Transduction généralisée des neurones néocorticaux de souris par injection sous-arachnoïdienne d’AAV2

Résumé

Une nouvelle technique d’administration généralisée d’un virus adéno-associé qui utilise la perfusion de virus sous-arachnoïdien est décrite. Cette méthode assure non seulement une transduction généralisée des neurones néocorticaux de souris dans les couches superficielles, mais entraîne également une expression sélective du transgène dans les neurones pyramidaux de la couche cinq, même en utilisant un promoteur non sélectif.

Résumé

Les virus adéno-associés recombinants sont un outil flexible et puissant pour la délivrance et l’expression de divers gènes d’intérêt dans de nombreux domaines de la biologie expérimentale, en particulier en neurosciences. La méthode la plus populaire pour stimuler l’expression d’un transgène souhaité dans une zone cérébrale particulière consiste à injecter un vecteur AAV directement dans le parenchyme cérébral. Cependant, cette méthode ne permet pas la transduction neuronale généralisée qui est nécessaire pour certaines expériences in vivo . Dans cet article, nous présentons une nouvelle technique d’expression génique généralisée dans le néocortex de la souris basée sur l’infusion virale dans l’espace sous-arachnoïdien du cerveau. Cette méthode de marquage neuronal assure non seulement une transduction généralisée des neurones dans les couches néocorticales superficielles de souris adultes, mais entraîne également l’expression du transgène dans une grande population de neurones pyramidaux de couche cinq avec une spécificité élevée, même en utilisant un promoteur non sélectif fort tel que le CAG. De plus, comme la transduction cellulaire a lieu à une distance significative du site d’injection, cette méthode peut aider à préserver le tissu cérébral pour les enregistrements optiques ou électrophysiologiques ultérieurs de l’activité neuronale.

Introduction

Le cerveau des mammifères se compose de nombreuses cellules inhibitrices, excitatrices et modulatrices interconnectées en circuits par des milliards de synapses¹. L’un des principaux défis des neurosciences est de décoder le rôle des différents types de cellules dans l’organisation et la fonction des circuits cérébraux et du comportement. La manipulation de cellules génétiquement définies dans le cerveau nécessite des méthodes pour introduire et exprimer des transgènes. Les systèmes d’administration de gènes basés sur des virus sont de loin la méthode la plus efficace et la plus simple pour l’administration de gènes dans le système nerveux central². Les systèmes d’administration virale sont basés sur la réplication de virus (adénovirus, virus adéno-associés (AAV), lentivirus et rétrovirus) qui ont la capacité de délivrer des informations génétiques dans une cellule hôte ^2,3.

Les vecteurs basés sur les AAV sont maintenant devenus l’un des outils les plus largement utilisés pour l’administration des transgènes souhaités aux cellules du cerveau, à la fois à des fins de recherche fondamentale en neurosciences et pour développer une thérapie génique pour les maladies neurologiques. Comparés à d’autres virus, les AAV défectueux possèdent de nombreuses caractéristiques qui en font des vecteurs idéaux à ces fins. Plus particulièrement, les vecteurs AAV transduisent efficacement les cellules non divisées (différenciées en phase terminale) telles que les neurones et les cellules gliales, ce qui entraîne des niveaux élevés d’expression du transgène in vivo². Les vecteurs peuvent être facilement produits à un titre fonctionnel élevé adapté à une utilisation in vivo ^3,4,5. Il est important de noter que l’administration de gènes adéno-associés par le virus in vivo ne produit pas d’altérations histopathologiques ni de toxicité liée aux vecteurs⁶. Contrairement aux vecteurs adénoviraux, l’administration in vivo de vecteurs AAV dans des modèles animaux ne provoque généralement pas de réponses immunitaires de l’hôte contre les cellules transduites, ce qui permet une expression stable du transgène dans le parenchyme cérébral pendant de longues périodes de temps ^2,7,8.

