AAV2의 지주막하 주입에 의한 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입

요약

지주막하 바이러스 주입을 사용하는 아데노 관련 바이러스의 광범위한 전달을 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 이 방법은 표재층에서 마우스 신피질 뉴런의 광범위한 형질도입을 보장할 뿐만 아니라 비선택적 프로모터를 사용하는 경우에도 5층 피라미드 뉴런에서 전이유전자의 선택적 발현을 초래합니다.

초록

재조합 아데노 관련 바이러스는 실험 생물학의 많은 영역, 특히 신경 과학에서 다양한 관심 유전자의 전달 및 발현을 위한 유연하고 강력한 도구입니다. 특정 뇌 영역에서 원하는 전이유전자의 발현을 유도하는 가장 인기 있는 방법은 AAV 벡터를 뇌 실질에 직접 주입하는 것입니다. 그러나 이 방법은 일부 생체 내 실험에 필요한 광범위한 신경 세포 전달을 허용하지 않습니다. 이 기사에서는 뇌의 지주막하 공간으로의 바이러스 주입을 기반으로 마우스 신피질에서 광범위한 유전자 발현을 위한 새로운 기술을 제시합니다. 이 뉴런 라벨링 방법은 성체 마우스의 표재성 신피질층에서 뉴런의 광범위한 transduction을 보장할 뿐만 아니라 CAG와 같은 강력한 비선택적 프로모터를 사용하는 경우에도 높은 특이성을 가진 높은 특이성을 가진 많은 5층 피라미드 뉴런 집단에서 transgene의 발현을 초래합니다. 더욱이, 세포 형질도입은 주사 부위로부터 상당한 거리에서 이루어지기 때문에, 이 방법은 뉴런 활동의 차후 광학적 또는 전기생리학적 기록을 위해 뇌 조직을 보존하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

포유류의 뇌는 수조 개의 시냅스에 의해 회로로 상호 연결된 많은 억제 세포, 흥분성 세포, 조절 세포로 구성되어 있습니다¹. 신경과학의 핵심 과제 중 하나는 뇌 회로와 행동의 조직과 기능에서 뚜렷한 세포 유형의 역할을 해독하는 것입니다. 뇌 내에서 유전적으로 정의된 세포를 조작하려면 전이유전자를 도입하고 발현하는 방법이 필요합니다. 바이러스 기반 유전자 전달 시스템은 중추 신경계로 유전자를 전달하는 가장 효과적이고 간단한 방법입니다². 바이러스 전달 시스템은 유전 정보를 숙주 세포에 전달할 수 있는 능력을 가진 복제 바이러스(아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스 및 레트로바이러스)를 기반으로 합니다 ^2,3.

AAV 기반 벡터는 이제 기초 신경과학 연구 목적과 신경 질환에 대한 유전자 요법을 개발하기 위해 뇌 내 세포에 원하는 전이유전자를 전달하는 데 가장 널리 사용되는 도구 중 하나가 되었습니다. 다른 바이러스와 비교할 때, 복제 결함 AAV는 이러한 목적에 이상적인 벡터가 되는 많은 기능을 가지고 있습니다. 특히 AAV vector는 뉴런 및 신경교세포와 같은 비분열(말단 분화) 세포를 효율적으로 transduction하여 in vivo²에서 높은 수준의 transgene 발현을 제공합니다. 벡터는 in vivo 사용 ^3,4,5에 적합한 고기능성 역가에서 쉽게 생산할 수 있습니다. 중요한 것은 아데노 관련 바이러스 매개 유전자 in vivo 전달이 조직병리학적 변화 및 벡터 관련 독성을 일으키지 않는다는 것입니다⁶. 아데노바이러스 벡터와 달리, 동물 모델에서 AAV 벡터의 생체 내 투여는 일반적으로 형질도입된 세포에 대한 숙주 면역 반응을 유도하지 못하므로 장기간 동안 뇌 실질 내에서 안정적인 전이유전자 발현이 가능합니다 ^2,7,8.

