticamente definite all'interno del cervello richiede metodi per introdurre ed esprimere i transgeni. I sistemi di consegna genica su base virale sono di gran lunga il metodo più efficace e semplice per la consegna di geni nel sistema nervoso centrale². I sistemi di rilascio virale si basano su virus replicanti (adenovirus, virus adeno-associati (AAV), lentivirus e retrovirus) che hanno la capacità di fornire informazioni genetiche in una cellula ospite ^2,3.

I vettori basati su AAV sono ora diventati uno degli strumenti più utilizzati per la consegna dei transgeni desiderati alle cellule all'interno del cervello, sia per scopi di ricerca neuroscientifica di base che per sviluppare la terapia genica per le malattie neurologiche. Rispetto ad altri virus, gli AAV difettosi di replicazione possiedono molte caratteristiche che li rendono vettori ideali per questi scopi. In particolare, i vettori AAV trasducono in modo efficiente le cellule non in divisione (differenziate terminalmente) come i neuroni e le cellule gliali, determinando alti livelli di espressione transgenica nel vivo². I vettori possono essere facilmente prodotti ad un alto titolo funzionale adatto per l'uso in vivo ^3,4,5. È importante sottolineare che la somministrazione genica mediata da virus adeno-associati in vivo non produce alterazioni istopatologiche e tossicità correlata al vettore⁶. A differenza dei vettori adenovirali, la somministrazione in vivo di vettori AAV in modelli animali di solito non suscita risposte immunitarie dell'ospite contro le cellule trasdotte, consentendo un'espressione transgenica stabile all'interno del parenchima cerebrale per lunghi periodi di tempo ^2,7,8.

Un'altra ragione per la popolarità dei vettori AAV è l'ampia gamma di sierotipi AAV con tropismi unici di tipo tissutale e cellulare 9,10,11,12,13,14. Proteine del capside distinte espresse da diversi sierotipi di AAV determinano l'uso di diversi recettori di superficie cellulare per l'ingresso cellulare e, quindi, tropismi specifici^10,14.

Il tropismo degli AAV è determinato non solo dalle proteine del capside, ma da molti altri fattori¹⁴. E' stato dimostrato che i sierotipi AAV 1, 2, 6, 7, 8 e 9 trasducono sia i neuroni che gli astrociti in coltura primaria^15,16, ma mostrano un forte trofismo neuronale dopo l'iniezione cerebrale intraparenchimale^17,18. Il metodo utilizzato per la preparazione del vettore AAV può anche influenzare il tropismo delle cellule nervose, anche per lo stesso sierotipo. Ad esempio, l'AAV8 purificato con CsCl possedeva un forte tropismo astrogliale dopo l'iniezione cerebrale intraparenchimale, mentre l'AAV8 purificato con iodixanolo, iniettato in condizioni identiche, trasduceva solo i neuroni¹⁹. Il tropismo dell'AAV può anche essere influenzato dalla dose iniettata e dal volume¹⁴. Ad esempio, rAAV2/1 ad alto titolo ha trasdotto in modo efficiente sia i neuroni eccitatori corticali che quelli inibitori, ma l'uso di titoli più bassi ha esposto una forte preferenza per la trasduzione dei neuroni inibitori corticali²⁰.

Pertanto, non è possibile ottenere una robusta specificità del tipo cellulare basata esclusivamente sul sierotipo del capside. I promotori specifici del tipo di cellula possono essere utilizzati per superare l'ampio tropismo naturale del capside AAV. Ad esempio, la sinapsina I umana viene utilizzata per colpire i neuroni²¹, il promotore CaMKII può guidare l'espressione transgenica nei neuroni eccitatori glutammatergici con elevata specificità²⁰, il promotore ppHcrt prende di mira i neuroni che esprimono l'ipocretina (HCRT) nell'ipotalamo laterale²², il promotore PRSx8 prende di mira i neuroni noradrenergici e adrenergici che esprimono dopamina beta-idrossilasi²³ e il promotore GFAP può guidare l'espressione astrocitaria-specifica²⁴. Tuttavia, alcuni promotori cellulo-specifici hanno una debole attività trascrizionale e non possono guidare livelli sufficienti di espressione transgenica²⁵. Inoltre, i promotori corti che si adattano ai vettori virali AAV spesso non mantengono la specificità del tipo cellulare ^1,26. Ad esempio, è stato dimostrato che un costrutto CaMKII trasduce anche i neuroni inibitori¹².

