JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описана новая методика широкой доставки аденоассоциированного вируса, использующая инфузию субарахноидального вируса. Этот метод не только обеспечивает широкую трансдукцию нейронов неокортикального мозга мыши в поверхностных слоях, но и приводит к избирательной экспрессии трансгена в пирамидальных нейронах пятого слоя, даже при использовании неселективного промотора.

Аннотация

Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы являются гибким и мощным инструментом для доставки и экспрессии различных генов, представляющих интерес во многих областях экспериментальной биологии, в частности в нейробиологии. Наиболее популярным методом стимуляции экспрессии желаемого трансгена в определенной области мозга является инъекция вектора AAV непосредственно в паренхиму мозга. Однако этот метод не позволяет широко использовать нейронную трансдукцию, которая требуется для некоторых экспериментов in vivo . В данной статье мы представляем новую методику широко распространенной экспрессии генов в неокортексе мыши, основанную на инфузии вируса в субарахноидальное пространство мозга. Этот метод маркировки нейронов не только обеспечивает широкую трансдукцию нейронов в поверхностных слоях неокортекса взрослой мыши, но и приводит к экспрессии трансгена в большой популяции пирамидальных нейронов пятого слоя с высокой специфичностью даже при использовании сильного неселективного промотора, такого как ЦАГ. Более того, поскольку клеточная трансдукция происходит на значительном расстоянии от места инъекции, этот метод может помочь сохранить мозговую ткань для последующей оптической или электрофизиологической записи нейронной активности.

Введение

Мозг млекопитающих состоит из множества тормозных, возбуждающих и модулирующих клеток, соединенных между собой триллионами синапсов. Одной из центральных задач нейробиологии является расшифровка роли различных типов клеток в организации и функционировании мозговых цепей и поведении. Манипулирование генетически определенными клетками в мозге требует методов введения и экспрессии трансгенов. Вирусные системы доставки генов на сегодняшний день являются наиболее эффективным и простым методом доставки генов в центральную нервную систему2. Системы доставки вирусов основаны на реплицирующихся вирусах (аденовирусах, аденоассоциированных вирусах (AAV), лентивирусах и ретровирусах), которые обладают способностью доставлять генетическую информацию в клетку-хозяина 2,3.

Векторы на основе AAV в настоящее время стали одним из наиболее широко используемых инструментов для доставки желаемых трансгенов в клетки мозга, как в целях фундаментальных исследований в области нейробиологии, так и для разработки генной терапии неврологических заболеваний. По сравнению с другими вирусами, дефектные репликации AAV обладают многими особенностями, которые делают их идеальными векторами для этих целей. В частности, векторы AAV эффективно трансдуцируют неделящиеся (терминально дифференцированные) клетки, такие как нейроны и глиальные клетки, что приводит к высокому уровню экспрессии трансгена in vivo2. Векторы могут быть легко получены с высоким функциональным титром, подходящим для использования in vivo 3,4,5. Важно отметить, что аденоассоциированная вирус-опосредованная доставка генов in vivo не вызывает гистопатологических изменений и векторной токсичности6. В отличие от аденовирусных векторов, введение векторов AAV in vivo на животных моделях обычно не вызывает иммунных реакций хозяина против трансдуцированных клеток, обеспечивая стабильную экспрессию трансгенов в паренхиме мозга в течение длительных периодов времени 2,7,8.

Еще одной причиной популярности AAV-векторов является широкий спектр серотипов AAV с уникальными тканевыми и клеточными тропизмами 9,10,11,12,13,14. Различные капсидные белки, экспрессируемые различными серотипами AAV, приводят к использованию различных рецепторов клеточной поверхности для проникновения в клетку и, таким образом, к специфическим тропизмам10,14.

Тропизм AAV определяется не только капсидными белками, но и многими другими факторами14. Было показано, что серотипы AAV 1, 2, 6, 7, 8 и 9 трансдуцировали как нейроны, так и астроциты в первичной культуре15,16, но демонстрировали сильный нейрональный тропизм после интрапаренхиматозной инъекции мозга17,18. Метод, используемый для получения вектора AAV, также может влиять на тропизм нервных клеток, даже для одного и того же серотипа. Например, очищенный от CsCl AAV8 обладал сильным астроглиальным тропизмом после внутрипаренхиматозной инъекции в мозг, в то время как йодиксанол-очищенный AAV8, введенный в идентичных условиях, трансдуцировал только нейроны19. На тропизм AAV также могут влиять введенная доза и объем14. Например, высокий титр rAAV2/1 эффективно трансдуцировал как корковые возбуждающие, так и тормозные нейроны, но использование более низких титров показало сильное предпочтение трансдукции корковых тормозных нейронов20.