AAV 벡터가 인기 있는 또 다른 이유는 고유한 조직 및 세포형 tropisms 9,10,11,12,13,14를 가진 광범위한 AAV serotype입니다. 서로 다른 AAV serotype에 의해 발현되는 뚜렷한 capsid 단백질은 세포 진입을 위해 서로 다른 세포 표면 수용체를 사용하게 되며, 따라서 특이적 tropisms^10,14를 생성합니다.

AAV tropism은 capsid proteins뿐만 아니라 다른 많은 요인에 의해 결정된다¹⁴. AAV 혈청형 1, 2, 6, 7, 8 및 9는 1차 배양에서 뉴런과 성상세포를 모두 형질도입했지만^(15,16), 실질내 뇌 주입 후 강한 뉴런 트로피즘을 나타냈습니다 ^17,18. AAV 벡터 준비에 사용되는 방법은 동일한 혈청형에 대해서도 신경 세포 영양성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, CsCl-purified AAV8은 뇌실실내 주사 후 강력한 성상아교세포(astroglial tropism)를 가졌던 반면, 동일한 조건에서 주입된 iodixanol-purified AAV8은 뉴런만 transduction했다¹⁹. AAV tropism은 또한 주입 된 용량과 볼륨¹⁴의 영향을받을 수 있습니다. 예를 들어, 높은 역가 rAAV2/1은 대뇌피질 흥분성 뉴런과 억제성 뉴런 모두를 효율적으로 형질전환시켰지만, 낮은 역가의 사용은 피질 억제 뉴런의 형질도입에 대한 강한 선호를 드러냈다²⁰.

따라서 capsid serotype만을 기반으로 강력한 세포 유형 특이성을 달성할 수 없습니다. 세포 유형 특이적 프로모터는 AAV 캡시드의 광범위한 자연 영양성을 극복하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 인간 synapsin I은 뉴런을 표적으로 하는 데 사용된다²¹, CaMKII promoter는 높은 특이성²⁰으로 glutamatergic excitatory neuron에서 전이유전자 발현을 유도할 수 있다 20, ppHcrt promoter는 외측 시상하부(lateral hypothalamus²²)에서 하이포크레틴(HCRT)을 발현하는 뉴런을 표적으로 하고, PRSx8 promoter는 도파민 베타-하이드록실라제(dopamine beta-hydroxylase)²³를 발현하는 노르아드레날린성 뉴런 및 아드레날린성 뉴런을 표적으로 하며, GFAP promoter는 성상세포 특이적 발현을 유도할 수 있다²⁴. 그러나 일부 세포 특이적 promoter는 전사 활성이 약하고 충분한 수준의 전이유전자 발현을 유도할 수 없습니다²⁵. 또한, AAV 바이러스 벡터에 맞는 short promoter는 종종 세포 유형 특이성을 유지하지 않습니다 ^1,26. 예를 들어, CaMKII 구조체는 또한 억제성 뉴런¹²을 형질전환한 것으로 나타났습니다.

세포 유형 특이성(tropism) 외에도 AAV의 또 다른 중요한 특징은 transduction efficiency입니다. 다양한 AAV serotype은 서로 다른 확산 특성을 가지고 있습니다. AAV2 및 4개의 바이러스 벡터는 뇌 실질(brain parenchyma)을 통해 쉽게 확산되지 않기 때문에 더 작은 영역에 걸쳐 transduction을 매개합니다^17,27. 가장 널리 퍼진 신경세포 형질도입은 AAV 혈청형 1, 9 및 rh.10 11,17,18,19,28에서 관찰됩니다.

특정 뇌 영역에서 원하는 전이유전자의 발현을 유도하는 가장 인기 있는 방법은 AAV 벡터를 관심 뇌 영역(실질)에 직접 주입하는 것입니다³. 실질내 주사 후, 뇌를 통한 보다 효과적인 확산을 가진 AAV 혈청형조차도 일반적으로 주사 부위 주변의 국소 영역만 형질전환을 합니다 ¹². 더욱이, 실질내 주사는 침습적 시술이며 관심 부위에 인접한 조직 손상을 유발합니다. 따라서 이 바이러스 주입 방법은 일부 실험 작업에 적합하지 않습니다. 예를 들어, 세포의 광범위한 라벨링은 1 광자 또는 2 광자 현미경의 사용을 포함하여 자유롭게 움직이는 동물의 피질 뉴런 기능을 연구하는 것을 목표로 하는 실험에서 매우 바람직합니다 29,30,31,32.