Oltre alla specificità del tipo cellulare (tropismo), un'altra caratteristica significativa degli AAV è l'efficienza di trasduzione. I vari sierotipi di AAV hanno proprietà diffusionali diverse. AAV2 e quattro vettori virali si diffondono meno facilmente attraverso il parenchima cerebrale e, quindi, mediano la trasduzione su un'area più piccola^17,27. La trasduzione neuronale più diffusa si osserva con i sierotipi AAV 1, 9 e rh.10 11,17,18,19,28.

Il metodo più popolare per guidare l'espressione di un transgene desiderato in una particolare area cerebrale consiste nell'iniettare il vettore AAV direttamente nella regione cerebrale di interesse (parenchima)³. Dopo l'iniezione intraparenchimale, anche i sierotipi di AAV con una diffusione più efficace attraverso il cervello trasducono tipicamente solo un'area locale intorno al sito di iniezione ¹². Inoltre, l'iniezione intraparenchimale è una procedura invasiva e porta a danni tissutali adiacenti alla regione di interesse. Pertanto, questo metodo di iniezione del virus non è adatto per alcuni compiti sperimentali. Ad esempio, l'etichettatura estesa delle cellule è altamente desiderabile negli esperimenti volti a studiare le funzioni dei neuroni corticali in animali che si muovono liberamente, anche con l'uso della microscopia a uno o due fotoni 29,30,31,32.

Qui, descriviamo una nuova tecnica di iniezione di virus adeno-associato che utilizza l'infusione di virus subaracnoideo per fornire una trasduzione diffusa dei neuroni neocorticali nei topi adulti e preservare il tessuto cerebrale per le successive registrazioni ottiche o elettrofisiologiche dell'attività neuronale. Questo metodo non solo ha assicurato una diffusa trasduzione dei neuroni negli strati neocorticali superficiali, ma ha portato all'espressione del transgene in un'ampia popolazione di neuroni piramidali di quinto strato con elevata specificità anche quando si utilizza un forte promotore non selettivo come la CAG.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi adulti C57Black/6, di età compresa tra 2 e 4 mesi, di entrambi i sessi (Pushchino Breeding Center, Branch of the Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS). I topi sono stati alloggiati in un vivaio a temperatura controllata (22 °C ± 2 °C, ciclo luce/buio di 12 ore, luci accese alle 08.00) con cibo e acqua ad libitum. Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida ARRIVE e la direttiva 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'IHNA RAS (protocollo N1 del 01.02.2022). È stato fatto ogni sforzo per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e per garantire l'affidabilità dei risultati.

1. Preparazione per l'intervento chirurgico

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'inizio dell'intervento. Pulire l'area chirurgica utilizzando etanolo al 70%.
2. Controllare il livello di isoflurano nel sistema di anestesia e riempirlo se necessario. Posizionare un tovagliolo di carta pulito sul fondo della camera di induzione.
3. Posizionare un termoforo sul telaio stereotassico. Copri il tampone con un tovagliolo di carta pulito.
4. Prepara un flacone con il 2% di candeggina per raccogliere puntali per micropipette, tubi, tamponi di cotone e altri oggetti che entrano in contatto con il virus.
5. Togliere un'aliquota di AAV dal congelatore a -80 °C e metterla sul ghiaccio per scongelarla.

2. Preparazione della siringa

1. Pulire una microsiringa Hamilton da 5 μL con un ago RN smussato da 33G. Aspirare e poi erogare etanolo al 70%. Ripetere 3 volte con etanolo fresco. Sciacquare la siringa con acqua distillata per rimuovere l'etanolo in eccesso. Ripeti 3 volte.
2. Estrarre lo stantuffo e riempire il fusto con olio di vaselina attraverso la flangia utilizzando una siringa da insulina. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella microsiringa.
   NOTA: L'aria intrappolata è comprimibile e influisce sull'accuratezza e la precisione della siringa.
3. Rimettere lo stantuffo nella microsiringa ed erogare una goccia di olio. Posizionare la siringa nell'iniettore stereotassico in modo che la scala sia visibile per monitorare il volume di soluzione erogata.