Une autre raison de la popularité des vecteurs AAV est le large éventail de sérotypes AAV avec des tropismes tissulaires et cellulaires uniques 9,10,11,12,13,14. Des protéines de capside distinctes exprimées par différents sérotypes AAV entraînent l’utilisation de différents récepteurs de surface cellulaire pour l’entrée cellulaire et, par conséquent, des tropismes spécifiques^10,14.

Le tropisme AAV est déterminé non seulement par les protéines de la capside, mais aussi par de nombreux autres facteurs¹⁴. Il a été démontré que les sérotypes AAV 1, 2, 6, 7, 8 et 9 transduisaient à la fois les neurones et les astrocytes en culture primaire^15,16, mais présentaient un fort tropisme neuronal après injection intraparenchymateuse dans le cerveau^17,18. La méthode utilisée pour la préparation des vecteurs AAV peut également influencer le tropisme des cellules nerveuses, même pour le même sérotype. Par exemple, l’AAV8 purifié par CsCl possédait un fort tropisme astroglial après injection intraparenchymateuse dans le cerveau, tandis que l’AAV8 purifié par l’iodixanol, injecté dans des conditions identiques, ne transduisait que les neurones¹⁹. Le tropisme AAV peut également être affecté par la dose injectée et le volume¹⁴. Par exemple, un titre élevé rAAV2/1 a efficacement transduit à la fois les neurones excitateurs et inhibiteurs corticaux, mais l’utilisation de titres plus faibles a révélé une forte préférence pour la transduction des neurones inhibiteurs corticaux²⁰.

Ainsi, il n’est pas possible d’obtenir une spécificité de type cellulaire robuste basée uniquement sur le sérotype de la capside. Des promoteurs spécifiques au type cellulaire peuvent être utilisés pour surmonter le large tropisme naturel de la capside de l’AAV. Par exemple, la synapsine I humaine est utilisée pour cibler les neurones²¹, le promoteur CaMKII peut piloter l’expression du transgène dans les neurones excitateurs glutamatergiques à haute spécificité²⁰, le promoteur ppHcrt cible les neurones exprimant l’hypocrétine (HCRT) dans l’hypothalamus^{latéral 22}, le promoteur PRSx8 cible les neurones noradrénergiques et adrénergiques qui expriment la dopamine bêta-hydroxylase²³, et le promoteur GFAP peut piloter l’expression spécifique des astrocytes²⁴. Cependant, certains promoteurs spécifiques des cellules ont une faible activité transcriptionnelle et ne peuvent pas entraîner des niveaux suffisants d’expression du transgène²⁵. De plus, les promoteurs courts qui s’adaptent aux vecteurs viraux AAV ne conservent souvent pas la spécificité du type cellulaire ^1,26. Par exemple, il a été démontré qu’une construction CaMKII transduisait également les neurones inhibiteurs¹².

Outre la spécificité du type de cellule (tropisme), une autre caractéristique importante des AAV est l’efficacité de la transduction. Les différents sérotypes AAV ont des propriétés de diffusion différentes. L’AAV2 et quatre vecteurs viraux se diffusent moins facilement à travers le parenchyme cérébral et, par conséquent, médient la transduction sur une zone plus petite^17,27. La transduction neuronale la plus répandue est observée avec les sérotypes AAV 1, 9 et rh.10 11,17,18,19,28.

La méthode la plus populaire pour stimuler l’expression d’un transgène souhaité dans une zone cérébrale particulière consiste à injecter le vecteur AAV directement dans la région cérébrale d’intérêt (parenchyme)³. Après une injection intra-parenchymateuse, même les sérotypes AAV avec une diffusion plus efficace à travers le cerveau ne transduisent généralement qu’une zone locale autour du site d’injection ¹². De plus, l’injection intraparenchymateuse est une procédure invasive qui entraîne des lésions tissulaires adjacentes à la région d’intérêt. Ainsi, cette méthode d’injection de virus est inadaptée à certaines tâches expérimentales. Par exemple, un marquage approfondi des cellules est hautement souhaitable dans les expériences visant à étudier les fonctions des neurones corticaux chez les animaux en mouvement libre, y compris avec l’utilisation de la microscopie à un ou deux photons 29,30,31,32.

