AAV2のくも膜下注射によるマウス新皮質ニューロンの広範な形質導入

要約

くも膜下ウイルスの注入を使用するアデノ随伴ウイルスの広範な送達のための新しい技術が記載されています。この方法は、マウス新皮質ニューロンの表層への広範な形質導入を保証するだけでなく、非選択的プロモーターを使用した場合でも、第5層錐体ニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現をもたらします。

要約

組換えアデノ随伴ウイルスは、実験生物学の多くの分野、特に神経科学において、関心のあるさまざまな遺伝子の送達と発現のための柔軟で強力なツールです。特定の脳領域で目的の導入遺伝子の発現を促進する最も一般的な方法は、AAVベクターを脳実質に直接注入することです。しかし、この方法では、一部の in vivo 実験に必要な広範なニューロン形質導入は可能ではありません。この記事では、脳のくも膜下腔へのウイルス注入に基づいて、マウス新皮質で広範囲に遺伝子発現を行う新しい技術を紹介します。このニューロン標識法は、成体マウス表在性新皮質層におけるニューロンの広範な形質導入を保証するだけでなく、CAGのような強力な非選択的プロモーターを使用する場合でも、高い特異性を持つ第5層錐体ニューロンの大規模な集団における導入遺伝子の発現をもたらします。さらに、細胞形質導入は注射部位からかなり離れた場所で行われるため、この方法は、その後のニューロン活動の光学的または電気生理学的記録のために脳組織を保存するのに役立ちます。

概要

哺乳類の脳は、数兆のシナプス1によって回路に相互接続された多くの抑制性、興奮性、および調節性の細胞^{で構成されています1。}神経科学の中心的な課題の1つは、脳の回路と行動の組織と機能における異なる細胞タイプの役割を解読することです。脳内の遺伝的に定義された細胞を操作するには、導入遺伝子を導入して発現させる方法が必要です。ウイルスベースの遺伝子導入システムは、中枢神経系への遺伝子導入のための最も効果的で簡単な方法^です2。ウイルス送達システムは、遺伝情報を宿主細胞に送達する能力を持つ複製ウイルス(アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、レトロウイルス)に基づいています^2,3。

AAVベースのベクターは、現在、基礎神経科学研究と神経疾患の遺伝子治療開発の両方を目的として、脳内の細胞に目的の導入遺伝子を送達するための最も広く使用されているツールの1つになっています。他のウイルスと比較すると、複製欠損AAVは、これらの目的に理想的なベクターとなる多くの特徴を備えています。最も注目すべきは、AAVベクターがニューロンやグリア細胞などの非分裂性(末端分化型)細胞を効率的に形質導入し、in vivo²で高レベルの導入遺伝子発現をもたらすことです。ベクターは、in vivo^{での使用に適した}高機能力価で容易に作製できます^3,4,5。重要なことに、in vivoでのアデノ随伴ウイルス媒介遺伝子導入は、病理組織学的変化やベクター関連毒性を引き起こさない⁶。アデノウイルスベクターとは異なり、動物モデルにAAVベクターをin vivoで投与しても、通常、形質導入細胞に対する宿主免疫応答は引き起こされず、脳実質内で長期間にわたって安定した導入遺伝子発現が可能になります^2,7,8。

AAVベクターが人気のもう一つの理由は、独自の組織および細胞型指向性9,10,11,12,13,14を有する広範なAAV血清型である。異なるAAV血清型によって発現される異なるカプシドタンパク質は、細胞侵入のための異なる細胞表面受容体の使用をもたらし、したがって、特異的な指向性^10,14をもたらす。