3. Preparazione dei topi per la chirurgia

1. Pesa un topo. Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia collegata all'isoflurano. Accendi il vaporizzatore di isoflurano impostato al 5% e regola la portata a 250 ml/min. Un'adeguata profondità di anestesia si ottiene entro 5-7 minuti.
2. Per verificare il livello chirurgico di anestesia, verificare l'assenza di battito e riflesso di ritiro durante un pizzico doloroso della zampa posteriore e l'assenza di battito di ciglia al contatto visivo.
3. Commutare la valvola di deflusso del vaporizzatore dalla camera di induzione alla maschera stereotassica. Ridurre l'isoflurano all'1,8%-2,0% e impostare la portata in base al peso del topo (70-90 ml/min per topi di peso compreso tra 25 e 35 g).
4. Estrarre il topo dalla camera di induzione e posizionarlo nell'apparecchio stereotassico sopra un termoforo (37 °C) per prevenire l'ipotermia durante l'anestesia chirurgica. Posizionare i denti anteriori nella barra dei denti e quindi montare la maschera per animali.
5. Posizionare con cura l'animale sulle barre auricolari. La corretta posizione della testa nell'apparato stereotassico consente il movimento verticale ma non laterale della testa. Assicurarsi che il posizionamento dell'animale non causi angoscia. Monitorare attentamente la profondità dell'anestesia, la respirazione degli animali e la temperatura corporea durante l'operazione.
6. Radere la testa dagli occhi a dietro le orecchie. Pulire la superficie rasata della testa tamponando con etanolo al 70%, seguito da tampone con una soluzione alcolica al 5% di iodio.
7. Applicare il gel oftalmico per prevenire la secchezza degli occhi. Applicare una soluzione di lidocaina al 4% per via topica e desametasone (0,02 ml a 4 mg/ml) per via sottocutanea per prevenire il dolore correlato all'intervento chirurgico e ridurre la possibile risposta infiammatoria.
8. Con una lama di bisturi sterile e delle forbici, praticare un'incisione lunga 4-5 mm lungo la linea mediana della testa per aprire il cuoio capelluto. Inizia con una piccola incisione tra le orecchie e poi espandila usando le forbici per evitare danni al cranio.
9. Tampona la superficie del cranio con una piccola quantità di perossido di idrogeno al 3% per visualizzare i punti di riferimento stereotassici: bregma e lambda. Interrompere immediatamente la reazione con soluzione salina di NaCl allo 0,9%. Raschiare via i tessuti sulla parte superiore del cranio con un raschietto osseo.
10. Montare l'iniettore motorizzato pre-preparato con la siringa Hamilton sul braccio stereotassico. Dirigere una fonte di luce chirurgica sul cranio esposto e focalizzare il microscopio sul bregma.
11. Guardando attraverso il microscopio, manipolare il braccio dell'apparato stereotassico per centrare la parte superiore dell'ago direttamente sopra il bregma.
12. Usando la punta dell'ago, allinea orizzontalmente la bregma e la lambda, quindi riporta il braccio alla bregma e registra le coordinate. Utilizzare queste coordinate bregma e le coordinate dell'atlante della regione di interesse per calcolare le coordinate relative dell'area di destinazione.
13. Sposta l'ago nell'area mirata. Abbassa l'ago alle nuove coordinate e segna questa posizione. Selezionare il sito per la microiniezione virale in prossimità dell'area bersaglio, considerando la diffusione del virus.
    NOTA: In questo modo si eviterà di danneggiare il tessuto nella regione di interesse. Abbiamo utilizzato le seguenti coordinate per la regione di interesse: AP-3.4, ML -2.0 e per la microiniezione virale: AP-2.0, ML -1.4. Le coordinate di cui sopra sono ottimali se i neuroni primari della corteccia visiva devono essere infettati.
14. Se possibile, evitare le regioni con vasi sanguigni di grandi dimensioni. Sotto un microscopio operatorio, un'illuminazione a luce fredda e intensa e un'immersione salina di NaCl allo 0,9%, dovrebbero diventare evidenti grandi vasi sanguigni nel cranio e sulla superficie del cervello.