Ici, nous décrivons une nouvelle technique d’injection de virus adéno-associé qui utilise la perfusion de virus sous-arachnoïdien pour fournir une transduction généralisée des neurones néocorticaux chez les souris adultes et préserver le tissu cérébral pour les enregistrements optiques ou électrophysiologiques ultérieurs de l’activité neuronale. Cette méthode a non seulement assuré une transduction généralisée des neurones dans les couches néocorticales superficielles, mais a également entraîné l’expression du transgène dans une grande population de neurones pyramidaux de couche cinq avec une spécificité élevée, même en utilisant un promoteur non sélectif fort tel que le CAG.

Protocole

Les expériences ont été réalisées sur des souris adultes C57Black/6, âgées de 2 à 4 mois, des deux sexes (Centre d’élevage de Pushchino, branche de l’Institut de chimie bioorganique Shemyakin-Ovchinnikov de l’ASR). Les souris ont été logées dans un vivarium à température contrôlée (22 °C ± 2 °C, cycle lumière/obscurité de 12 h, lumières allumées à 08h00) avec de la nourriture et de l’eau à volonté. Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux directives ARRIVE et à la directive 2010/63/UE pour l’expérimentation animale. Le protocole d’étude a été approuvé par la Commission d’éthique de l’IHNA RAS (protocole N1 du 01.02.2022). Tous les efforts ont été déployés pour minimiser la souffrance animale et assurer la fiabilité des résultats.

1. Préparation à l’opération

1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux avant le début de la chirurgie. Nettoyez la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70 %.
2. Vérifiez le taux d’isoflurane dans le système d’anesthésie et remplissez-le si nécessaire. Placez une serviette en papier propre au fond de la chambre d’induction.
3. Placez un coussin chauffant sur le cadre stéréotaxique. Couvrez le tampon avec une serviette en papier propre.
4. Préparez une bouteille avec de l’eau de Javel à 2 % pour recueillir les pointes de micropipettes, les tubes, les cotons-tiges et autres articles qui entrent en contact avec le virus.
5. Retirez une aliquote d’AAV du congélateur à -80 °C et placez-la sur de la glace pour la décongeler.

2. Préparation de la seringue

1. Nettoyez une microseringue Hamilton de 5 μL avec une aiguille RN émoussée de 33 G. Aspirez puis distribuez 70 % d’éthanol. Répétez 3 fois avec de l’éthanol frais. Rincez la seringue à l’eau distillée pour éliminer l’excès d’éthanol. Répétez l’opération 3 fois.
2. Sortez le piston et remplissez le baril d’huile de vaseline à travers la bride à l’aide d’une seringue à insuline. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la microseringue.
   REMARQUE : L’air emprisonné est compressible et affecte l’exactitude et la précision de la seringue.
3. Remettez le piston dans la microseringue et versez une goutte d’huile. Placez la seringue dans l’injecteur stéréotaxique de manière à ce que la balance soit visible pour surveiller le volume de solution distribué.