Таким образом, невозможно достичь устойчивой специфичности типа клеток, основанной исключительно на серотипе капсида. Промоторы, специфичные для клеточного типа, могут быть использованы для преодоления широкого естественного тропизма AAV-капсида. Например, человеческий синапсин I используется для нацеливания на нейроны21, промотор CaMKII может управлять экспрессией трансгена в глутаматергических возбуждающих нейронах с высокой специфичностью20, промотор ppHcrt нацелен на нейроны, экспрессирующие гипокретин (HCRT) в латеральном гипоталамусе22, промотор PRSx8 нацелен на норадренергические и адренергические нейроны, экспрессирующие дофамин-бета-гидроксилазу23, а промотор GFAP может управлять специфической экспрессиейастроцитов 24. Тем не менее, некоторые специфические для клеток промоторы обладают слабой транскрипционной активностью и не могут управлять достаточным уровнем экспрессиитрансгенов25. Кроме того, короткие промоторы, которые входят в состав вирусных векторов AAV, часто не сохраняют специфичность типа клеток 1,26. Например, было показано, что конструкция CaMKII также трансдуцирует тормозные нейроны12.

Помимо специфичности типа клеток (тропизма), еще одной важной особенностью AAV является эффективность трансдукции. Различные серотипы AAV обладают различными диффузионными свойствами. AAV2 и четыре вирусных вектора менее легко диффундируют через паренхиму мозга и, следовательно, опосредуют трансдукцию на меньшей площади17,27. Наиболее распространенная нейрональная трансдукция наблюдается при серотипах AAV 1, 9 и rh.10 11,17,18,19,28.

Наиболее популярным методом стимуляции экспрессии желаемого трансгена в определенной области мозга является инъекция вектора AAV непосредственно в интересующую область мозга (паренхиму). После внутрипаренхиматозной инъекции даже серотипы AAV с более эффективной диффузией через мозг обычно трансдуцируют только локальную область вокруг места инъекции 12. Более того, внутрипаренхиматозная инъекция является инвазивной процедурой и приводит к повреждению тканей, прилегающих к интересующей области. Таким образом, данный способ внедрения вируса не подходит для некоторых экспериментальных задач. Например, обширная маркировка клеток крайне желательна в экспериментах, направленных на изучение функций корковых нейронов у свободно движущихся животных, в том числе с использованием одно- или двухфотонной микроскопии 29,30,31,32.

В данной статье мы описываем новую технику инъекции аденоассоциированного вируса, в которой используется инфузия субарахноидального вируса для обеспечения широкой трансдукции нейронов неокортекса у взрослых мышей и сохранения мозговой ткани для последующей оптической или электрофизиологической регистрации нейронной активности. Этот метод не только обеспечил широкую трансдукцию нейронов в поверхностных слоях неокортекса, но и привел к экспрессии трансгена в большой популяции пирамидальных нейронов пятого слоя с высокой специфичностью даже при использовании сильного неселективного промотора, такого как ЦАГ.

протокол

Эксперименты проводили на взрослых мышах C57Black/6 в возрасте 2-4 месяцев обоего пола (Пущинский селекционный центр филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Овчинникова РАН). Мышей содержали в виварии с регулируемой температурой (22 °C ± 2 °C, цикл свет/темнота 12 часов, свет включается в 08:00 ч) с едой и водой в неограниченном количестве. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами ARRIVE, а также Директивой 2010/63/ЕС для экспериментов на животных. Протокол исследования утвержден Этическим комитетом ИГН РАН (протокол N1 от 01.02.2022). Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и обеспечить достоверность результатов.

1. Подготовка к операции

  1. Стерилизуйте все хирургические инструменты до начала операции. Очистите операционную область, используя 70% этанол.
  2. Проверьте уровень изофлурана в анестезиологической системе и при необходимости заполните его. Положите на дно индукционной камеры чистое бумажное полотенце.
  3. Поместите грелку на стереотаксическую рамку. Накройте подушечку чистым бумажным полотенцем.
  4. Подготовьте флакон с 2% отбеливателем для сбора наконечников микропипеток, пробирок, ватных палочек и других предметов, контактирующих с вирусом.
  5. Достаньте аликвоту AAV из морозильной камеры при температуре -80 °C и положите ее на лед для оттаивания.