4. Iniezione di virus

1. Prendi una fresa dentale sterile (0,5 - 0,8 mm di diametro). Osservando la superficie del cranio attraverso il microscopio operatorio, praticare una piccola craniotomia manualmente (a mano) o utilizzando un microtrapano. Fare attenzione a non esercitare una pressione eccessiva sul cranio.
2. Spostare il braccio in modo che non sia d'intralcio per evitare danni all'ago della microsiringa durante la perforazione della craniotomia (foro). Applicare l'immersione salina di NaCl allo 0,9% e fare una pausa intermittente per evitare di riscaldare l'osso e danneggiare la dura madre. Utilizzare aria pressurizzata per soffiare via la polvere ossea.
   NOTA: Sono adatti i seguenti tipi di frese dentali in metallo duro: a forma di pera (preferibilmente), cilindrica arrotondata e rotonda.
   1. Quando si assottiglia l'osso con la fresa, assicurarsi che il diradamento sia uniforme su tutta la circonferenza. In questo modo sarà più facile rimuovere l'osso senza danneggiare la dura madre. Per fare ciò, utilizzare inizialmente una fresa con una punta rotonda e poi una fresa con una punta piatta. Tenere la fresa perpendicolare all'osso; in caso contrario, un lato sarà più sottile dell'altro.
      NOTA: Inoltre, minore è la dimensione della fresa e più piccola è la craniotomia eseguita, più complessa sarà la manipolazione. Si raccomanda di eseguire una craniotomia di diametro inferiore (0,5-0,6 mm) quando si utilizza ulteriormente l'animale per il lavoro in vivo . Se si prevede di utilizzare il cervello dell'animale per lavori ex vivo , è accettabile un diametro della craniotomia maggiore per semplificare la procedura.
3. Quando l'osso assottigliato è morbido e trasparente, smetti di perforare. Quando si forma una rientranza sufficientemente grande nell'osso, interrompere frequentemente la rotazione e monitorare lo spessore dell'osso. La comparsa di crepe nell'osso indica che l'assottigliamento è sufficiente.
4. Bagnare il foro con soluzione fisiologica sterile e quindi rimuovere la soluzione salina in eccesso con un batuffolo di cotone. Rimuovere lo strato rimanente di osso utilizzando un ago da 27 G con punta a forma di uncino e/o utilizzando una pinzetta a punta fine. Evitare di danneggiare la dura.
5. Copri la superficie del cranio con un pezzo di carta assorbente sterile inumidito con soluzione fisiologica. Posiziona un pezzo di pellicola trasparente e pulita sulla superficie del teschio del topo sopra la carta.
6. Spostare indietro il braccio stereotassico e posizionare l'ago della microsiringa in posizione direttamente sopra la pellicola. Erogare l'olio in eccesso fino a raggiungere un volume di 2 μl.
   NOTA: Il volume finale dell'olio può variare in base al volume della micro siringa. Abbiamo utilizzato una micro siringa Hamilton 75-RN da 5 μl.
7. Pipettare un volume di virus pari al volume iniettato + 2 μL su un pezzo di pellicola trasparente.
8. Guardando attraverso il microscopio operatorio, abbassa il braccio fino a quando la punta dell'ago non si trova al centro della goccia del virus. Caricare il virus nella microsiringa utilizzando un iniettore motorizzato. Smaltire la punta della micropipetta e la pellicola trasparente nel flacone con il 2% di candeggina.
9. Rimuovere la carta inumidita con soluzione fisiologica dalla superficie del cranio e asciugare il cranio con un batuffolo di cotone. Utilizzare il braccio stereotassico per posizionare l'ago sopra il sito di inserimento.
10. Erogare una goccia del virus per assicurarsi che l'ago non sia ostruito. Fai una piccola fessura nella dura madre usando un ago da 30 g con punta a forma di uncino.