3. Préparation des souris à la chirurgie

1. Pesez une souris. Placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie reliée à l’isoflurane. Allumez le vaporisateur d’isoflurane réglé à 5 % et réglez le débit à 250 mL/min. Une profondeur d’anesthésie adéquate est atteinte en 5 à 7 min.
2. Pour vérifier le niveau chirurgical de l’anesthésie, vérifiez l’absence de fouet et de réflexe de retrait lors d’un pincement douloureux de la patte arrière, et l’absence de clignement des yeux au contact visuel.
3. Basculez la soupape de sortie du vaporisateur de la chambre d’induction au masque stéréotaxique. Réduire l’isoflurane à 1,8 %-2,0 % et régler le débit en fonction du poids de la souris (70-90 mL/min pour les souris pesant entre 25 et 35 g).
4. Retirez la souris de la chambre d’induction et placez-la dans l’appareil stéréotaxique sur un coussin chauffant (37 °C) pour éviter l’hypothermie pendant l’anesthésie chirurgicale. Placez les dents de devant dans la barre de dents, puis montez le masque animal.
5. Positionnez soigneusement l’animal sur les barres d’oreille. La position correcte de la tête dans l’appareil stéréotaxique permet un mouvement vertical mais pas latéral de la tête. Assurez-vous que le positionnement de l’animal ne cause pas de détresse. Surveillez attentivement la profondeur de l’anesthésie, la respiration de l’animal et la température corporelle tout au long de l’opération.
6. Rasez la tête des yeux jusqu’à l’arrière des oreilles. Nettoyez la surface rasée de la tête avec un tampon d’éthanol à 70 %, suivi d’un écouvillonnage avec une solution d’alcool à 5 % d’iode.
7. Appliquez un gel ophtalmique pour éviter le dessèchement des yeux. Appliquer une solution topique de lidocaïne à 4 % et de la dexaméthasone (0,02 mL à 4 mg/mL) par voie sous-cutanée pour prévenir la douleur liée à la chirurgie et réduire la réponse inflammatoire possible.
8. À l’aide d’une lame de scalpel stérile et de ciseaux, faites une incision de 4 à 5 mm de long le long de la ligne médiane de la tête pour ouvrir le cuir chevelu. Commencez par une petite incision entre les oreilles, puis élargissez-la à l’aide de ciseaux pour éviter d’endommager le crâne.
9. Frottez la surface du crâne avec une petite quantité de peroxyde d’hydrogène à 3 % pour visualiser les repères stéréotaxiques : bregma et lambda. Arrêtez immédiatement la réaction avec une solution saline NaCl à 0,9 %. Grattez les tissus sur le dessus du crâne avec un grattoir à os.
10. Montez l’injecteur motorisé pré-préparé avec la seringue Hamilton sur le bras stéréotaxique. Dirigez une source lumineuse chirurgicale sur le crâne exposé et focalisez le microscope sur le bregma.
11. En regardant à travers le microscope, manipulez le bras de l’appareil stéréotaxique pour centrer le haut de l’aiguille directement sur le bregma.
12. À l’aide de la pointe de l’aiguille, alignez le bregma et le lambda horizontalement, puis ramenez le bras vers le bregma et notez les coordonnées. Utilisez ces coordonnées bregma et les coordonnées de l’atlas de la région d’intérêt pour calculer les coordonnées relatives de la zone ciblée.
13. Déplacez l’aiguille vers la zone ciblée. Abaissez l’aiguille aux nouvelles coordonnées et marquez cette position. Sélectionnez le site de micro-injection virale à proximité de la zone cible tout en tenant compte de la propagation du virus.
    REMARQUE : Cela évitera d’endommager les tissus dans la région d’intérêt. Nous avons utilisé les coordonnées suivantes pour la région d’intérêt : AP-3.4, ML -2.0, et pour la micro-injection virale : AP-2.0, ML -1.4. Les coordonnées ci-dessus sont optimales si les neurones primaires du cortex visuel doivent être infectés.
14. Si possible, évitez les régions avec de gros vaisseaux sanguins. Sous un microscope chirurgical, un éclairage à lumière vive et froide et une immersion saline à 0,9 % de NaCl, de gros vaisseaux sanguins dans le crâne et à la surface du cerveau devraient devenir apparents.