AAVの親和性は、カプシドタンパク質だけでなく、他の多くの因子によっても決定される¹⁴。AAV血清型1、2、6、7、8、および9は、初代培養^15,16でニューロンとアストロサイトの両方を形質導入したが、実質内脳注射^17,18後には強いニューロン親和性を示したことが示されている。AAVベクターの調製に使用される方法は、同じ血清型であっても、神経細胞の親和性にも影響を与える可能性があります。例えば、CsCl精製されたAAV8は、実質内脳注射後に強い天球膠学的親和性を有していたが、同じ条件下で注射されたイオジキサノール精製AAV8は、ニューロンのみを形質導入した¹⁹。AAV向性は、注射された用量とボリューム¹⁴によっても影響を受ける可能性があります。.例えば、高力価のrAAV2/1は、皮質興奮性ニューロンと抑制性ニューロンの両方を効率的に形質導入したが、低力価の使用は、皮質抑制性ニューロンの形質導入に対する強い選好性を明らかにした²⁰。

したがって、カプシド血清型のみに基づいて堅牢な細胞型特異性を達成することはできません。細胞型特異的プロモーターは、AAVキャプシドの広範な自然親和性を克服するために使用できます。例えば、ヒトシナプシンIはニューロンを標的とするために使用され²¹、CaMKIIプロモーターはグルタミン酸作動性興奮性ニューロンにおける導入遺伝子発現を高い特異性で駆動することができ²⁰、ppHcrtプロモーターは視床下部外側のヒポクレチン(HCRT)発現ニューロンを標的と^し22、PRSx8プロモーターはドーパミンβ-ヒドロキシラーゼを発現するノルアドレナリン作動性およびアドレナリン作動性ニューロンを標的とし²³、GFAPプロモーターはアストロサイト特異的発現を駆動することができる²⁴。しかし、一部の細胞特異的プロモーターは転写活性が弱く、十分なレベルの導入遺伝子発現を駆動することができません²⁵。さらに、AAVウイルスベクターに適合する短いプロモーターは、多くの場合、細胞タイプの特異性を保持しません^1,26。例えば、CaMKIIコンストラクトは、抑制性ニューロン¹²も形質導入することが示されている。

細胞型の特異性(親和性)に加えて、AAVのもう一つの重要な特徴は形質導入効率です。さまざまなAAV血清型は、異なる拡散特性を持っています。AAV2および4つのウイルスベクターは、脳実質を通じて拡散しにくく、したがって、より小さな領域^17,27で形質導入を媒介する。最も広範なニューロン伝達は、AAV血清型1、9、およびrh.10 11,17,18,19,28で観察されます。

特定の脳領域における所望の導入遺伝子の発現を促進する最も一般的な方法は、AAVベクターを関心のある脳領域(実^{質)に直接}注入することです3。実質内注射後、脳を通じてより効果的な拡散を有するAAV血清型でさえも、典型的には注射部位の周囲の局所領域のみを形質導入する¹²。さらに、実質内注射は侵襲的な手順であり、関心領域に隣接する組織損傷を引き起こします。したがって、このウイルス注入方法は、一部の実験タスクには適していません。例えば、細胞の広範な標識は、1光子顕微鏡または2光子顕微鏡29,30,31,32の使用を含む、自由に動く動物の皮質ニューロン機能を研究することを目的とした実験において非常に望ましい。

ここでは、くも膜下ウイルス注入を使用して成体マウスの新皮質ニューロンの広範な形質導入を提供し、その後のニューロン活動の光学的または電気生理学的記録のために脳組織を保存する新しいアデノ随伴ウイルス注入技術について説明します。この方法は、表在性新皮質層におけるニューロンの広範な形質導入を確保しただけでなく、CAGのような強力な非選択的プロモーターを使用した場合でも、高い特異性を持つ第5層錐体ニューロンの大規模な集団における導入遺伝子の発現をもたらした。

プロトコル

実験は、雌雄ともに生後2〜4ヶ月の成体C57Black/6マウス(Pushchino Breeding Center, Branch of the Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS)で行いました。マウスは、温度制御されたビバリウム(22°C±2°C、12時間の明暗サイクル、08.00時間に点灯)に収容され、餌と水が 自由自在に行われました。すべての実験手順は、動物実験に関するARRIVEガイドラインおよび指令2010/63/EUに従って実施されました。研究プロトコルは、IHNA RAS の倫理委員会によって承認されました (2022 年 2 月 1 日からのプロトコル N1)。動物の苦痛を最小限に抑え、結果の信頼性を確保するために、あらゆる努力が払われました。