여기에서는 지주막하 바이러스 주입을 사용하여 성체 마우스의 신피질 뉴런에 대한 광범위한 전달을 제공하고 뉴런 활동의 후속 광학 또는 전기 생리학적 기록을 위해 뇌 조직을 보존하는 새로운 아데노 관련 바이러스 주입 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 표재성 신피질층에서 뉴런의 광범위한 형질도입을 보장했을 뿐만 아니라 CAG와 같은 강력한 비선택적 프로모터를 사용할 때에도 높은 특이성을 가진 5층 피라미드 뉴런의 대규모 집단에서 전이유전자의 발현을 초래했습니다.

프로토콜

실험은 암수 2-4개월의 성체 C57Black/6 마우스에서 수행되었습니다(Pushchino Breeding Center, RAS의 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry 분과). 생쥐는 온도 조절이 가능한 사육장(22°C ± 2°C, 12시간 라이트/다크 사이클, 08:00시에 점등)에 음식과 물을 자유롭게 수용했습니다. 모든 실험 절차는 동물 실험에 대한 ARRIVE 지침 및 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 IHNA RAS의 윤리 위원회(2022년 2월 1일부터 프로토콜 N1)의 승인을 받았습니다. 동물의 고통을 최소화하고 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. 수술 준비

1. 수술을 시작하기 전에 모든 수술 기구를 소독하십시오. 70% 에탄올을 사용하여 수술 부위를 청소합니다.
2. 마취 시스템의 이소플루란 수치를 확인하고 필요한 경우 채웁니다. 인덕션 챔버 바닥에 깨끗한 종이 타월을 놓습니다.
3. 입체성 프레임에 가열 패드를 놓습니다. 깨끗한 종이 타월로 패드를 덮습니다.
4. 2% 표백제가 든 병을 준비하여 마이크로피펫 팁, 튜브, 면봉 및 바이러스와 접촉하는 기타 품목을 수집합니다.
5. -80 °C 냉동고에서 AAV 분취액을 꺼내 얼음 위에 올려 해동합니다.

2. 주사기 준비

1. 5μL Hamilton 마이크로주사기를 33G 뭉툭한 RN 바늘로 세척합니다. 흡입 후 70% 에탄올을 분주합니다. 신선한 에탄올로 3번 반복합니다. 주사기를 증류수로 헹구어 과도한 에탄올을 제거합니다. 3회 반복합니다.
2. 플런저를 꺼내 인슐린 주사기를 사용하여 플랜지를 통해 배럴에 바셀린 오일을 채웁니다. 마이크로 주사기에 기포가 없는지 확인하십시오.
   참고: 갇힌 공기는 압축할 수 있으며 주사기의 정확도와 정밀도에 영향을 미칩니다.
3. 플런저를 마이크로 주사기에 다시 넣고 오일 한 방울을 분배합니다. 주사기를 입체택시 주입기에 넣어 분주된 용액의 양을 모니터링하기 위해 스케일이 보이도록 합니다.