4. Injection de virus

1. Prenez une fraise dentaire stérile (0,5 à 0,8 mm de diamètre). En observant la surface du crâne à l’aide du microscope chirurgical, percez une petite craniotomie manuellement (à la main) ou à l’aide d’une micro-perceuse. Veillez à ne pas exercer une pression excessive sur le crâne.
2. Écartez le bras pour éviter d’endommager l’aiguille de la microseringue lors du perçage de la craniotomie (trou). Appliquez une solution saline NaCl à 0,9 % et faites une pause par intermittence pour éviter de chauffer l’os et d’endommager la dure-mère. Utilisez de l’air sous pression pour souffler la poussière d’os.
   REMARQUE : Les types suivants de fraises dentaires en carbure conviennent : en forme de poire (de préférence), cylindre arrondi et ronde.
   1. Lorsque vous amincissez l’os avec la fraise, assurez-vous que l’amincissement est uniforme sur toute la circonférence. Cela facilitera l’ablation de l’os sans endommager la dure-mère. Pour ce faire, utilisez d’abord une fraise à pointe ronde, puis une fraise à pointe plate. Gardez la fraise perpendiculaire à l’os ; Sinon, un côté sera plus mince que l’autre.
      REMARQUE : De plus, plus la taille de la fraise est petite et plus la craniotomie effectuée est petite, plus la manipulation sera complexe. Il est recommandé d’effectuer une craniotomie de plus petit diamètre (0,5-0,6 mm) lors de l’utilisation ultérieure de l’animal pour des travaux in vivo . Si vous prévoyez d’utiliser le cerveau de l’animal pour un travail ex vivo , un diamètre de craniotomie plus grand est acceptable pour simplifier la procédure.
3. Lorsque l’os aminci est mou et transparent, arrêtez de percer. Lorsqu’une indentation suffisamment grande se forme dans l’os, arrêtez fréquemment la rotation et surveillez l’épaisseur de l’os. L’apparition de fissures dans l’os indique qu’un amincissement est suffisant.
4. Baignez le trou avec une solution saline stérile, puis retirez l’excédent de solution saline avec un coton-tige. Retirez la couche d’os restante à l’aide d’une aiguille de 27 G avec une pointe en forme de crochet et/ou à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine. Évitez d’endommager la dure-mère.
5. Couvrez la surface du crâne avec un morceau stérile d’essuie-tout imbibé de solution saline. Placez un morceau de film propre et transparent sur la surface du crâne de la souris au-dessus du papier.
6. Déplacez le bras stéréotaxique vers l’arrière et positionnez l’aiguille de la microseringue en place directement au-dessus du film. Distribuez l’excès d’huile jusqu’à ce qu’un volume de 2 μL soit atteint.
   REMARQUE : Le volume final de l’huile peut varier en fonction du volume de la micro-seringue. Nous avons utilisé une micro-seringue Hamilton de 5 μL 75-RN.
7. Pipeter un volume de virus égal au volume injecté + 2 μL sur un morceau de film transparent.
8. En regardant à travers le microscope chirurgical, abaissez le bras jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit au centre de la goutte du virus. Chargez le virus dans la microseringue à l’aide d’un injecteur motorisé. Jetez l’embout de la micropipette et le film transparent dans le flacon avec 2 % d’eau de Javel.
9. Retirez le papier imbibé de solution saline de la surface du crâne et séchez le crâne avec un coton-tige. Utilisez le bras stéréotaxique pour positionner l’aiguille au-dessus du site d’insertion.
10. Distribuez une goutte du virus pour vous assurer que l’aiguille n’est pas bouchée. Faites une petite fente dans la dure-mère à l’aide d’une aiguille de 30 G avec une pointe en forme de crochet.
    REMARQUE : Il est important de faire la plus petite fente possible dans la dure-mère, permettant à l’aiguille d’entrer sans laisser d’espace entre l’aiguille et la dure-mère, d’où le virus pourrait s’échapper.
11. Abaissez l’aiguille de la seringue jusqu’à la dure-mère et faites les calculs de profondeur appropriés. Estimez la profondeur corticale de l’insertion par rapport au point où l’aiguille a touché pour la première fois la surface du cortex.
12. Insérez lentement la pointe de l’aiguille dans le cortex jusqu’à une profondeur de 300 μm. Attendez 2-3 minutes pour permettre à la dure-mère d’adhérer à l’aiguille, puis rétractez lentement l’aiguille jusqu’à une profondeur de 200 μm. Attendez encore 2 à 3 minutes pour permettre au tissu cérébral de se stabiliser. L’aiguille tire la dure-mère vers le haut, créant ainsi un espace sous-dural propice à la propagation du virus.
    REMARQUE : Pour minimiser les dommages corticaux, utilisez une aiguille de 33 G ou des aiguilles G inférieures. Gardez à l’esprit que plus le diamètre intérieur de l’embout est petit, plus le risque de refoulement des tissus l’obstrue est élevé. Il est important d’utiliser une aiguille émoussée au lieu d’une aiguille biseautée, car une aiguille émoussée expulse une goutte plus contrôlée de solution virale.
    1. Si l’aiguille ne traverse pas la dure-mère lorsqu’elle est abaissée à 150-200 μm et qu’elle la plie au contraire, arrêtez de l’abaisser. Soulevez l’aiguille et faites une incision légèrement plus grande dans la dure-mère, puis essayez à nouveau d’abaisser l’aiguille.
    2. Si le liquide céphalo-rachidien commence à s’écouler activement de l’incision pendant que l’aiguille s’abaisse, attendez qu’il cesse de fuir ; Sinon, il est difficile de contrôler le passage de l’aiguille à travers la dure-mère. Épongez l’excès de liquide céphalo-rachidien avec une pointe de tissu. Une fois que le liquide cesse de couler, soulevez l’aiguille et réessayez.
13. Commencer l’injection de la suspension virale à un débit de 0,06 μL/min tout en surveillant le volume distribué. Injecter 1 μL de virus. Injectez le virus à une seule profondeur afin de ne pas briser le sceau entre l’aiguille et le tissu du cortex.
    1. Dépannage : Au début de l’injection, un reflux du virus vers la surface du cerveau peut se produire. Arrêtez l’injection, attendez 2-3 min, puis continuez l’injection du virus. Répétez ces actions (étapes) jusqu’à ce que le reflux du virus s’arrête. Le virus et les fluides céphalorachidiens colleront à l’aiguille et empêcheront le reflux.
    2. Une autre façon d’arrêter le reflux du virus est de mettre une petite quantité d’agarose à la surface du cortex. Il supprimera la pulsation du cortex et aidera également à sceller l’aiguille. Mais assurez-vous que la pipette n’est pas obstruée par l’agarose.
    3. Étant donné que l’aiguille peut ne pas traverser complètement la dure-mère lorsqu’elle est abaissée, mais seulement partiellement, un côté de l’aiguille peut ne pas être bien ajusté contre la dure-mère, ce qui peut provoquer un reflux du virus. Dans ce cas, retirez lentement l’aiguille du tissu et essayez de l’abaisser à nouveau.
14. Une fois la perfusion terminée, maintenez l’aiguille à l’endroit cible pendant 10 minutes supplémentaires. Cela permet au virus de se disperser loin du site d’injection. Rétractez lentement l’aiguille du cerveau pour empêcher le virus de revenir hors du conduit de l’aiguille.
15. Une fois le retrait de l’aiguille terminé, vérifiez qu’elle n’est pas obstruée en distribuant une petite goutte de virus. Fermez l’incision cutanée à l’aide de sutures résorbables ou non résorbables 5-0.

5. Soins postopératoires

1. Après avoir fermé l’incision, appliquez une pommade antibactérienne par voie topique. Injecter un mélange de solution saline (5 mL/kg) et de glucose à 5 % (5 mL/kg) par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation et faciliter la récupération après l’anesthésie. Injecter du kétoprofène par voie intramusculaire (2,5 mg/kg) pour réduire la douleur.
2. Placez l’animal dans une cage fraîche sur un coussin chauffant et surveillez-le jusqu’à ce qu’il se remette de l’anesthésie. Une fois que la souris est réactive, placez l’animal dans sa cage domestique.

6. Histologie

1. Au plus tôt 21 jours après l’injection du virus, anesthésier profondément les souris avec de l’isoflurane comme décrit à l’étape 3.
2. Faites une incision médiane (10 à 15 mm) le long de la région thoracique à l’aide de ciseaux étroits et exposez la cavité thoracique. Séparez soigneusement le diaphragme et ouvrez la poitrine à l’aide de ciseaux.
3. Insérez une aiguille 22G 1 1/2 dans le ventricule gauche et faites une incision dans l’oreillette droite avec des ciseaux. Perfuser avec 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pré-refroidie, suivie de 100 mL de formol tamponné à 10 % pré-refroidi.
4. Extrayez soigneusement l’intégralité du cerveau de la souris. Pour ce faire, faites une incision sagittale le long du centre du cuir chevelu à l’aide de ciseaux. Ensuite, retirez l’os crânien morceau par morceau à l’aide d’une pince à os à pointes plates en commençant à l’intersection des sutures sagittale et lambdoïde et en allant vers l’avant jusqu’à l’os nasal. Lorsque le cerveau est exposé, coupez à travers les bulbes olfactifs, relâchez le cerveau avec une spatule incurvée et déposez-le dans un tube de 50 ml contenant 10 % de formol tamponné.
5. Réparez le cerveau pendant la nuit. Montez le tissu cérébral sur une plate-forme métallique d’un Vibratome à l’aide d’un adhésif tissulaire. Coupez des sections frontales d’une épaisseur de 50 μm à l’aide de lames en acier au carbone.

7. Immunomarquage

1. Jour 1
   1. Lavez les tranches de cerveau 3 fois pendant 5 minutes chacune avec 1 PBS contenant 0,3 % de Triton X-100 (PBS-T). Incuber les sections dans du PBS-T pendant 20 min à température ambiante (RT).
   2. Bloquez la liaison non spécifique pendant 1 h à l’aide d’un tampon de blocage composé de 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) et de 0,3 % de Triton X-100 dans 1x PBS.
   3. Incuber les sections pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre la parvalbumine ou la calbindine dilués à 1:500 dans le tampon bloquant (5 % NGS et 0,3 % Triton X-100 dans 1x PBS).
2. Jour 2
   1. Lavez les sections 3 fois pendant 10 min dans PBS-T. Incuber dans l’obscurité pendant 2 h à RT avec des anticorps secondaires (anticorps secondaires anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546) dilués 1:500 dans le tampon de blocage (5 % NGS et 0,3 % Triton X-100 dans 1x PBS).
   2. Lavez les sections 3x pendant 5 min chacune dans 1x PBS. Transférez des tranches de cerveau sur des lames de verre à l’aide d’une brosse douce.
   3. Ajouter immédiatement 0,1 ml de produit de montage anti-évanouissement dans chaque section. Recouvrez les tranches d’une lamelle de 22 mm x 50 mm.
   4. Configurez le microscope confocal sur un grossissement de 20x ou 60x (A/1.4, huile). Utilisez des lasers de longueur d’onde de 488 nm et 594 nm pour acquérir des images multicanaux des régions cérébrales d’intérêt.

Résultats

Dans une série pilote d’expériences, nous avons utilisé la méthode d’injection intracorticale traditionnelle pour transduire la couche cinq neurones pyramidaux dans le néocortex de la souris par AAV2 portant le gène de la channelrhodopsine rapide (oChIEF) fusionné avec la protéine fluorescente EGFP sous le promoteur CaMKII. Conformément à la caractéristique de l’AAV2¹², nous avons obtenu une zone d’infection relativement petite, ne dép...

Discussion

Nous avons mis au point une nouvelle méthode pour transduire les neurones néocorticaux de souris en injectant une suspension de particules virales AAV2 dans l’espace sous-arachnoïdien du cerveau. Cela permet une distribution généralisée du virus, presque quatre fois supérieure au volume tissulaire infecté lorsque la même quantité de virus est injectée directement dans le parenchyme cérébral.

L’injection de vecteurs viraux directement dans le l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
10 µL Gastight Syringe Model 1701 RN (5 uL 75 RN Hamilton microsyringe)	Hamilton Company	Part/REF # 7634-01, Hamilton or cat no. HAM7634-01, Merck
33 G RN needle, point style 3	Hamilton Company	Part/REF # 7803-05, Hamilton
Binocular Microscope	Nikon or Micromed	Model MC-4 ZOOM
Cerna-based laser scanning confocal microscope	ThorLabs
Cold light source	RWD	Model 76312
Leica VT1000 S Vibrating blade microtome	Leica Biosystems	76001-014
Low-Flow Anesthesia System with starter kit	Kent Scientific Corporation	13-005-111 (Model SomnoSuite)
Mechanical Pipette 0.1 – 2.5 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000012
Mechanical Pipette 10 – 100 µL Eppendorf Research plus	Eppendorf	3123000047
Mice Shaver	RWD	Model CP-5200
Microdrill with drill bits (0.5 mm, round)	RWD	78001, 78040
or Desctop Digital Stereotaxic Instrument, Mouse anesthesia Mask, Mouse ear bars (60 Deg)	RWD	Models 68027, 68665, 68306
Pressurized air	KUDO
Single Channel Manual Pipette 0.5-10 µL	RAINN	17008649
Small Animal Stereotaxic Instrument	KOPF	Model 962
Stereotaxic Injector	Stoelting	10-000-004
Surgical Instruments (Tools)
30 G dental needle (Ni-pro)	Biodent Co. Ltd.		To slit the dura
Bone scraper	Fine Science Tools	10075-16
Dental bur	DRENDEL + ZWEILING		For craniotomy; Shape: pear shaped/round end cylinder/round; Tip Diameter: 0.55-0.8 mm diameter
Needle holder (Halsey Micro Needle Holder)	Fine Science Tools	12500-12
Polypropylene Surgical Suture or Surgical Suture Vicryl (5-0, absorbable)	Walter Products (Ethicon)	S139044 (W9442)
Scalpel handle (#3) with scalpel blades (#11)	Fine Science Tools	10003-12, 10011-00
Scissors (Extra Narrow Scissors)	Fine Science Tools	14088-10	to cut the skin
Scissors (Fine Scissors)	Fine Science Tools	14094-11	to cut suture
Surgical suture PROLENE (Polyproptlene)	Ethicon (Johnson & Johnson)
Tweezers (Forceps #5)	Fine Science Tools	11252-20
Tweezers (Polished Inox Forceps)	Fine Science Tools	11210-20
Disposables
1 mL insulin syringe	SITEKMED		To load vaseline oil into a microsyringe, to administer drugs
Cell Culture Plate	SPL Life Science
Cotton swabs
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-545E
Insulin syringe needle (27 G)	SITEKMED		To remove debries from a hole (craniotomy)
Lint-free wipes CLEANWIPER	NetLink
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Paper towels	Luscan
Parafilm	StatLab	STLPM996
Sterile Surgical Gloves	Dermagrip
Drugs/Chemicals (Reagents)
10% buffered formalin or 4% paraformaldehyde	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK
Alcohol solution of iodine (5%))	Renewal
Antibiotic ointment Baneocin (bacitracin + neomycin)	Sandoz		Antibacterial agent for external use
Aqua Polymount	Poly-sciences	18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (Ophthalmic gel)	BAUSCH+LOMB (Santen)
Carboxylate-Modified FluoSphere Microspheres (red)	Thermo Fisher Scientific	F-8801
Dexamethasone (4 mg/mL)	Ellara (KRKA)		Synthetic glucocorticoid
Distilled H2O
Ethanol (70%)
Flexoprofen 2.5% (Ketoprofen)	VIC		Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs)
Glucose solution 5%	Solopharm
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A-11010
Isoflurane	Karizoo
lidocaine solution (2 % / 4%)	Solopharm
Normal Goat Serum (NGS)	Abcam	ab7481
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Eco-servis
Rabbit Anti-Parvalbumin Antibody	Merck Millipore	AB15736
Rabbit Recombinant Monoclonal anti-Calbindin antibody	Abcam	ab108404
Saline (0.9% NaCl in H2O)	Solopharm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	50-178-1844
Vaseline oil	Genel