2. Подготовка шприца

  1. Очистите микрошприц Hamilton объемом 5 мкл с помощью тупой иглы RN 33G. Аспиратуйте, а затем дозируйте 70% этанол. Повторите 3 раза со свежим этанолом. Промойте шприц дистиллированной водой, чтобы удалить излишки этанола. Повторите 3 раза.
  2. Выньте поршень и заполните цилиндр вазелиновым маслом через фланец с помощью инсулинового шприца. Следите за тем, чтобы в микрошприце не было пузырьков воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Захваченный воздух сжимается и влияет на точность и аккуратность шприца.
  3. Поместите поршень обратно в микрошприц и выдавите каплю масла. Поместите шприц в стереотаксический инжектор так, чтобы была видна шкала для контроля объема выдаваемого раствора.

3. Подготовка мышей к операции

  1. Взвесьте мышь. Поместите мышь в индукционную камеру анестезии, подключенную к изофлурану. Включите вапорайзер изофлурана на 5% и отрегулируйте скорость потока до 250 мл/мин. Адекватная глубина анестезии достигается в течение 5-7 минут.
  2. Чтобы проверить хирургический уровень анестезии, проверьте отсутствие вздергивания и рефлекса отмены во время болезненного щипки задней лапы, а также отсутствие моргания при контакте с глазами.
  3. Переключите выпускной клапан испарителя с индукционной камеры на стереотаксическую маску. Уменьшите концентрацию изофлурана до 1,8%-2,0% и установите скорость потока в зависимости от веса мыши (70-90 мл/мин для мышей весом от 25 до 35 г).
  4. Извлеките мышь из индукционной камеры и поместите ее в стереотаксический аппарат поверх грелки (37 °C), чтобы предотвратить переохлаждение во время хирургической анестезии. Поместите передние зубы в зубную планку, а затем установите маску животного.
  5. Осторожно расположите животное на ушных планках. Правильное положение головы в стереотаксическом аппарате позволяет осуществлять вертикальное, но не боковое движение головы. Убедитесь, что положение животного не вызывает стресса. Внимательно следите за глубиной анестезии, дыханием животного и температурой тела на протяжении всей операции.
  6. Побрейте голову от глаз до задних ушей. Очистите выбритую поверхность головы, протерев там 70% этанол с последующим смазыванием 5% спиртовым раствором йода.
  7. Нанесите офтальмологический гель для предотвращения сухости глаз. Применяйте 4% раствор лидокаина местно и дексаметазон (0,02 мл в дозе 4 мг/мл) подкожно для предотвращения боли, связанной с хирургическим вмешательством, и уменьшения возможной воспалительной реакции.
  8. Стерильным лезвием скальпеля и ножницами сделайте разрез длиной 4-5 мм по средней линии головы, чтобы открыть кожу головы. Начните с небольшого разреза между ушами, а затем расширьте его с помощью ножниц, чтобы избежать повреждения черепа.
  9. Промокните поверхность черепа небольшим количеством 3% перекиси водорода, чтобы визуализировать стереотаксические ориентиры: брегму и лямбду. Немедленно остановите реакцию с помощью 0,9% раствора NaCl. Соскребите ткани на верхней части черепа с помощью скребка для костей.
  10. Установите заранее подготовленный моторизованный инжектор со шприцем Гамильтона на стереотаксический рычаг. Направьте хирургический источник света на открытый череп и сфокусируйте микроскоп на брегме.
  11. Глядя в микроскоп, манипулируйте рычагом стереотаксического аппарата так, чтобы верхняя часть иглы располагалась непосредственно над брегмой.
  12. С помощью кончика иглы выровняйте брегму и лямбду по горизонтали, а затем переместите руку обратно в брегму и запишите координаты. Используйте эти координаты брегмы и координаты атласа интересующей области для вычисления относительных координат целевой области.
  13. Переместите иглу в целевую область. Опустите иглу по новым координатам и отметьте это положение. Выберите место для вирусной микроинъекции в непосредственной близости от целевой области с учетом распространения вируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит избежать повреждения тканей в интересующей области. Для интересующей области использовались следующие координаты: AP-3.4, ML -2.0, а для вирусных микроинъекций: AP-2.0, ML -1.4. Приведенные выше координаты являются оптимальными, если предполагается инфицирование первичных нейронов зрительной коры.
  14. По возможности избегайте областей с крупными кровеносными сосудами. Под хирургическим микроскопом при ярком холодном освещении и погружении 0,9% солевым раствором NaCl крупные кровеносные сосуды в черепе и на поверхности мозга должны стать очевидными.