3. 수술용 마우스 준비

1. 마우스의 무게를 잰다. 마우스를 이소플루란에 연결된 마취 유도실에 넣습니다. 5%로 설정된 이소플루란 기화기를 켜고 유속을 250mL/분으로 조정합니다. 적절한 마취 깊이는 5-7분 이내에 이루어집니다.
2. 수술 마취 수준을 확인하려면 뒷발이 고통스럽게 꼬집는 동안 휘젓는 것과 금단 반사가 없는지, 눈을 마주쳤을 때 눈을 깜박이지 않는지 확인하십시오.
3. 기화기 유출 밸브를 유도 챔버에서 입위 마스크로 전환합니다. 이소플루란을 1.8%-2.0%로 낮추고 마우스 무게에 따라 유속을 설정합니다(체중이 25-35g 사이인 마우스의 경우 70-90mL/분).
4. 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 가열 패드(37°C) 상단의 정위 장치에 올려 놓고 외과적 마취 중 저체온증을 예방합니다. 앞니를 치아 막대에 놓고 동물 마스크를 장착합니다.
5. 동물을 이어바에 조심스럽게 놓습니다. 정위 장치에서 올바른 머리 위치는 머리의 수직 이동을 허용하지만 측면 이동은 허용하지 않습니다. 동물의 위치가 고통을 유발하지 않는지 확인하십시오. 수술 내내 마취 깊이, 동물 호흡 및 체온을 주의 깊게 모니터링하십시오.
6. 눈에서 귀 뒤까지 머리를 면도합니다. 면도한 머리 표면을 70% 에탄올로 닦은 다음 5% 알코올 요오드 용액으로 닦습니다.
7. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안과용 젤을 바르십시오. 4% 리도카인 용액을 국소적으로 바르고 덱사메타손(4mg/mL에서 0.02mL)을 피하주사하여 수술 관련 통증을 예방하고 가능한 염증 반응을 줄입니다.
8. 멸균 메스 날과 가위로 머리 정중선을 따라 4-5mm 길이의 절개를 만들어 두피를 엽니다. 귀 사이를 작게 절개한 다음 두개골 손상을 방지하기 위해 가위를 사용하여 확대합니다.
9. 소량의 3% 과산화수소로 두개골 표면을 닦아 입체택시 랜드마크인 브레그마(bregma)와 람다(lambda)를 시각화합니다. 즉시 0.9% NaCl 식염수로 반응을 중지하십시오. 뼈 스크레이퍼로 두개골 위의 조직을 긁어냅니다.
10. 미리 준비된 전동 인젝터를 Hamilton 주사기와 함께 입체 암에 장착합니다. 수술용 광원을 노출된 두개골에 집중시키고 현미경을 브레그마에 초점을 맞춥니다.
11. 현미경을 통해 정위 장치의 암을 조작하여 바늘 상단이 브레그마 바로 위의 중앙에 오도록 합니다.
12. 바늘 끝을 사용하여 브레그마와 람다를 수평으로 정렬한 다음 팔을 다시 브레그마로 이동하고 좌표를 기록합니다. 이러한 브레그마 좌표와 관심 영역의 아틀라스 좌표를 사용하여 대상 영역의 상대 좌표를 계산합니다.
13. 바늘을 대상 부위로 이동합니다. 새 좌표에서 바늘을 내리고 이 위치를 표시합니다. 바이러스의 확산을 고려하여 대상 부위에 가까운 바이러스 미세주입 부위를 선택합니다.
    알림: 이렇게 하면 관심 영역의 조직이 손상되는 것을 방지할 수 있습니다. 관심 영역에 대해 AP-3.4, ML -2.0 및 바이러스 미세주입에 대해 AP-2.0, ML -1.4 좌표를 사용했습니다. 위의 좌표는 1차 시각 피질 뉴런이 감염되는 경우 최적입니다.
14. 가능하면 혈관이 큰 부위를 피하십시오. 수술용 현미경, 밝고 차가운 빛 조명, 0.9% NaCl 식염수 침지 아래에서 두개골과 뇌 표면의 큰 혈관이 뚜렷해야 합니다.