1. 手術の準備

1. 手術を開始する前に、すべての手術器具を滅菌してください。70%エタノールを使用して手術部位を清掃します。
2. 麻酔システムのイソフルランレベルを確認し、必要に応じて満たします。誘導チャンバーの底に清潔なペーパータオルを置きます。
3. 脳定位固定装置フレームに加熱パッドを置きます。パッドを清潔なペーパータオルで覆います。
4. 2%漂白剤のボトルを準備して、ウイルスと接触するマイクロピペットの先端、チューブ、綿棒、その他のアイテムを収集します。
5. -80°Cの冷凍庫からAAVのアリコートを取り出し、氷の上に置いて解凍します。

2. シリンジの準備

1. 5 μL の Hamilton マイクロシリンジを 33G の鈍い RN 針で洗浄します。吸引してから、70%エタノールを分注します。新鮮なエタノールで3回繰り返します。シリンジを蒸留水ですすいで、余分なエタノールを取り除きます。3回繰り返します。
2. プランジャーを取り出し、インスリン注射器を使用してフランジからバレルにワセリンオイルを充填します。マイクロシリンジに気泡がないことを確認してください。
   注:閉じ込められた空気は圧縮性であり、シリンジの精度と精度に影響を与えます。
3. プランジャーをマイクロシリンジに戻し、オイルを一滴分注します。シリンジを定位固定装置インジェクターに入れて、分注された溶液の量を監視するためのスケールが見えるようにします。

3.手術用マウスの準備

1. マウスの重さを量ります。マウスをイソフルランに接続された麻酔導入チャンバーに入れます。5%に設定したイソフルラン気化器の電源を入れ、流量を250mL / minに調整します。適切な麻酔の深さは5〜7分以内に達成されます。
2. 麻酔の外科的レベルを確認するには、後足の痛みを伴うつまみの間に泡立て器と離脱反射がないこと、および目がついたときにまばたきがないことを確認します。
3. 気化器のアウトフローバルブを誘導室から定位固定マスクに切り替えます。イソフルランを1.8%〜2.0%に減らし、マウスの体重に応じて流量を設定します(体重が25〜35 gのマウスの場合は70〜90 mL / min)。
4. マウスを誘導チャンバーから取り外し、加熱パッド(37°C)の上の定位装置に置き、外科的麻酔中の低体温を防ぎます。前歯を歯のバーに置き、アニマルマスクを取り付けます。
5. 動物をイヤーバーに慎重に配置します。定位装置の正しい頭部位置は、頭部の垂直方向の動きを可能にしますが、横方向の動きは許可しません。動物のポジショニングが苦痛を引き起こさないようにしてください。手術中は、麻酔の深さ、動物の呼吸、体温を注意深く監視します。
6. 目から耳の後ろまで頭を剃ります。70%エタノールで綿棒を拭き、続いてヨウ素の5%アルコール溶液で綿棒を拭いて、頭の剃った表面をきれいにします。
7. 眼の乾燥を防ぐために眼科用ジェルを塗布します。4%リドカイン溶液を局所的に適用し、デキサメタゾン(4 mg / mLで0.02 mL)を皮下に適用して、手術関連の痛みを防ぎ、可能な炎症反応を減らします。.
8. 滅菌メスの刃とハサミで、頭の正中線に沿って4〜5 mmの長さの切開を行い、頭皮を開きます。耳の間に小さな切開から始めて、頭蓋骨の損傷を避けるためにハサミを使ってそれを広げます。
9. 頭蓋骨の表面を少量の3%過酸化水素で綿棒で拭き取り、定位固定のランドマークであるブレグマとラムダを視覚化します。0.9%NaCl生理食塩水で反応を直ちに停止します。骨スクレーパーで頭蓋骨の上のティッシュをこすり落とします。
10. 事前に準備した電動インジェクターをハミルトンシリンジで定位固定アームに取り付けます。露出した頭蓋骨に手術用光源を向け、顕微鏡をブレグマに焦点を合わせます。
11. 顕微鏡を覗いて、定位装置のアームを操作して、針の上部をブレグマの真上に中央に配置します。
12. 針の先端を使用して、bregmaとlambdaを水平に合わせ、アームをbregmaに戻して座標を記録します。これらの bregma 座標と関心領域のアトラス座標を使用して、対象領域の相対座標を計算します。
13. 針を目的の領域に移動します。新しい座標で針を下げ、この位置に印を付けます。ウイルスマイクロインジェクションの部位は、ウイルスの拡散を考慮しながら、対象地域に近接して選択してください。
    注:これにより、対象領域の組織に損傷を与えるのを防ぐことができます。関心領域には AP-3.4、ML -2.0、ウイルスマイクロインジェクションには AP-2.0、ML -1.4 の座標を使用しました。上記の座標は、一次視覚野ニューロンが感染する場合に最適です。
14. 可能であれば、血管の大きい領域は避けてください。手術用顕微鏡、明るい冷光照明、および0.9%のNaCl生理食塩水浸漬下では、頭蓋骨と脳表面の大きな血管が明らかになるはずです。