4. Внедрение вирусов

  1. Возьмите стерильный зубной бор (0,5 – 0,8 мм в диаметре). Рассматривая поверхность черепа через операционный микроскоп, просверлите небольшой трепанацию черепа вручную (вручную) или с помощью микродрели. Следите за тем, чтобы не оказывать чрезмерного давления на череп.
  2. Отведите руку в сторону, чтобы не повредить иглу микрошприца во время сверления трепанации черепа (отверстия). Нанесите 0,9% раствор NaCl и периодически делайте паузы, чтобы не нагреть кость и не повредить твердую мозговую оболочку. Используйте сжатый воздух, чтобы сдуть костную пыль.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подходят следующие типы твердосплавных зубных боров: грушевидные (предпочтительно), округлые цилиндрические и круглые.
    1. При истончении кости с помощью бора убедитесь, что истончение равномерно по всей окружности. Это облегчит удаление кости без повреждения твердой мозговой оболочки. Для этого сначала используют бор с круглым кончиком, а затем бор с плоским кончиком. Держите бор перпендикулярно кости; В противном случае одна сторона будет тоньше другой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, чем меньше размер бора и чем меньше выполненная трепанация черепа, тем сложнее будет манипуляция. Рекомендуется выполнять трепанацию черепа меньшего диаметра (0,5-0,6 мм) при дальнейшем использовании животного для работы in vivo . Если вы планируете использовать мозг животного для работы ex vivo , для упрощения процедуры приемлем больший диаметр черепа.
  3. Когда истонченная кость станет мягкой и прозрачной, прекратите сверление. Когда в кости образуется достаточно большое углубление, часто останавливайте вращение и следите за толщиной кости. Появление трещин на кости свидетельствует о том, что достаточно истончения.
  4. Промойте отверстие стерильным физиологическим раствором, а затем удалите излишки солевого раствора ватным тампоном. Удалите оставшийся слой кости с помощью иглы 27G с крючкообразным наконечником и/или пинцета с тонким наконечником. Не повреждайте твердую мозговую оболочку.
  5. Накройте поверхность черепа стерильным куском бумажного полотенца, смоченного в физрастворе. Положите кусок чистой прозрачной пленки на поверхность черепа мыши над бумагой.
  6. Отодвиньте стереотаксический кронштейн назад и расположите иглу микрошприца на месте прямо над пленкой. Слейте излишки масла до тех пор, пока не будет достигнут объем 2 μл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем масла может варьироваться в зависимости от объема микрошприца. Мы использовали микрошприц Hamilton объемом 5 мкл 75-RN.
  7. Нанесите пипеткой на кусок прозрачной пленки объем вируса, равный введенному объему + 2 μл.
  8. Глядя в операционный микроскоп, опустите руку вниз до тех пор, пока кончик иглы не окажется в центре капли вируса. Загрузите вирус в микрошприц с помощью моторизованного инжектора. Выбросьте кончик микропипетки и прозрачную пленку во флакон с 2% отбеливателем.
  9. Снимите с поверхности черепа бумагу, смоченную солевым раствором, и высушите череп ватным тампоном. С помощью стереотаксического рычага расположите иглу над местом введения.
  10. Распылите каплю вируса, чтобы убедиться, что игла не забита. Сделайте небольшой разрез в твердой мозговой оболочке с помощью иглы 30 G с крючкообразным наконечником.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сделать как можно меньший разрез в твердой мозговой оболочке, позволяющий игле войти, не оставляя зазора между иглой и твердой мозговой оболочкой, из которого может просочиться вирус.
  11. Опустите иглу шприца вниз к твердой мозговой оболочке и произведите соответствующие расчеты глубины. Оцените корковую глубину введения относительно точки, в которой игла впервые коснулась поверхности коры.
  12. Медленно введите кончик иглы в кору головного мозга на глубину до 300 мкм. Подождите 2-3 минуты, чтобы твердая мозговая оболочка прилипла к игле, а затем медленно втяните иглу на глубину 200 мкм. Подождите еще 2-3 минуты, чтобы ткани мозга остыли. Это приводит к тому, что игла подтягивает твердую мозговую оболочку вверх, создавая субдуральное пространство для распространения вируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму повреждение коры головного мозга, используйте иглу 33 G или опустите иглы G. Имейте в виду, что чем меньше внутренний диаметр наконечника, тем выше вероятность его закупорки тканевым оттоком. Важно использовать тупую иглу вместо скошенной, потому что тупая игла выделяет более контролируемую каплю вирусного раствора.
    1. Если игла при опускании не проходит через твердую мозговую оболочку на 150-200 мкм, а вместо этого изгибает ее, опускание прекратите. Поднимите иглу и сделайте немного больший разрез в твердой мозговой оболочке, затем попробуйте опустить иглу еще раз.
    2. Если спинномозговая жидкость начинает активно вытекать из разреза во время опускания иглы, подождите, пока она перестанет вытекать; В противном случае будет трудно контролировать прохождение иглы через твердую мозговую оболочку. Промокните лишнюю спинномозговую жидкость тканевым кончиком. Как только жидкость перестанет течь, поднимите иглу и повторите попытку.
  13. Начните вводить вирусную суспензию со скоростью 0,06 мкл/мин, контролируя при этом выдаваемый объем. Введите 1 мкл вируса. Вводите вирус на одну глубину, чтобы не нарушить пломбу между иглой и тканью коры головного мозга.
    1. Устранение неполадок: В начале инъекции может произойти обратный ток вируса к поверхности мозга. Прекратите инъекцию, подождите 2-3 минуты, а затем продолжайте инъекцию вируса. Повторяйте эти действия (шаги) до тех пор, пока обратный поток вируса не остановится. Вирус и спинномозговая жидкость будут прилипать к игле и препятствовать обратному току.
    2. Еще один способ остановить обратный ток вируса, нанести небольшое количество агарозы на поверхность коры. Он подавит пульсацию коры головного мозга, а также поможет запечатать иглу. Но следите за тем, чтобы пипетка не была забита агарозой.
    3. Поскольку игла при опускании может проходить через твердую мозговую оболочку не полностью, а лишь частично, одна сторона иглы может не плотно прилегать к твердой мозговой оболочке, что может вызвать обратный поток вируса. В этом случае медленно извлеките иглу из ткани и попробуйте опустить ее снова.
  14. После завершения инфузии удерживайте иглу в целевом месте еще 10 минут. Это позволяет вирусу распространяться вдали от места инъекции. Медленно втягивайте иглу из мозга, чтобы предотвратить попадание вируса обратно из игольчатого тракта.
  15. После того, как забор иглы будет завершен, убедитесь, что она не забита, выпустив небольшую каплю вируса. Закройте разрез кожи с помощью 5-0 рассасывающихся или нерассасывающихся швов.