4. 바이러스 주입

1. 멸균 치과 버 (직경 0.5-0.8mm)를 가져 가십시오. 수술용 현미경을 통해 두개골 표면을 보고 수동으로(손으로) 또는 마이크로 드릴을 사용하여 작은 개두술을 뚫습니다. 두개골에 과도한 압력을 가하지 않도록 주의하십시오.
2. 개두술(구멍)을 뚫는 동안 마이크로 주사기 바늘의 손상을 방지하기 위해 팔을 방해가 되지 않도록 움직입니다. 0.9% NaCl 식염수를 담그고 간헐적으로 일시 중지하여 뼈가 가열되고 경막이 손상되지 않도록 합니다. 압축 공기를 사용하여 뼈 가루를 날려 버리십시오.
   참고: 다음 유형의 카바이드 치과 버가 적합합니다: 배 모양(바람직하게는), 둥근 실린더 및 원형.
   1. 버로 뼈를 얇게 할 때 얇아짐이 전체 둘레에 걸쳐 균일하게 이루어져야 합니다. 이렇게 하면 경막을 손상시키지 않고 뼈를 더 쉽게 제거할 수 있습니다. 이렇게하려면 처음에는 둥근 끝이있는 버를 사용한 다음 평평한 팁이있는 버를 사용하십시오. 버를 뼈에 수직으로 유지하십시오. 그렇지 않으면 한쪽이 다른 쪽보다 얇아집니다.
      참고: 또한 버의 크기가 작을수록 수행된 개두술이 작을수록 조작이 더 복잡해집니다. 생체 내 작업을 위해 동물을 더 사용할 때 더 작은 직경(0.5-0.6mm)의 개두술을 수행하는 것이 좋습니다. 생체 외 작업을 위해 동물의 뇌를 사용할 계획이라면 절차를 단순화하기 위해 더 큰 개두술 직경이 허용됩니다.
3. 얇아진 뼈가 부드럽고 투명해지면 드릴링을 중지하십시오. 뼈에 충분히 큰 움푹 들어간 곳이 형성되면 자주 회전을 중지하고 뼈의 두께를 모니터링합니다. 뼈에 균열이 나타나는 것은 얇아지는 것으로 충분하다는 것을 나타냅니다.
4. 멸균 식염수로 구멍을 닦은 다음 면봉으로 여분의 식염수를 제거하십시오. 끝이 갈고리 모양인 27G 바늘 및/또는 끝이 가는 핀셋을 사용하여 뼈의 나머지 층을 제거합니다. 경막이 손상되지 않도록 하십시오.
5. 식염수를 적신 멸균 종이 타월로 두개골 표면을 덮으십시오. 종이 위의 마우스 두개골 표면에 깨끗하고 투명한 필름 조각을 놓습니다.
6. 입체식 암을 뒤로 움직이고 마이크로 주사기 바늘을 필름 바로 위에 놓습니다. 2 μL의 부피에 도달할 때까지 여분의 오일을 분배합니다.
   알림: 오일의 최종 부피는 마이크로 주사기의 부피에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 5 μL 75-RN Hamilton 마이크로 주사기를 사용했습니다.
7. 주입된 부피와 동일한 부피의 바이러스 + 2 μL를 투명 필름 조각에 피펫팅합니다.
8. 수술용 현미경을 통해 바늘 끝이 바이러스 방울의 중앙에 올 때까지 팔을 내립니다. 전동 주입기를 사용하여 바이러스를 마이크로 주사기에 로드합니다. 마이크로피펫의 끝과 투명 필름을 2% 표백제를 탄 병에 버립니다.
9. 두개골 표면에서 식염수가 적신 종이를 제거하고 면봉으로 두개골을 말리십시오. 입체 암을 사용하여 삽입 부위 위에 바늘을 놓습니다.
10. 바늘이 막히지 않았는지 확인하기 위해 바이러스 한 방울을 떨어뜨립니다. 팁이 갈고리 모양의 30G 바늘을 사용하여 경막에 작은 슬릿을 만듭니다.