    NOTA: È importante praticare la fessura più piccola possibile nella dura madre, consentendo all'ago di entrare senza lasciare uno spazio tra l'ago e la dura madre, da cui il virus potrebbe fuoriuscire.
11. Abbassare l'ago della siringa fino alla dura madre ed effettuare i calcoli appropriati per la profondità. Stimare la profondità corticale dell'inserzione rispetto al punto in cui l'ago ha toccato per la prima volta la superficie della corteccia.
12. Inserire lentamente la punta dell'ago nella corteccia fino a una profondità di 300 μm. Attendere 2-3 minuti per consentire alla dura madre di aderire all'ago, quindi ritrarre lentamente l'ago fino a una profondità di 200 μm. Attendere altri 2-3 minuti per consentire al tessuto cerebrale di stabilizzarsi. Ciò fa sì che l'ago tiri verso l'alto la dura madre, creando uno spazio subdurale per la diffusione del virus.
    NOTA: Per ridurre al minimo il danno corticale, utilizzare un ago da 33 G o aghi con G inferiore. Tieni presente che più piccolo è il diametro interno della punta, maggiore è la possibilità che il riflusso dei tessuti la ostruisca. È importante utilizzare un ago smussato invece di smussato perché un ago smussato espelle una goccia più controllata di soluzione virale.
    1. Se l'ago non passa attraverso la dura madre quando viene abbassato a 150-200 μm e invece la piega, interrompere l'abbassamento. Solleva l'ago e fai un'incisione leggermente più grande nella dura madre, quindi prova ad abbassare di nuovo l'ago.
    2. Se il liquido cerebrospinale inizia a fuoriuscire attivamente dall'incisione durante l'abbassamento dell'ago, attendere che smetta di fuoriuscire; In caso contrario, è difficile controllare l'ago che passa attraverso la dura. Tamponare il liquido cerebrospinale in eccesso con la punta di un fazzoletto. Una volta che il fluido smette di scorrere, sollevare l'ago e riprovare.
13. Iniziare a iniettare la sospensione virale a una velocità di 0,06 μL/min monitorando il volume erogato. Iniettare 1 μL di virus. Iniettare il virus a una singola profondità per non rompere il sigillo tra l'ago e il tessuto della corteccia.
    1. Risoluzione dei problemi: all'inizio dell'iniezione, può verificarsi un riflusso del virus sulla superficie cerebrale. Interrompere l'iniezione, attendere 2-3 minuti e quindi continuare l'iniezione del virus. Ripetere queste azioni (passaggi) fino a quando il riflusso del virus non si interrompe. Il virus e i liquidi cerebrospinali si attaccheranno all'ago e impediranno il riflusso.
    2. Un altro modo per fermare il riflusso del virus, mettere una piccola quantità di agarosio sulla superficie della corteccia. Sopprimerà la pulsazione della corteccia e aiuterà anche a sigillare l'ago. Ma assicurati che la pipetta non sia ostruita dall'agarosio.
    3. Poiché l'ago potrebbe non passare completamente attraverso la dura madre quando viene abbassato, ma solo parzialmente, un lato dell'ago potrebbe non aderire perfettamente alla dura madre, il che può causare il riflusso del virus. In questo caso, ritirare lentamente l'ago dal tessuto e provare ad abbassarlo di nuovo.
14. Una volta completata l'infusione, tenere l'ago nella posizione target per altri 10 minuti. Ciò consente al virus di disperdersi lontano dal sito di iniezione. Ritrarre lentamente l'ago dal cervello per evitare che il virus fuoriesca dal tratto dell'ago.
15. Una volta completato il prelievo dell'ago, verificare che non sia ostruito dispensando una piccola goccia di virus. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando suture 5-0 assorbibili o non assorbibili.