5. Послеоперационный уход

  1. После закрытия разреза нанести антибактериальную мазь местно. Введите смесь физиологического раствора (5 мл/кг) и 5% глюкозы (5 мл/кг) подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание и облегчить восстановление после анестезии. Введите кетопрофен внутримышечно (2,5 мг/кг) для уменьшения боли.
  2. Поместите животное в свежую клетку поверх грелки и наблюдайте, пока оно не оправится от анестезии. После того как мышь начнет реагировать, поместите животное в домашнюю клетку.

6. Гистология

  1. Не ранее, чем через 21 день после введения вируса, глубоко обезболить мышей изофлураном, как описано в шаге 3.
  2. Сделайте разрез по средней линии (10 -15 мм) вдоль грудного отдела с помощью узких ножниц и обнажите грудную полость. Аккуратно отделите диафрагму и откройте грудную клетку с помощью ножниц.
  3. Введите иглу 22G 1 1/2 в левый желудочек и сделайте разрез в правом предсердии ножницами. Перфузируйте 50 мл предварительно охлажденного 100 мМ фосфатного буферного раствора (PBS), а затем 100 мл предварительно охлажденного 10% буферизованного формалина.
  4. Аккуратно извлеките весь мозг мыши. Для этого нужно сделать сагиттальный разрез по центру кожи головы с помощью ножниц. Затем удаляйте черепную кость по частям с помощью костных плоскогубцев с плоскими концами, начиная от пересечения сагиттального и лямбдоидного швов и продвигаясь вперед к носовой кости. Когда мозг обнажен, разрежьте обонятельные луковицы, облегчите мозг изогнутым шпателем и опустите его в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10% буферного формалина.
  5. Зафиксируйте мозг на ночь. Закрепите мозговую ткань на металлической платформе вибратома с помощью тканевого клея. Режьте лобовые секции толщиной 50 мкм с помощью лезвий из углеродистой стали.