    참고: 경막에 가능한 한 가장 작은 슬릿을 만들어 바늘과 경막 사이에 바이러스가 누출될 수 있는 틈을 남기지 않고 바늘이 들어갈 수 있도록 하는 것이 중요합니다.
11. 주사기의 바늘을 경막까지 내리고 깊이를 적절하게 계산합니다. 바늘이 피질 표면에 처음 닿은 지점을 기준으로 삽입의 피질 깊이를 추정합니다.
12. 바늘 끝을 300μm 깊이까지 피질에 천천히 삽입합니다. 경막이 바늘에 부착될 때까지 2-3분 정도 기다린 다음 바늘을 200μm 깊이까지 천천히 집어넣습니다. 뇌 조직이 안정될 때까지 2-3분 더 기다립니다. 그 결과 바늘이 경막을 위로 당겨 바이러스가 퍼질 수 있는 경막하 공간을 만듭니다.
    알림: 피질 손상을 최소화하려면 33G 바늘 또는 아래쪽 G 바늘을 사용하십시오. 팁의 내경이 작을수록 조직 역류가 막힐 가능성이 높아진다는 점을 명심하십시오. 뭉툭한 바늘은 더 통제된 바이러스 용액을 한 방울 떨어뜨리기 때문에 비스듬한 바늘 대신 뭉툭한 바늘을 사용하는 것이 중요합니다.
    1. 바늘을 150-200 μm로 낮췄을 때 경막을 통과하지 못하고 대신 구부리면 낮추기를 중지하십시오. 바늘을 들어 올려 경막을 약간 크게 절개한 다음 다시 바늘을 내려 보십시오.
    2. 바늘을 내리는 동안 절개 부위에서 뇌척수액이 활발하게 누출되기 시작하면 누출이 멈출 때까지 기다립니다. 그렇지 않으면 경막을 통과하는 바늘을 제어하기 어렵습니다. 과도한 뇌척수액을 티슈 끝으로 닦아냅니다. 액체의 흐름이 멈추면 바늘을 들어 올리고 다시 시도하십시오.
13. 0.06μL/분의 속도로 바이러스 현탁액을 주입하면서 분주된 부피를 모니터링합니다. 1μL의 바이러스를 주입합니다. 바늘과 피질 조직 사이의 밀봉이 깨지지 않도록 단일 깊이에서 바이러스를 주입합니다.
    1. 문제 해결: 주사 초기에 뇌 표면으로의 바이러스 역류가 발생할 수 있습니다. 주입을 중지하고 2-3분 정도 기다린 다음 바이러스 주입을 계속합니다. 바이러스 역류가 중지될 때까지 이러한 작업(단계)을 반복합니다. 바이러스와 뇌척수액이 바늘에 달라붙어 역류를 방지합니다.
    2. 바이러스 역류를 막는 또 다른 방법은 피질 표면에 소량의 아가로스를 바르는 것입니다. 그것은 피질의 맥동을 억제하고 바늘을 밀봉하는 데 도움이 될 것입니다. 그러나 피펫이 아가로스에 의해 막히지 않았는지 확인하십시오.
    3. 바늘을 내리면 바늘이 경막을 완전히 통과하지 못하고 부분적으로만 통과할 수 있기 때문에 바늘의 한쪽 면이 경막에 단단히 맞지 않을 수 있으며, 이로 인해 바이러스가 역류할 수 있습니다. 이 경우 조직에서 바늘을 천천히 빼낸 후 다시 내려보세요.
14. 주입이 완료되면 바늘을 목표 위치에 10분 더 유지합니다. 이렇게 하면 바이러스가 주사 부위에서 멀리 퍼질 수 있습니다. 바이러스가 주삿바늘 밖으로 다시 쏟아져 나오는 것을 방지하기 위해 뇌에서 바늘을 천천히 빼냅니다.
15. 바늘 빼기가 완료되면 소량의 바이러스를 분사하여 막히지 않았는지 확인하십시오. 5-0 흡수성 또는 비흡수성 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.

5. 수술 후 관리

1. 절개 부위를 봉합한 후 항균 연고를 국소적으로 바릅니다. 식염수(5mL/kg)와 포도당 5%(5mL/kg)를 혼합하여 피하주사하여 탈수를 방지하고 마취 후 회복을 용이하게 합니다. 케토프로펜을 근육 주사(2.5mg/kg)하여 통증을 줄입니다.
2. 동물을 발열 패드 위에 있는 새 케이지에 넣고 마취에서 회복될 때까지 모니터링합니다. 쥐가 반응하면 동물을 집 우리에 넣습니다.

6. 조직학

1. 바이러스 주입 후 21일 이내에 3단계에서 설명한 대로 이소플루란으로 마우스를 심층 마취합니다.
2. 흉부를 따라 좁은 가위를 이용하여 정중선(10-15mm)을 절개하여 흉강을 노출시킵니다. 조심스럽게 횡격막을 분리하고 가위를 사용하여 가슴을 엽니다.
3. 좌심실에 22G 1 1/2 바늘을 삽입하고 가위로 우심방을 절개합니다. 50mL의 사전 냉각된 100mM 인산염 완충 식염수(PBS)와 사전 냉각된 10% 완충 포르말린 100mL를 관류합니다.
4. 쥐의 뇌 전체를 조심스럽게 추출합니다. 이렇게하려면 가위를 사용하여 두피 중앙을 따라 시상 절개를 만드십시오. 다음으로, 시상과 양봉 봉합사의 교차점에서 시작하여 코뼈까지 앞으로 나아가는 평평한 끝이 있는 뼈 플라이어를 사용하여 두개골 뼈를 하나씩 제거합니다. 뇌가 노출되면 후각구를 잘라내고 구부러진 주걱으로 뇌를 풀어낸 다음 10% 완충 포르말린이 들어 있는 50mL 튜브에 떨어뜨립니다.
5. 하룻밤 사이에 뇌를 고치십시오. 조직 접착제를 사용하여 Vibratome의 금속 플랫폼에 뇌 조직을 장착합니다. 탄소강 블레이드를 사용하여 50μm 두께로 정면 부분을 절단합니다.

7. 면역 염색

1. 1일차
   1. 0.3% Triton X-100(PBS-T)이 함유된 PBS 1개로 뇌 절편을 각각 5분씩 3회 세척합니다. PBS-T의 절편을 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다.
   2. 1x PBS에서 5% Normal Goat Serum(NGS)과 0.3% Triton X-100으로 구성된 차단 버퍼를 사용하여 RT에서 1시간 동안 비특이적 결합을 차단합니다.
   3. 차단 완충액에서 1:500으로 희석된 파브알부민 또는 칼빈딘에 대한 1차 항체를 사용하여 4°C에서 밤새 절편을 배양합니다(1x PBS에서 5% NGS 및 0.3% Triton X-100).
2. 2일차
   1. PBS-T에서 3분 동안 섹션을 10번 세척합니다. 차단 버퍼(1x PBS에서 5% NGS 및 0.3% Triton X-100)에 1:500으로 희석된 2차 항체(Goat anti-Rabbit IgG(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546)를 RT에서 2시간 동안 암흑 속에서 배양합니다.
   2. 3x PBS에서 각각 5분 동안 섹션을 1회 세척합니다. 부드러운 브러시를 사용하여 뇌 조각을 유리 슬라이드로 옮깁니다.
   3. 즉시 0.1mL의 페이드 방지 마운팅 매체를 각 섹션에 추가합니다. 22mm x 50mm 커버슬립으로 슬라이스를 덮습니다.
   4. 컨포칼 현미경을 20x 또는 60x(A/1.4, 오일)의 배율로 구성합니다. 488nm 및 594nm 파장 레이저를 사용하여 관심 뇌 영역의 다중 채널 이미지를 획득합니다.

결과

일련의 파일럿 실험에서 우리는 CaMKII 프로모터 아래에서 EGFP 형광 단백질과 융합된 빠른 채널로돕신(oChIEF) 유전자를 운반하는 AAV2에 의해 마우스 신피질의 5층 피라미드 뉴런을 형질전환하기 위해 전통적인 피질내 주입 방법을 사용했습니다. AAV2¹²의 특징과 일치하게, 우리는 너비가 1mm를 초과하지 않는 비교적 작은 감염 영역을 얻었습니다(

토론

우리는 AAV2 바이러스 입자의 현탁액을 뇌의 지주막하 공간에 주입하여 마우스 신피질 뉴런을 transduction하는 새로운 방법을 개발했습니다. 이는 광범위한 바이러스 분포를 제공하며, 동일한 양의 바이러스가 뇌 실질에 직접 주입될 때 감염된 조직 부피보다 거의 4배 더 많습니다.