4. ウイルスインジェクション

1. 滅菌済みの歯科用バー(直径0.5〜0.8mm)を取ります。手術用顕微鏡で頭蓋骨の表面を観察し、手動(手作業)またはマイクロドリルを使用して小さな開頭術をドリルで開けます。頭蓋骨に過度の圧力がかからないように注意してください。
2. 開頭術(穴)の穴あけ中にマイクロシリンジ針が損傷するのを防ぐために、アームを邪魔にならないように動かします。0.9%のNaCl生理食塩水浸漬を適用し、骨の加熱や硬膜の損傷を避けるために断続的に一時停止します。加圧空気を使用して骨の粉塵を吹き飛ばします。
   注:次のタイプの超硬デンタルバーが適しています:洋ナシ型(好ましくは)、丸みを帯びたシリンダー、および丸い。
   1. バーで骨を薄くするときは、全周で薄くなるのが均一であることを確認してください。これにより、硬膜を傷つけずに骨を切除しやすくなります。これを行うには、最初に先端が丸いバーを使用し、次に先端が平らなバーを使用します。バーを骨に対して垂直に保ちます。そうしないと、一方の面がもう一方の面よりも薄くなります。
      注:さらに、バーのサイズが小さく、開頭術が小さいほど、操作は複雑になります。動物をさらに in vivo 作業に使用する場合は、より小さな直径(0.5〜0.6 mm)の開頭術を実施することをお勧めします。動物の脳を 生体外 治療に使用することを計画している場合は、手順を簡素化するために開頭術の直径を大きくすることができます。
3. 薄くなった骨が柔らかく透明になったら、穴あけを止めます。骨に十分に大きなくぼみが形成された場合は、頻繁に回転を停止し、骨の厚さを監視します。骨に亀裂が見られることは、薄くするのに十分であることを示しています。
4. 滅菌生理食塩水で穴を浸し、綿棒で余分な生理食塩水を取り除きます。残りの骨の層は、フック状の先端が付いた27G針または先端の細いピンセットを使用して除去します。硬膜の損傷を避けてください。
5. 生理食塩水で湿らせた滅菌済みのペーパータオルで頭蓋骨の表面を覆います。紙の上のマウスの頭蓋骨の表面に、清潔で透明なフィルムを置きます。
6. 脳定位固定装置アームを後ろに動かし、マイクロシリンジの針をフィルムの真上に配置します。余分なオイルを2μLの容量に達するまで分注します。
   注意: オイルの最終的な容量は、マイクロシリンジの容量によって異なる場合があります。5 μL 75-RN Hamilton マイクロシリンジを使用しました。
7. 注入した容量+ 2μLに等しい量のウイルスを透明フィルムにピペットで移します。
8. 手術用顕微鏡を覗いて、針の先端がウイルスの滴の中心に来るまで腕を下げます。電動インジェクターを使用してウイルスをマイクロシリンジにロードします。マイクロピペットの先端と透明フィルムを2%漂白剤でボトルに捨てます。
9. 生理食塩水で湿らせた紙を頭蓋骨の表面から取り除き、綿棒で頭蓋骨を乾かします。脳定位固定装置アームを使用して、針を挿入部位の上に配置します。
10. 針が詰まっていないことを確認するために、ウイルスを一滴分注します。先端がフック状になった30Gの針を使って硬膜に小さなスリットをあけます。
    注:硬膜にできるだけ小さなスリットを入れ、ウイルスが漏れる可能性のある針と硬膜との間に隙間を残さずに針が入るようにすることが重要です。