7. Иммуноокрашивание

  1. День 1
    1. Промойте ломтики мозга 3 раза в течение 5 минут каждый 1x PBS, содержащим 0,3% Triton X-100 (PBS-T). Инкубируйте секции в PBS-T в течение 20 минут при комнатной температуре (RT).
    2. Блокируйте неспецифическое связывание в течение 1 ч при ЛТ, используя блокирующий буфер, состоящий из 5% нормальной козьей сыворотки (NGS) и 0,3% Triton X-100 в 1x PBS.
    3. Инкубируйте срезы в течение ночи при 4 °C с первичными антителами против парвальбумина или кальбиндина, разведенными в соотношении 1:500 в блокирующем буфере (5% NGS и 0,3% Triton X-100 в 1x PBS).
  2. День 2
    1. Промойте срезы 3 раза в течение 10 минут в PBS-T. Инкубировать в темноте в течение 2 ч при ЛТ с вторичными антителами (Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Parentbody, Alexa Fluor 546), разведенными в соотношении 1:500 в блокирующем буфере (5% NGS и 0,3% Triton X-100 в 1x PBS).
    2. Вымойте секции 3 раза по 5 минут каждая в 1x PBS. Перенесите срезы мозга на предметные стекла с помощью мягкой щетки.
    3. Немедленно добавьте 0,1 мл монтажной среды, препятствующей выцветанию, в каждую секцию. Накройте ломтики покровным стеклом размером 22 мм x 50 мм.
    4. Настройте конфокальный микроскоп на увеличение 20x или 60x (A/1.4, масло). Используйте лазеры с длиной волны 488 нм и 594 нм для получения многоканальных изображений интересующих областей мозга.

Результаты

В пилотной серии экспериментов мы использовали традиционный метод интракортикальной инъекции для трансдукции пирамидальных нейронов пятого слоя неокортекса мыши с помощью AAV2, несущего ген быстрого каналродопсина (oChIEF), слитый с флуоресцентным белком EGFP под пр?...