다양한 경로(예: 뇌내, 척수강내 또는 시수탄내)를 통해 바이러스 벡터를...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
10 µL Gastight Syringe Model 1701 RN (5 uL 75 RN Hamilton microsyringe)	Hamilton Company	Part/REF # 7634-01, Hamilton or cat no. HAM7634-01, Merck
33 G RN needle, point style 3	Hamilton Company	Part/REF # 7803-05, Hamilton
Binocular Microscope	Nikon or Micromed	Model MC-4 ZOOM
Cerna-based laser scanning confocal microscope	ThorLabs
Cold light source	RWD	Model 76312
Leica VT1000 S Vibrating blade microtome	Leica Biosystems	76001-014
Low-Flow Anesthesia System with starter kit	Kent Scientific Corporation	13-005-111 (Model SomnoSuite)
Mechanical Pipette 0.1 – 2.5 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000012
Mechanical Pipette 10 – 100 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000047
Mice Shaver	RWD	Model CP-5200
Microdrill with drill bits (0.5 mm, round)	RWD	78001, 78040
or Desctop Digital Stereotaxic Instrument, Mouse anesthesia Mask, Mouse ear bars (60 Deg)	RWD	Models 68027, 68665, 68306
Pressurized air	KUDO
Single Channel Manual Pipette 0.5-10 µL	RAINN	17008649
Small Animal Stereotaxic Instrument	KOPF	Model 962
Stereotaxic Injector	Stoelting	10-000-004
Surgical Instruments (Tools)
30 G dental needle (Ni-pro)	Biodent Co. Ltd.		To slit the dura
Bone scraper	Fine Science Tools	10075-16
Dental bur	DRENDEL + ZWEILING		For craniotomy; Shape: pear shaped/round end cylinder/round; Tip Diameter: 0.55-0.8 mm diameter
Needle holder (Halsey Micro Needle Holder)	Fine Science Tools	12500-12
Polypropylene Surgical Suture or Surgical Suture Vicryl (5-0, absorbable)	Walter Products (Ethicon)	S139044 (W9442)
Scalpel handle (#3) with scalpel blades (#11)	Fine Science Tools	10003-12, 10011-00
Scissors (Extra Narrow Scissors)	Fine Science Tools	14088-10	to cut the skin
Scissors (Fine Scissors)	Fine Science Tools	14094-11	to cut suture
Surgical suture PROLENE (Polyproptlene)	Ethicon (Johnson & Johnson)
Tweezers (Forceps #5)	Fine Science Tools	11252-20
Tweezers (Polished Inox Forceps)	Fine Science Tools	11210-20
Disposables
1 mL insulin syringe	SITEKMED		To load vaseline oil into a microsyringe, to administer drugs
Cell Culture Plate	SPL Life Science
Cotton swabs
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-545E
Insulin syringe needle (27 G)	SITEKMED		To remove debries from a hole (craniotomy)
Lint-free wipes CLEANWIPER	NetLink
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Paper towels	Luscan
Parafilm	StatLab	STLPM996
Sterile Surgical Gloves	Dermagrip
Drugs/Chemicals (Reagents)
10% buffered formalin or 4% paraformaldehyde	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK
Alcohol solution of iodine (5%))	Renewal
Antibiotic ointment Baneocin (bacitracin + neomycin)	Sandoz		Antibacterial agent for external use
Aqua Polymount	Poly-sciences	18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (Ophthalmic gel)	BAUSCH+LOMB (Santen)
Carboxylate-Modified FluoSphere Microspheres (red)	Thermo Fisher Scientific	F-8801
Dexamethasone (4 mg/mL)	Ellara (KRKA)		Synthetic glucocorticoid
Distilled H2O
Ethanol (70%)
Flexoprofen 2.5% (Ketoprofen)	VIC		Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs)
Glucose solution 5%	Solopharm
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A-11010
Isoflurane	Karizoo
lidocaine solution (2 % / 4%)	Solopharm
Normal Goat Serum (NGS)	Abcam	ab7481
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Eco-servis
Rabbit Anti-Parvalbumin Antibody	Merck Millipore	AB15736
Rabbit Recombinant Monoclonal anti-Calbindin antibody	Abcam	ab108404
Saline (0.9% NaCl in H2O)	Solopharm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	50-178-1844
Vaseline oil	Genel