11. シリンジの針を硬膜まで下げ、深さを適切に計算します。針が最初に皮質の表面に触れた点に対する挿入の皮質の深さを推定します。
12. 針先を皮質にゆっくりと300μmの深さまで挿入します。硬膜が針に付着するまで2〜3分待ってから、針をゆっくりと200μmの深さまで引っ込めます。脳組織が落ち着くまでさらに2〜3分待ちます。これにより、針が硬膜を引き上げ、ウイルスが拡散するための硬膜下腔を作り出します。
    注意: 皮質の損傷を最小限に抑えるには、33Gの針を使用するか、Gの針を下回ってください。先端の内径が小さいほど、組織の逆流が詰まる可能性が高くなることに注意してください。鈍い針はより制御されたウイルス溶液の滴を排出するため、斜めではなく鈍い針を使用することが重要です。
    1. 針を150〜200μmに下げたときに硬膜を通過せず、代わりに針を曲げた場合は、下げを停止します。針を持ち上げて硬膜を少し大きく切開してから、もう一度針を下げてみてください。
    2. 針を下げているときに切開部から脳脊髄液が活発に漏れ始めた場合は、漏れが止まるまで待ちます。そうしないと、硬膜を通過する針を制御するのが困難です。余分な脳脊髄液をティッシュチップで拭き取ります。液体の流れが止まったら、針を持ち上げて再試行してください。
13. 分注量を監視しながら、0.06 μL/分の速度でウイルス懸濁液の注入を開始します。1μLのウイルスを注入します。針と皮質組織の間のシールを壊さないように、ウイルスを単一の深さで注入します。
    1. トラブルシューティング:注射の開始時に、脳表面へのウイルスの逆流が発生する可能性があります。注射を止め、2〜3分待ってから、ウイルス注射を続けます。ウイルスの逆流が止まるまで、これらのアクション(手順)を繰り返します。ウイルスや脳脊髄液が針に付着し、逆流を防ぎます。
    2. ウイルスの逆流を止める別の方法は、皮質の表面に少量のアガロースを置くことです。それは皮質の脈動を抑制し、また針を密封するのを助けます。ただし、ピペットがアガロースに詰まっていないことを確認してください。
    3. 針を下げたときに硬膜を完全に通過するのではなく、部分的にしか通過しない場合があるため、針の片側が硬膜にしっかりとフィットせず、ウイルスの逆流を引き起こす可能性があります。この場合、針をゆっくりと組織から引き抜き、再度下げてみてください。
14. 注入が完了したら、針を目標位置にさらに10分間保持します。これにより、ウイルスは注射部位から分散します。ウイルスが針路から逆流するのを防ぐために、針をゆっくりと脳から引き抜きます。
15. 針の抜去が完了したら、ウイルスを少量分注して目詰まりしていないか確認します。5-0の吸収性または非吸収性の縫合糸を使用して皮膚の切開を閉じます。

5. 術後のケア

1. 切開部を閉じた後、抗菌軟膏を局所的に塗布します。生理食塩水(5 mL / kg)と5%グルコース(5 mL / kg)の混合物を皮下に注入して、脱水症を防ぎ、麻酔後の回復を促進します。.ケトプロフェンを筋肉内(2.5 mg / kg)に注射して痛みを軽減します。.
2. 動物を加熱パッドの上の新しいケージに入れ、麻酔から回復するまで監視します。マウスが反応した後、動物を自宅のケージに入れます。

6.組織学

1. ステップ3で説明したように、ウイルス注射後21日以内にマウスにイソフルランで深く麻酔をかけます。
2. 狭いハサミを使用して胸部に沿って正中線切開(10〜15 mm)を行い、胸腔を露出させます。横隔膜を慎重に分離し、ハサミで胸を開きます。
3. 22G 1 1/2針を左心室に挿入し、ハサミで右心房を切開します。50 mLの予冷済み100 mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で灌流し、続いて予冷済み10%緩衝ホルマリン100 mLで灌流します。
4. マウスの脳全体を慎重に抽出します。これを行うには、はさみを使用して頭皮の中心に沿って矢状切開を行います。次に、矢状縫合糸とラムドイド縫合糸の交点から鼻骨に向かって、先端が平らな骨ペンチを使用して頭蓋骨を一つずつ取り除きます。脳が露出したら、嗅球を切り取り、湾曲したヘラで脳を緩め、10%緩衝ホルマリンを含む50mLのチューブに落とします。
5. 一晩で脳を固定します。組織接着剤を使用して、ビブラトームの金属プラットフォームに脳組織を取り付けます。炭素鋼の刃を使用して、前頭部を50μmの厚さで切断します。

7. 免疫染色

1. 1日目
   1. 0.3% Triton X-100 (PBS-T) を含む 1x PBS で、脳スライスを 3 回、5 分間それぞれ洗浄します。PBS-Tで切片を室温(RT)で20分間インキュベートします。
   2. 1x PBS中の5%Normal Goat Serum(NGS)と0.3% Triton X-100からなるブロッキングバッファーを用いて、RTで1時間非特異的結合をブロックします。
   3. ブロッキングバッファー(1x PBS中の5% NGSおよび0.3% Triton X-100)で1:500に希釈したパルブアルブミンまたはカルビンジンに対する一次抗体を用いて、切片を4°Cで一晩インキュベートします。
2. 2日目
   1. 切片をPBS-Tで10分間3回洗浄します。ブロッキングバッファー(5% NGSおよび0.3% Triton X-100 in 1x PBS)で1:500に希釈した二次抗体(Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546)を用いて、室温で暗所で2時間インキュベートします。
   2. 切片を1x PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。柔らかいブラシを使用して、脳のスライスをスライドガラスに移します。
   3. 直ちに0.1 mLの退色防止用封入剤を各切片に加えます。スライスを22 mm x 50 mmのカバースリップで覆います。
   4. 共焦点顕微鏡を20倍または60倍(A / 1.4、オイル)の倍率に構成します。波長488nmおよび594nmのレーザーを使用して、関心のある脳領域のマルチチャンネル画像を取得します。

結果

パイロットシリーズの実験では、従来の皮質内注射法を使用して、CaMKIIプロモーターの下でEGFP蛍光タンパク質と融合した 高速チャネルロドプシン(oChIEF) 遺伝子を運ぶAAV2によって、マウス新皮質の5層目錐体ニューロンを形質導入しました。AAV2¹²の特徴と一致して、幅が1mmを超えない比較的小さな感染領域が得られました(図1A

ディスカッション

私たちは、AAV2ウイルス粒子の懸濁液を脳のくも膜下腔に注入することにより、マウス新皮質ニューロンを形質導入する新しい方法を開発しました。これにより、ウイルスの分布が広範囲に広がり、同量のウイルスが脳実質に直接注入された場合に感染する組織の体積の約4倍になります。

ウイルスベクターをさまざまな経路(例えば、脳室内、髄?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
10 µL Gastight Syringe Model 1701 RN (5 uL 75 RN Hamilton microsyringe)	Hamilton Company	Part/REF # 7634-01, Hamilton or cat no. HAM7634-01, Merck
33 G RN needle, point style 3	Hamilton Company	Part/REF # 7803-05, Hamilton
Binocular Microscope	Nikon or Micromed	Model MC-4 ZOOM
Cerna-based laser scanning confocal microscope	ThorLabs
Cold light source	RWD	Model 76312
Leica VT1000 S Vibrating blade microtome	Leica Biosystems	76001-014
Low-Flow Anesthesia System with starter kit	Kent Scientific Corporation	13-005-111 (Model SomnoSuite)
Mechanical Pipette 0.1 – 2.5 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000012
Mechanical Pipette 10 – 100 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000047
Mice Shaver	RWD	Model CP-5200
Microdrill with drill bits (0.5 mm, round)	RWD	78001, 78040
or Desctop Digital Stereotaxic Instrument, Mouse anesthesia Mask, Mouse ear bars (60 Deg)	RWD	Models 68027, 68665, 68306
Pressurized air	KUDO
Single Channel Manual Pipette 0.5-10 µL	RAINN	17008649
Small Animal Stereotaxic Instrument	KOPF	Model 962
Stereotaxic Injector	Stoelting	10-000-004
Surgical Instruments (Tools)
30 G dental needle (Ni-pro)	Biodent Co. Ltd.		To slit the dura
Bone scraper	Fine Science Tools	10075-16
Dental bur	DRENDEL + ZWEILING		For craniotomy; Shape: pear shaped/round end cylinder/round; Tip Diameter: 0.55-0.8 mm diameter
Needle holder (Halsey Micro Needle Holder)	Fine Science Tools	12500-12
Polypropylene Surgical Suture or Surgical Suture Vicryl (5-0, absorbable)	Walter Products (Ethicon)	S139044 (W9442)
Scalpel handle (#3) with scalpel blades (#11)	Fine Science Tools	10003-12, 10011-00
Scissors (Extra Narrow Scissors)	Fine Science Tools	14088-10	to cut the skin
Scissors (Fine Scissors)	Fine Science Tools	14094-11	to cut suture
Surgical suture PROLENE (Polyproptlene)	Ethicon (Johnson & Johnson)
Tweezers (Forceps #5)	Fine Science Tools	11252-20
Tweezers (Polished Inox Forceps)	Fine Science Tools	11210-20
Disposables
1 mL insulin syringe	SITEKMED		To load vaseline oil into a microsyringe, to administer drugs
Cell Culture Plate	SPL Life Science
Cotton swabs
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-545E
Insulin syringe needle (27 G)	SITEKMED		To remove debries from a hole (craniotomy)
Lint-free wipes CLEANWIPER	NetLink
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Paper towels	Luscan
Parafilm	StatLab	STLPM996
Sterile Surgical Gloves	Dermagrip
Drugs/Chemicals (Reagents)
10% buffered formalin or 4% paraformaldehyde	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK
Alcohol solution of iodine (5%))	Renewal
Antibiotic ointment Baneocin (bacitracin + neomycin)	Sandoz		Antibacterial agent for external use
Aqua Polymount	Poly-sciences	18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (Ophthalmic gel)	BAUSCH+LOMB (Santen)
Carboxylate-Modified FluoSphere Microspheres (red)	Thermo Fisher Scientific	F-8801
Dexamethasone (4 mg/mL)	Ellara (KRKA)		Synthetic glucocorticoid
Distilled H2O
Ethanol (70%)
Flexoprofen 2.5% (Ketoprofen)	VIC		Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs)
Glucose solution 5%	Solopharm
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A-11010
Isoflurane	Karizoo
lidocaine solution (2 % / 4%)	Solopharm
Normal Goat Serum (NGS)	Abcam	ab7481
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Eco-servis
Rabbit Anti-Parvalbumin Antibody	Merck Millipore	AB15736
Rabbit Recombinant Monoclonal anti-Calbindin antibody	Abcam	ab108404
Saline (0.9% NaCl in H2O)	Solopharm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	50-178-1844
Vaseline oil	Genel