5. Assistenza post-operatoria

1. Dopo aver chiuso l'incisione, applicare l'unguento antibatterico per via topica. Iniettare una miscela di soluzione fisiologica (5 ml/kg) e glucosio al 5% (5 ml/kg) per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e facilitare il recupero dopo l'anestesia. Iniettare ketoprofene per via intramuscolare (2,5 mg/kg) per ridurre il dolore.
2. Metti l'animale in una gabbia fresca sopra un termoforo e monitora fino a quando non si riprende dall'anestesia. Dopo che il topo è reattivo, metti l'animale nella gabbia di casa.

6. Istologia

1. Non prima di 21 giorni dopo l'iniezione del virus, anestetizzare profondamente i topi con isoflurano come descritto nel passaggio 3.
2. Praticare un'incisione sulla linea mediana (10-15 mm) lungo la regione toracica utilizzando forbici strette ed esporre la cavità toracica. Separare con cura il diaframma e aprire il torace usando le forbici.
3. Inserire un ago da 22G 1 1/2 nel ventricolo sinistro e praticare un'incisione nell'atrio destro con le forbici. Perfondere con 50 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 100 mM pre-refrigerata, seguiti da 100 mL di formalina tamponata al 10% pre-refrigerata.
4. Estrai con cura l'intero cervello del topo. Per fare questo, fai un'incisione sagittale lungo il centro del cuoio capelluto usando le forbici. Quindi, rimuovere l'osso cranico pezzo per pezzo utilizzando una pinza per ossa con punte piatte iniziando dall'intersezione delle suture sagittale e lambdoidea e procedendo in avanti fino all'osso nasale. Quando il cervello è esposto, tagliare i bulbi olfattivi, allentare il cervello con una spatola curva e immergerlo in una provetta da 50 ml contenente il 10% di formalina tamponata.
5. Ripara il cervello durante la notte. Montare il tessuto cerebrale su una piattaforma metallica di un vibratomo utilizzando un adesivo per tessuti. Tagliare sezioni frontali ad uno spessore di 50 μm utilizzando lame in acciaio al carbonio.

7. Immunocolorazione

1. Giorno 1
   1. Lavare le fette di cervello 3 volte per 5 minuti ciascuna con 1 PBS contenente lo 0,3% di Triton X-100 (PBS-T). Incubare le sezioni in PBS-T per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
   2. Bloccare il legame aspecifico per 1 ora a RT utilizzando un tampone bloccante composto al 5% da siero normale di capra (NGS) e allo 0,3% da Triton X-100 in 1x PBS.
   3. Incubare le sezioni per una notte a 4 °C con anticorpi primari contro parvalbumina o calbindina diluiti 1:500 nel tampone bloccante (5% NGS e 0,3% Triton X-100 in 1x PBS).
2. Giorno 2
   1. Lavare le sezioni 3 volte per 10 minuti in PBS-T. Incubare al buio per 2 ore a RT con anticorpi secondari (Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546) diluiti 1:500 nel tampone bloccante (5% NGS e 0,3% Triton X-100 in 1x PBS).
   2. Lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna in 1 PBS. Trasferire le fette di cervello su vetrini usando un pennello morbido.
   3. Aggiungere immediatamente 0,1 mL di terreno di montaggio antisbiadimento a ciascuna sezione. Coprire le fette con un vetrino coprioggetti da 22 mm x 50 mm.
   4. Configurare il microscopio confocale su un ingrandimento di 20x o 60x (A/1,4, olio). Utilizza laser con lunghezza d'onda di 488 nm e 594 nm per acquisire immagini multicanale delle regioni cerebrali di interesse.

Risultati

In una serie pilota di esperimenti, abbiamo utilizzato il tradizionale metodo di iniezione intracorticale per trasdurre i neuroni piramidali dello strato cinque nella neocorteccia murina mediante AAV2 che trasporta il gene della canalrodopsina veloce (oChIEF) fuso con la proteina fluorescente EGFP sotto il promotore CaMKII. Coerentemente con la caratteristica di AAV2¹², abbiamo ottenuto un'area di infezione relativamente piccola, non superiore a 1 mm di l...

Discussione

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per trasdurre i neuroni neocorticali di topo iniettando una sospensione di particelle virali AAV2 nello spazio subaracnoideo del cervello. Ciò fornisce una distribuzione diffusa del virus, quasi quattro volte maggiore del volume del tessuto infettato quando la stessa quantità di virus viene iniettata direttamente nel parenchima cerebrale.

L'iniezione di vettori virali direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF) attraverso...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
10 µL Gastight Syringe Model 1701 RN (5 uL 75 RN Hamilton microsyringe)	Hamilton Company	Part/REF # 7634-01, Hamilton or cat no. HAM7634-01, Merck
33 G RN needle, point style 3	Hamilton Company	Part/REF # 7803-05, Hamilton
Binocular Microscope	Nikon or Micromed	Model MC-4 ZOOM
Cerna-based laser scanning confocal microscope	ThorLabs
Cold light source	RWD	Model 76312
Leica VT1000 S Vibrating blade microtome	Leica Biosystems	76001-014
Low-Flow Anesthesia System with starter kit	Kent Scientific Corporation	13-005-111 (Model SomnoSuite)
Mechanical Pipette 0.1 – 2.5 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000012
Mechanical Pipette 10 – 100 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000047
Mice Shaver	RWD	Model CP-5200
Microdrill with drill bits (0.5 mm, round)	RWD	78001, 78040
or Desctop Digital Stereotaxic Instrument, Mouse anesthesia Mask, Mouse ear bars (60 Deg)	RWD	Models 68027, 68665, 68306
Pressurized air	KUDO
Single Channel Manual Pipette 0.5-10 µL	RAINN	17008649
Small Animal Stereotaxic Instrument	KOPF	Model 962
Stereotaxic Injector	Stoelting	10-000-004
Surgical Instruments (Tools)
30 G dental needle (Ni-pro)	Biodent Co. Ltd.		To slit the dura
Bone scraper	Fine Science Tools	10075-16
Dental bur	DRENDEL + ZWEILING		For craniotomy; Shape: pear shaped/round end cylinder/round; Tip Diameter: 0.55-0.8 mm diameter
Needle holder (Halsey Micro Needle Holder)	Fine Science Tools	12500-12
Polypropylene Surgical Suture or Surgical Suture Vicryl (5-0, absorbable)	Walter Products (Ethicon)	S139044 (W9442)
Scalpel handle (#3) with scalpel blades (#11)	Fine Science Tools	10003-12, 10011-00
Scissors (Extra Narrow Scissors)	Fine Science Tools	14088-10	to cut the skin
Scissors (Fine Scissors)	Fine Science Tools	14094-11	to cut suture
Surgical suture PROLENE (Polyproptlene)	Ethicon (Johnson & Johnson)
Tweezers (Forceps #5)	Fine Science Tools	11252-20
Tweezers (Polished Inox Forceps)	Fine Science Tools	11210-20
Disposables
1 mL insulin syringe	SITEKMED		To load vaseline oil into a microsyringe, to administer drugs
Cell Culture Plate	SPL Life Science
Cotton swabs
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-545E
Insulin syringe needle (27 G)	SITEKMED		To remove debries from a hole (craniotomy)
Lint-free wipes CLEANWIPER	NetLink
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Paper towels	Luscan
Parafilm	StatLab	STLPM996
Sterile Surgical Gloves	Dermagrip
Drugs/Chemicals (Reagents)
10% buffered formalin or 4% paraformaldehyde	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK
Alcohol solution of iodine (5%))	Renewal
Antibiotic ointment Baneocin (bacitracin + neomycin)	Sandoz		Antibacterial agent for external use
Aqua Polymount	Poly-sciences	18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (Ophthalmic gel)	BAUSCH+LOMB (Santen)
Carboxylate-Modified FluoSphere Microspheres (red)	Thermo Fisher Scientific	F-8801
Dexamethasone (4 mg/mL)	Ellara (KRKA)		Synthetic glucocorticoid
Distilled H2O
Ethanol (70%)
Flexoprofen 2.5% (Ketoprofen)	VIC		Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs)
Glucose solution 5%	Solopharm
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A-11010
Isoflurane	Karizoo
lidocaine solution (2 % / 4%)	Solopharm
Normal Goat Serum (NGS)	Abcam	ab7481
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Eco-servis
Rabbit Anti-Parvalbumin Antibody	Merck Millipore	AB15736
Rabbit Recombinant Monoclonal anti-Calbindin antibody	Abcam	ab108404
Saline (0.9% NaCl in H2O)	Solopharm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	50-178-1844
Vaseline oil	Genel