Обсуждение

Мы разработали новый метод трансдукции нейронов неокортикальной коры мыши путем введения суспензии вирусных частиц AAV2 в субарахноидальное пространство мозга. Это обеспечивает широкое распространение вируса, почти в четыре раза превышающее объем инфицированной тк?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант 20-15-00398P.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
10 µL Gastight Syringe Model 1701 RN (5 uL 75 RN Hamilton microsyringe)Hamilton CompanyPart/REF # 7634-01, Hamilton or cat no. HAM7634-01, Merck
33 G RN needle, point style 3Hamilton CompanyPart/REF # 7803-05, Hamilton
Binocular MicroscopeNikon or MicromedModel MC-4 ZOOM
Cerna-based laser scanning confocal microscopeThorLabs
Cold light sourceRWDModel 76312
Leica VT1000 S Vibrating blade microtomeLeica Biosystems76001-014
Low-Flow Anesthesia System with starter kitKent Scientific Corporation13-005-111 (Model SomnoSuite)
Mechanical Pipette 0.1 – 2.5 µL Eppendorf Research plusEppendorf3123000012
Mechanical Pipette 10 – 100 µL Eppendorf Research plusEppendorf3123000047
Mice ShaverRWDModel CP-5200
Microdrill with drill bits (0.5 mm, round)RWD78001, 78040
or Desctop Digital Stereotaxic Instrument, Mouse anesthesia Mask, Mouse ear bars (60 Deg)RWDModels 68027, 68665, 68306
Pressurized airKUDO
Single Channel Manual Pipette 0.5-10 µLRAINN17008649
Small Animal Stereotaxic InstrumentKOPFModel 962
Stereotaxic InjectorStoelting10-000-004
Surgical Instruments (Tools)
30 G dental needle (Ni-pro)Biodent Co. Ltd.To slit the dura
Bone scraperFine Science Tools10075-16
Dental burDRENDEL + ZWEILINGFor craniotomy; Shape: pear shaped/round end cylinder/round; Tip Diameter: 0.55-0.8 mm diameter
Needle holder (Halsey Micro Needle Holder)Fine Science Tools12500-12
Polypropylene Surgical Suture or Surgical Suture Vicryl (5-0, absorbable)Walter Products (Ethicon)S139044 (W9442)
Scalpel handle (#3) with scalpel blades (#11)Fine Science Tools10003-12, 10011-00
Scissors (Extra Narrow Scissors)Fine Science Tools14088-10to cut the skin
Scissors (Fine Scissors)Fine Science Tools14094-11to cut suture
Surgical suture PROLENE (Polyproptlene)Ethicon (Johnson & Johnson)
Tweezers (Forceps #5)Fine Science Tools11252-20
Tweezers (Polished Inox Forceps)Fine Science Tools11210-20
Disposables
1 mL insulin syringeSITEKMEDTo load vaseline oil into a microsyringe, to administer drugs
Cell Culture PlateSPL Life Science
Cotton swabs
Cover GlassesFisher Scientific12-545E
Insulin syringe needle (27 G)SITEKMEDTo remove debries from a hole (craniotomy)
Lint-free wipes CLEANWIPERNetLink
Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Paper towelsLuscan
ParafilmStatLabSTLPM996
Sterile Surgical GlovesDermagrip
Drugs/Chemicals (Reagents)
10% buffered formalin or 4% paraformaldehydeThermo Scientific ChemicalsJ61899.AK
Alcohol solution of iodine (5%))Renewal
Antibiotic ointment Baneocin (bacitracin + neomycin)SandozAntibacterial agent for external use
Aqua PolymountPoly-sciences18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (Ophthalmic gel)BAUSCH+LOMB (Santen)
Carboxylate-Modified FluoSphere Microspheres (red)Thermo Fisher ScientificF-8801
Dexamethasone (4 mg/mL)Ellara (KRKA)Synthetic glucocorticoid
Distilled H2O
Ethanol (70%)
Flexoprofen 2.5% (Ketoprofen)VICNonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs)
Glucose solution 5%Solopharm
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA-11010
IsofluraneKarizoo
lidocaine solution (2 % / 4%)Solopharm
Normal Goat Serum (NGS)Abcamab7481
Phosphate Buffered Saline (PBS)Eco-servis
Rabbit Anti-Parvalbumin AntibodyMerck MilliporeAB15736
Rabbit Recombinant Monoclonal anti-Calbindin antibodyAbcamab108404
Saline (0.9% NaCl in H2O)Solopharm
Triton X-100Sigma-Aldrich50-178-1844
Vaseline oilGenel

Ссылки

  1. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
  2. Sena-Esteves, M., Gao, G. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (8), (2020).
  3. Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene Therapy with Viral Vectors. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 43 (1), 413-439 (2003).
  4. Paterna, J. C., Feldon, J., Büeler, H. Transduction profiles of recombinant adeno-associated virus vectors derived from serotypes 2 and 5 in the nigrostriatal system of rats. J Virol. 78 (13), 6808-6817 (2004).
  5. Monahan, P. E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus vectors for gene therapy: more pros than cons. Mol Med Today. 6 (11), 433-440 (2000).
  6. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21 (4), 583-593 (2008).
  7. Jooss, K., Chirmule, N. Immunity to adenovirus and adeno-associated viral vectors: implications for gene therapy. Gene Ther. 10 (11), 955-963 (2003).
  8. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  9. Gao, G., Vandenberghe, L., Wilson, J. New Recombinant Serotypes of AAV Vectors. Curr Gene Ther. 5 (3), 285-297 (2005).
  10. Büning, H., Perabo, L., Coutelle, O., Quadt-Humme, S., Hallek, M. Recent developments in adeno-associated virus vector technology. J Gene Med. 10 (7), 717-733 (2008).
  11. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PloS One. 8 (9), e76310-e76310 (2013).
  12. Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neurosci Res. 93, 144-157 (2015).
  13. de Solis, C. A., et al. Adeno-associated viral serotypes differentially transduce inhibitory neurons within the rat amygdala. Brain Res. 1672, 148-162 (2017).
  14. Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV Tropism in the Nervous System with Natural and Engineered Capsids. Meth Mol Biol. 1382, 133-149 (2016).
  15. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  16. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
  17. Burger, C., et al. Recombinant AAV Viral Vectors Pseudotyped with Viral Capsids from Serotypes 1, 2, and 5 Display Differential Efficiency and Cell Tropism after Delivery to Different Regions of the Central Nervous System. Mol Ther. 10 (2), 302-317 (2004).
  18. Cearley, C. N., Wolfe, J. H. Transduction characteristics of adeno-associated virus vectors expressing cap serotypes 7, 8, 9, and Rh10 in the mouse brain. Mol Ther. 13 (3), 528-537 (2006).
  19. Klein, R. L., Dayton, R. D., Tatom, J. B., Henderson, K. M., Henning, P. P. AAV8, 9, Rh10, Rh43 vector gene transfer in the rat brain: effects of serotype, promoter and purification method. Mol Ther. 16 (1), 89-96 (2008).
  20. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  21. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  22. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  23. Abbott, S. B. G., et al. Photostimulation of retrotrapezoid nucleus phox2b-expressing neurons in vivo produces long-lasting activation of breathing in rats. J Neurosci. 29 (18), 5806-5819 (2009).
  24. Lawlor, P. A., Bland, R. J., Mouravlev, A., Young, D., During, M. J. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Mol Ther. 17 (10), 1692-1702 (2009).
  25. Adamantidis, A. R., Zhang, F., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetics: Opsins and Optical Interfaces in Neuroscience. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (8), (2014).
  26. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat Protoc. 5 (3), 439-456 (2010).
  27. Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene Delivery to the Mouse Brain with Adeno-Associated Virus. Methods Mol Biol. 246, 225-236 (2004).
  28. Davidson, B. L., et al. Recombinant adeno-associated virus type 2, 4, and 5 vectors: Transduction of variant cell types and regions in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci. 97 (7), 3428-3432 (2000).
  29. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  30. Harris, K. D., Shepherd, G. M. G. The neocortical circuit: themes and variations. Nat Neurosci. 18 (2), 170-181 (2015).
  31. Carrillo-Reid, L., Yang, W., Kang Miller, J., Peterka, D. S., Yuste, R. Imaging and Optically Manipulating Neuronal Ensembles. Ann Rev Biophy. 46 (1), 271-293 (2017).
  32. Smirnov, I. V., et al. Plasticity of Response Properties of Mouse Visual Cortex Neurons Induced by Optogenetic Tetanization In Vivo. Curr Issues Mol Biol. 46 (4), 3294-3312 (2024).
  33. Snyder, B. R., et al. Comparison of Adeno-Associated Viral Vector Serotypes for Spinal Cord and Motor Neuron Gene Delivery. Human Gene Ther. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  34. Schuster, D. J., et al. Biodistribution of adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vector after intrathecal and intravenous delivery in mouse. Front Neuroanat. 8, 42 (2014).
  35. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral Strategies for Targeting the Central and Peripheral Nervous Systems. Ann Rev Neurosci. 41 (1), 323-348 (2018).
  36. Lo, W. D., et al. Adeno-Associated Virus-Mediated Gene Transfer to the Brain: Duration and Modulation of Expression. Human Gene Ther. 10 (2), 201-213 (1999).
  37. Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., McCown, T. J., Ju de Samulski, R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
  38. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 55-73 (2009).
  39. Daci, R., Flotte, T. R. Delivery of Adeno-Associated Virus Vectors to the Central Nervous System for Correction of Single Gene Disorders. Int J Mol Sci. 25 (2), 1050 (2024).
  40. Dasgupta, K., Jeong, J. Developmental biology of the meninges. Genesis. 57 (5), e23288-e23288 (2019).
  41. Mestre, H., Mori, Y., Nedergaard, M. The Brain's Glymphatic System: Current Controversies. Trends Neurosci. 43 (7), 458-466 (2020).
  42. Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
  43. Hordeaux, J., et al. Long-term neurologic and cardiac correction by intrathecal gene therapy in Pompe disease. Acta Neuropathol Comm. 5 (1), 66 (2017).
  44. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  45. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood-brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. Mol Ther. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  46. Radhiyanti, P. T., Konno, A., Matsuzaki, Y., Hirai, H. Comparative study of neuron-specific promoters in mouse brain transduced by intravenously administered AAV-PHP.eB. Neurosci Lett. 756, 135956 (2021).
  47. Li, X., et al. Skin suturing and cortical surface viral infusion improves imaging of neuronal ensemble activity with head-mounted miniature microscopes. J Neurosci Meth. 291, 238-248 (2017).
  48. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nat Comm. 10 (1), 4174 (2019).
  49. Thomson, A. M. Neocortical layer 6, a review. Front Neuroanat. 4, 13 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены